嗜肺军团菌多位点序列分型及脉冲场凝胶电泳分析

嗜肺军团菌多位点序列分型及脉冲场凝胶电泳 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 (少旷‖。 i’(一 ，，‘ j 广 1飞: f : 研究生签名:奔鼋’彩导师签章:I孙呻二级莩譬领导盖章:(‖ 。 年 月 臼 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名:(薪扩诱 导师酶??小呻， D I,年6只污Et Y1901559 目 录 OOOOOOO D„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 中文摘要„„„O 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 研究论文 嗜肺军团菌多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳分析 引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 第一部分嗜肺军团菌多位点序列分型 前 言„„„??„„„??„„„„??????????„„„„„„„„„„„„„????9 日U舌„„„一„„„„„„一一”一„„„„„„„„„„„„„一9 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 O OOD O„„„„„„„„„„„„„„??????1l 结果??????„„„„„„„??????6 OOOOOOOO„„„„„„„„„OOOOOB„„„„„„OODO oOQ Q„„„13 附图O OOOQO„„„„„„„„„00000 0„„„„„„„„„„„„19 附表„O 讨论„„„„„„„„“一„„„„„„“„„„„„„„„„”??24 小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26 第二部分 嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分析 前言????„„„„„„„??„„„„„„„„„„„„„„„„„„28月U舌“„„„„„„„一””“„„„“„“„一„„„„„„„„一28 OO O„„„„„„„„„„„„„„„28 材料与方法„„„„„„I*01D 结 果„„„????„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??32 附 图„„„„„„„„„??„„„„„„„„„„„„??„„„„??33 附表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„36 讨 论????„„„„„„????„??„„„„„??„„„„„„„„??„„„????38 小 结????„„„„„„„??????„„„„„??„??„„„„„„„„„„????39 OOOOOOO O„„„40 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„O 结 仑„„„??„??„„„„„„„„??????????„„„„„„„„??„„„„„??41 附勇 专„??????????????„„„„„„„??„„„„„„„„„„„„„„„„„??42 综述嗜肺军团菌分子分型研究进展„„„„„„„„„„„„„„48 ODOO o„„??„„„„„??„„„„„„„„„„??„??„„„„????56 致谓 „??????D 个人简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 中文摘要 嗜肺军团菌多位点序列分型及脉冲场 凝胶电泳分析 摘 要 目的:研究嗜肺军团菌菌株间的分子特征，对不同地区来源的嗜肺 军团菌进行分子分型研究，构建本地区SBT sequence(basedtyping 数 据库与DNA指纹图谱库，与国际SBT数据库比对，了解本地区与国内嗜 肺军团菌分子进化情况及亲缘关系，为研究本茵的生物进化和种群结构的 分析积累资料;于分析菌株之间的相关性，从而了解菌株的同源性，协助 追踪感染来源，还有助于识别散发病例的传染源，可对已确认的暴发疫情 进行传染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。 方法: 1嗜肺军团菌SBT基因分型 1(1 却，10000 1(2引物合成及PCR反应条件的优化:合成7对引物，分别为嗜肺军团 火温度范围为50?(60?的12个温度梯度，优化退火温度。 1:3将PCR产物纯化和测序:经毛细管电泳确定PCR扩增产物的纯度和 浓度后，送上海生工进行产物纯化和测序。 I(4测序结果校对和序列拼接及在线提交到EWGLI数据库:测序结果经 ST型。 集国内现有的嗜肺军团菌ST图谱，将结果用MEGA4(0(2软件制作嗜肺 军团菌种系进化树并进行分析。 2嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分析 2(1细菌的培养及浓度测定:取48h嗜肺军团菌的纯培养物加入到lml 中文摘要 细胞悬浮液中，调整壁桌之为4(0个麦氏单位。 2(2胶块包埋:将菌悬液与等量的1,SeskemGold:1,SDS混匀加入模具， 室温凝固制成胶块。 2(3胶块中细菌裂解:将胶块放入细胞裂解液中裂解2h，用纯水洗两次胶 块，每次lOmin，用TE洗四次胶块，每次15min。 2(5电泳:将小胶块放于梳子齿上，制备1,SeskemGold，设置电泳参数 进行电泳。 2(6图像获取 2(7电泳图像分析和结果聚类分析:所有菌株的PFGE图像用 4(O 数据库软件处理，读取数据后应用统一的 BioMumerics Version MarkerH9812进行校准后聚类分析。 结果: 1嗜肺军团菌SBT基因分型 1(1 ST型分布:有1株嗜肺军团菌属于一个新的序列型 ST ，有1株由 于neuA基因缺失未能分型，有1株ST345型国内没有报道，国际上有发 现，其余均为STl型。 1(2种系发生树分析:ST 未分型 与其他菌株的亲缘关系较远，与其他 菌株分属不同的种系，儿 ST 于同一个种系。其余32株菌均为STl型，是国内环境来源的嗜肺军团菌 优势菌株，且在我国长期流行。 2嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分析 2(1电泳结果:电泳后可得到8条左右大小为40kb,700kb的电泳条带; 2(2聚类分析结果:所有血清1型的菌株均聚类到一起，菌株间相似性系 数为60,100,;血清2(14型的菌株均聚类到一起，菌株间相似性系数为 80,100, 见表1 。同一血清型别的带型差别相对较小，说明石家庄地 区嗜肺军团菌基因组AscI酶切位点的遗传变异较小。 结论: 1 SBT分子分型方法重复性好，可以用于石家庄市嗜肺军团菌分子进化情 中文摘要 况及亲缘关系的分析。 2嗜肺军团菌的同源性分析可以用脉冲场凝胶电泳分型技术，且分型率较 高，可以用于疫情的爆发溯源。 关键词:嗜肺军团菌; SBT:PFGE 英文摘要 andPulsedFieldGel Sequence―based Typing of Analysis Legionella―pneumophila ABSTRACT researchthe molecular Objective:To characteristicsof between different the Legionella。pneumophila regions，constructing region andDNA SBT typing database thestrains fingerprint storehouse(Comparing between domesticand canknowthe international，we molecularevolution situationand for the ofthis genetic this relationshipstudy bacterium(By resem'chwealsocan accumulatedatafor evolutionand structure population of analysis Legionella―pneumophila( To thecorrelationbetween different analysis canlearnthe strains，we strains(Itcouldwetrack thesourcesof homology to help infection，also helps the sourceof send outcasesofthe identify infection，can outbreakhasbeen confirmedon the track，thus effectivelyprevent epidemichappening again( Methods: 1 SBT Legionella―pneumophilatyping 1(1DNA emulsifiedcoloniesin0(5mlsterile waterat extraction:Heating 100。Cfor8 r,min minutes，rapidcooling，10，000 centrifugal3min，take fluidastheinitialPCR DNA( supematant template 1(2 and PCR reaction Synthesisprimer optimize conditions: Synthesisprimer ofseven and 12 alleses，flaA，pilE，asd，mip，mompS，proA neuA(Setting of from50oCto gradientannealing 60?to temperaturerange optimize the annealingtemperature( 1(3 PCR and to Purifyingproducts sequencing:Send Shanghai ShengGong and aftersure a矗d purification concentration( sequencing products’purity 1(4 and Submit the result Check，Joining online:Checkingsequencingby Chromas Clustal1(81 and software，joiningby onlineto uploadingsequences the alleles corresponding numberandST type( 4 英文摘要 1(5Draw tree:After Clustal1(8 can 1，we speciesevolutionary by joinging obtain of7 make alleles，then fragments3424bp oining neighborojphylogenetic tree(Andtocollectthedomestic SBTdatabaseof existing eosinophiliclung bacteriaST resultMEGA4(0(2software with corps mapping，will production of treestrainsand eosinophiliclunglegionevolutionary analyzed( 2 field Legionella―pneumophilapulsegelelectrophoresisanalysis Bacteriacultureandconcentration 48h cultivation 2(1 determination:Add pure lml the of to cells mural Legionella-pneumophilasuspensionbuffer,adjust for4(0Mc desk Farland( and1,Seskem 2(2 bacteria and Gold: Embedding:Blendingsuspensionliquid tothe at ( I,SDS room mold，solidificationtemperature( block 2 2(3Bacteria the intocells bufferforhour(Wash lysis:Lysisglue lysis TEbuffer eachblobwithwater2 blobofl with four times，each Omin，wash each blobof1 5min( times，and with 1 2(4 cut:MakeabalanceAscI buffer5min Enzyme enzymes cut，then blocks4hin rubber( cutting enzyme 2(5 smallblobsonthecomb l, Electrophoresis:Send tooth，thenprepare SeskemGold(Set and parameters electrophoresis electrophoresis( 2(6 Image acquisition 2(7 andresults with Electrophoresis analysis:Deal imageanalysis clustering allPFGE with BioMumerics 4(0 databasesoftware，then images clustering afterust MarkerH9812( by analysisadj Results: 1 SBT Legionella―pneumophilatyping 1(1 ST distribution:1strain toanew type belong sequencety7pe ST ，1 straincannot duetolackofneuA once typing genes，ST345type reported abroadbutno areST1 domestic，others happen type( 1(2 tree:Thereisferther between evolutionary Species geneticrelationship other strainswhich toadifferent species，儿 ST notparting and belong 20094 close tothesame STnew and6 ST345 have species( kin，belong 5 英文摘要 our andexistfor TherestareST1 isthe strainin country type(It advantage time long ago( 2 field analysis Legionella―pneumophilapulse gelelectrophoresis between40kbto 2(1 results:Weabout8bandofthesize Electrophoresisget are13 PFGEafterAscI these 700kb(There cut(Amongtypes， type enzyme muchmorethanothersanditisthemain about type SJZLP0006 7strain is 28(0, 7,25 ( results:Alltheserum1 strainswere 2(2 clustering Clusteringanalysis type 4 coefficientis60,1 theserum2―1 OO,;all similarity type together，the coefficientis80, 100,(The strainswere clusteringtogether，thesilrfilarity that betweensamebloodserums difference was(relativelysmall， illustrate cutloci variationislesser( bacteria AscI enzyme genetic genome Conclusion: havea beusedin 1 SBT shijiazhuang goodrepeatability,can typing molecularevolutionsituationandrelated analysis( Legionella―pneumophila canbeusedon of 2Pulsefield homologyanalysis analysistechnology a classificationbeusedfor has rate，Cma higer Legionella―pneumophila(It outbreaks traceability( SBT:PFGE Keywords:Legionella-pneumophila; 6 研究论文 嗜肺军团菌多位点序列分型及脉冲场 凝胶电泳分析 引 言 自1976年美国费城暴发军团病以来，国际上又有多次暴发的报道。 其病原菌就是嗜肺军团茵。为此，欧洲各国联合成立了一个专门研究控制 军团菌污染的组织，为各国军团菌的检测和防治提供专业咨询和指导。 WHO也将其列入传报范围。它是非典型性肺炎的三大病原之一。该病有 很高的病死率，原因在于它的临床体征及其复杂难以确诊，而其亚急性感 染特征导致病人后期恶化极快，病人最后死于呼吸衰竭。 嗜肺军团菌是一种兼性细胞内致病菌。目前己知嗜肺军团菌有15个 血清型，其中血清I型在水环境中和集中空调冷却塔水中最常见。我国是 在1982年南京首次报道军团菌病，在多次的回顾性调查中，军团病的暴 发也不止一次。近十年，国内研究的领域多为各种生活水环境和自然水环 境，临床标本很少。2008年，石家庄首次从医院及宾馆集中空调冷却塔 水和冷凝水中检出嗜肺军团菌，自此，便开始了对此菌的更深入的研究。 细菌的分型技术对全球流行病学研究起着极为重要的作用，目前关于 嗜肺军团菌的分型方法主要有两大类:表型分型和分子分型。表型分型只 能了解最基本的分型信息，而新近发展起来的基于DNA水平的分子分型 在疫情的溯源及细菌群体进化研究中发挥着越来越重要的作用。 国内尚未见有对嗜肺军团菌进行SBT基因分型研究的报道，SBT分 型技术是基于全基因组测序的技术，通过序列比对构建系统发育图，进而 推断菌株间的系统发育关系，可以反映病原菌的群体和进化生物学。 脉冲场凝胶电泳技术在在国内被广泛应用于很多菌种的分子流行病 学研究中，但国内报道均为用Sill内切酶进行酶切，本研究优化了内切酶， 改用AscI内切酶进行酶切，可以更好的分离各种大小的DNA片段。此技 术能够用于分析菌株之间的相关性，从而了解菌株的同源性，协助追踪感 染来源，还有助于识别散发病例的传染源，可对已确认的暴发疫情进行传 染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。 SBT技术提供了大量宝贵的基因序列信息，必然会有更多的病原菌的 研究论又 一 一―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――一 一 基因数据库建立起来;而PulseNet建立的食源性疾病监测的国家分子分 型网络体系中脉冲场凝胶电泳分型技术与国际网络连接，也必然会成为实 验室采用此方法进行流行病学分析。以上两种分子分型方法在分子流行病 方面发挥越来越重要的作用。 研究论文 第一部分 嗜肺军团菌多位点序列分型 -^^(―J‘ 刖 舌 近年来，国内对中央空调冷凝塔水系统和自然水环境的军团菌污染状 况调查分析显示，中央空调冷凝塔是军团菌繁殖的主要场所【1】，近年来， 有关温泉水中军团菌引起散发病例的报道【2巧】，我国也曾发生过多次由 集 中空调冷却水冷热水管道引起的军团菌病病例的发生【5】，中央空调冷却塔 水系统是引起军团病的重要传染源。由于军团病病死率较高，因此，应引 起国内学者的高度关注。 基于测序的分型 sequence(based 点测序分型 池ST 原理，建立的以测序为基础的嗜肺军团菌流行病学 分型方法。目前EWGLI也制定了SBT标准操作程序和建立了军团菌SBT 分型数据库，军团菌SBT分型结果可以直接与数据库序列进行比对分析。 应用SBT Sequence(basedtyping 技术可以很好的掌握军团分子进化情 况及亲缘关系。 SBT操作简单，结果能快速得到并且便于不同实验室的比较，已经用于 多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快和成本的降低， 以及分析软件的发展，SBT逐渐成为细菌的常规分型方法【7，8】。国内还 未见 有对嗜肺军团菌做SBT分子分型的报道。 材料与方法 l实验菌株 1 O月检出，其中32株来自石家庄市各医院中央空调冷却塔水，3株来自 石家庄市公共场所中央空调冷却塔水 详见附表1 。标准菌株 ATCC33152 由中国疾病预防控制中心传染病所呼吸道室赠送。 研究论文 2实验仪器 PTC一200型PCR扩增仪 M(J(ResearchPCR公司，美国 ，xcel型全 5415D。 Centrifuge 3实验试剂及耗材 CYE琼脂基础及其添加剂 BCYE 、军团菌乳胶凝集试剂盒均购白英国 l、 、5× PrimeSTAR OXOID公司，dNTP 2(5mM 、DNA Polymerase 2(5U,la 1M DNASize Buffer均购自日本Takara公司，50―800bp 公司赠送，引物由大连宝生物公司合成，军团菌商业化分型血清购自于日 本生研。所有试剂均在有效期内使用。 4实验方法 团菌的序列号 ST 。 4(1嗜肺军团菌DNA的制备【9】 1(0版 进行。用一次性接种环挑取72h培养后的嗜肺军团菌单克隆加 8min，10000 制备好的模板(20?冻存备用。 4(2等位基因的PCR扩增 7个等位基因的扩增引物序列见附表2。 la l，dNTP 各 p pM 1u1(，DNA 1，上、下游引物 各10 2(5raM 4 Polymerase ， 2(5U, la u u ul。 l、 O(5l，模板4 l 100ng ，无菌纯水定容至50 ‘ 秒、72?延伸40秒，共进行35个循环;最后72?延伸1O分钟。 4(3 PCR扩增产物的回收、测序 u1 PCR反应结束后，取5PCR扩增产物上样至全自动毛细管电泳仪， 选取AM320程序进行电泳。经毛细管电泳后，由上海生工生物工程技术 服务技术有限公司进行DNA纯化和双向测序。 研究论文 4(4生物信息学分析 测序结果经Chromas软件对核苷酸测序结果进行校对 附图 用ContigExpress软件进行序列拼接 附图2 ，将拼接好的7个等 序列在线提交到嗜肺军团菌SBT分型数据库网站上 1 Genetics EvolutionaryAnalysis，分子进化遗传分析 软件做系统发生树 附 图6 。嗜肺军团菌SBT分型数据库是由欧洲军团菌感染控制工作组 株占35(84,，未知的占1(59,。本实验的引物、序列比对都来源于 SBT数据库。 4(5重复性试验 对同一株嗜肺军团菌进行多次提取基因组DNA，将每次的基因组 DNA进行PCR并将PCR产物电泳和测序，比较测序结果。对同一模板 DNA进行多次PCR并将PCR产物电泳和测序，比较测序结果的,致性。 结 果 1嗜肺军团菌PCR产物电泳 据库比对，得到这35株嗜肺军团菌的序列型 ST 见附表3 。 2 SBT分型结果 菌 20094―5 不分型外，其余33株菌的序列型均属于数据库中已有的 ST型。 研究论文 上有1个碱基发生错配 G(C ，但通过校对发现，单个碱基发生错配是 由于单个碱基测序读取错误造成的，已通过手工校正。 的neuA基因扩不出来外，其他均能得到很好的扩增产物且产物浓度和纯 度到测序要求。 3重复性试验结果 将同一株嗜肺军团菌不同批次提取的DNA进行PCR并将PCR产物 测序，测序结果一致性达100,。 将同一嗜肺军团菌的基因组DNA进行多次PCR并将PCR产物测序， 测序结果一致性达100,。 ( 4进化分析 MEGA4(0(2软件做种系发生树，结果 见附图8、附图9 。 研究论文 附 图 „„„ ,“ „„” „ „„ 寰哆茹。，烹:燕二:-一枷??:一m”，n Checkthe Chromassoftware Fig(1 sequenceby 。，t+ i盈 一一一 一 。 ;如?+*?::r，:。园五。盱。。 i o?，; o:i强国髓 : o i i函二Jt(om呵???”09m啊Wq l$oGeneralDesmiptioqn 03270265 A2 M”。‘。。 ;萄:]FlaalCl憎nll j c鼬702R6似2w13P四咖(岫„(。 ?„“”„7„“‘„一,„„。 五??彩。，jV五„，，藏廊:溯 Lny舯 刊。 „”卿触(麓]”i , i 80 90 loc 二lo 120 l30 ?o 47 ?趾甜黜蝴艘冒一 T T 703270266嶂2l伽 CTCTOGTGCAAGCTTCC^aaTTG0^QCGA^T1Cj?^CC^^^0C^TC^;TC;GT^iCGOCp 6C^T^^^^6C:TCT‘， 1 ?? T C0t,t嘧1铷 cTCTGGT6C^^GCTTCCAGGTTG6^GC6^ATC^^^CC^^ACC^TC^^TTTC^6T^TC66C^5C^T^^^^6CTTCT‘; ?―J ?: 5sdq2， 妮:2??,7,247 团, 躐黼溅麟辫鲤灞黼燃 software Fig(2 JoingingsequencebyContigExpress 研究论文 Fom SequenceEntry 是 ’拿!搴 Al ele Seq以enoe 强o?、b曾r ^j ZCA珧CCAAACCATCZ-J(TT flaA Resetsequence ’’考五 TC如Cr'ATCGGCAGCATAA(A。?31 V: :嵋CrTCrrCTArTC站TGG: ^; ATGc:CAe玎CATGTACm Reset TT甜GAAGZuZcTAGCC?AT pilE 0:!t 10 sequence 一 V G矗五AC五五 rCCGCGTTTACC CGC--,GTTGGTATTAGTCGT蔓 ::: asd A玎二L厶?I竹GGCGACr:ACC Resetsequence 8S口 20 ACirCTGT丁TCCGGGACTGG^， ^ TGCCG矗:77GGGG强GAAr (: Reset !丁TA五AAATC裔^GGC盯A6'O mipsequence T’;0 ATGTTAATCCGG酏GCA舀工v ^ A rGACAG了6AZCACrGGrT 崔 Reset f，0乍珏STGA工订TGCTAACTGG,AC21 mompSsequen(ce l v AjCTAC(A量CAACAAGTGGG ^ TATGAAAACGCCTAC工GGS ” Reseto帆 sequence ‘yc叠 ACGGCAAGCAAATGACCj曙4 TGGTGA丁GG_rGACACC矾G??p GATACTTCGGATGTSATTC^: neuA Reset sequence j，謦。崩 ATACTGTTATTGACCTT(CT(?11 I GT订AAGTTTCAGCAAATG’，; with Resetform ShowSTs similar l profilesI onlineandobtain7allesesnumber Fig(3 Uploadingjoined―sequence 驹礅嫩辨翩嘲哟蜘嘲嘲始粼鼬5豳固 Entereitheranal纠ic ors thealternatefieldwill type，and update( profilesequence Enterthe alletic and rebieve SequenceTyDe( completeprofilepress"Retrieve”toappropriate 堕―兰，旦蔓卫曼巴羔:堡一笠L羔:卫„羔 and A必cP瑚Ie press”Retn啪?r枷恍theap即明ale SequenceType 一Enter―the ;丝! number 7allesesnumberonlineandobtainST Fig(4 Uploading 研究论文 序列a:s 已对齐(分值:盯 fileto，lc(alnfile Convert*(txt Fig(5 麟攀誉黧鬻鬻鬻燮缨麓臻黪鬻鬻缨终篓鬟璧黧鬻鬻震鬻鬻臀瓷蕾懑 1”+ 一(，: :。 :( :: 。( q瞎日謦一肇固黼(:阿移妻。i睁弹魄哆之iI。(警萎粤j荟一鬻电粤 瞿，(一 Protein s删lTfamlatedSerence。I DNA 十什Pe JtIt卜卜ltlt tltltltlIzItI It t ftltltItIt卜1tfrItIrItI1t tltft|fr tItItItItI。1tftltl。I’l|I’l tlti 。I’’ 2006-ZJ一117 2009一Stt一123 眭莲饕鏊阻羹题_l鏊阴嬖鏊I髓l譬明鏊明?l鬟l髓l醒鬟髓H朋酣lI鬣鼍驵I量?囊匿髓-匪 2008-SJZ―13l’ 2005一SZ一101 2005-BJ一107 2009一SII一工24 2005-Bd??1n 7誊曩、臻?，g 2009-SH一12l ll量羹蘩啊鬟翼蠹一lF融攀拶冀攀矗―‘缸一,, “““―――曼囊髓l鬈?，。强o“j „ 2009―-ZH一122 一 200S―BJ-104 lII羹|蠢i霍UllIll置illlIIll,|剜 2006一ZJ一116 王997―6DS―126 2005一BJ―ii0 嘲黜鬟i燕黧薰 2005一G2一114 2008一SJZ―129t l髑躐憨j舞 箸惹裟警 2005―6Z-i12 ilRilliliB!【 : :， 2005一GZ一113 弩?，。。i。，，4。2?“„ l薯l拳il狂鏊i-l-l鏊li堑程|l_,|l 2007一GZ―llS 墓I霎翼萋明霉蓑鏊雕l ” ， 嚣曩鼙餮鐾II鐾饕鏊lll 2006一ZJ-i19 ;j ,c?17:‘‘，‘ ‘( „„„一1 , ;ite 1皇疗黼 „。、』( r越 „ :黔篇西两 勇并 ?;碱i霹西。f‘《。。。-址一 treeMEGA4(0(2 Draw Fig(6 neighbor-joiningby 15 研究论文 A01 A02 A03 AOd A05 A06 A07 A08 A09 硼帅m S00(O 700,0 ‘呻卫 一 5?m 柚? 300J一 抛I 椭?„,?? 1靳且 '帅丑„„ 钟再 ofN0(40 resultsofsevenalleses’SPCR product Fig(7 Electrophoresis strain A0 SizeMarker A02:flaA????PCR product 1"50-??800bp lE-??PCR A04:asd-??PCR product A03:pi product A06:mompS--PCRproduct A05:mip―PCRproduct A08"neuA-―PCR product A07:proA-??PCRproduct A09:blankcontr01 16 研究论文 ――――――――一 0(005 1 treeof from997??-2009in Fig(8 Phylogenetic Legionella??-pneumophila our country areChinesestrainsfromSBT strains，othersorigin database(( 水Sequencing 2008一SJZ-130木:J1 STnew 2008一SJZ一128水:20094-6 ST345 2008一SJZ-1 29木:20094-5 neuAgenemissing，notnamed 2008一SJZ一131水:others32 strainsof experimental 17 研究论文 ―――――――――――――――――――――――― ―――――――――――――――――――――――――一 ,j from of tree Radial Legionella―pneumophila figurephylogenetic Fig(9 inour 1997―2009 country fromSBTdatabase( strains Chinese are strains，othersorigin 水Sequencing new 2008-SJZ一130木:J1 ST 2008(SJZ(128":20094(6 ST345 named 2008一SJZ(1 missing，not 29":20094(5 neuAgene of strains 2 3l水:others3 2008(SJZ(1 experimental 研究论文 附 表 informationtable Table1 StrainsforSBT genetyping 19 研究论文 20 研究论文 盈o ?N一? ( 盈cl价, 口cI?跽 o?甘 口cl西n寸 盈cl寸6, C,，，寸 口cI口一卜 芑j嘭。忍 ug童口????H^I,-0《u 0《??卜Uoo v上兮i司u《Qioo疑60 IIuq《卅艿u 卜pH誓H-nou卜UquoU oo Do卜H《o广Io卜o《o-I?qU譬、 0II(u O-I?【，_。《U与UQ，HU卜Uo卜H聋(工UUu U《UUobqoU。_柙1quo卜:3广I u鸟、ooo《o卜UUqoJq《Un一驾冠: oo《(卜。卜卜。蚤H卜oU(H―jqH(一毽Uu ^‘,。hv嚣a?nbu哦缸窨_正 o(一譬，彝]，―、―、UBo卜星oU臼(一―鸳、UUoo 岛u屯??j??一一,-: u《由I】《?uoq: 《―q捌O由叫u。h( 甾,1日商 r ―q《巾《qb o曲一驾口aUh卜oUu卜。(qUUoo。(《o g、o 凹n uu哮萎u疑u受冠u算圆鲥刮到 工:础蜀引硎矧割 U《《垂(。卜 蔓雾已。vU卜一苫。自89上v8U^vo昌U。v譬墨。鲁U u睦司譬uIl捌d划矧d删蚓习卅锄础嘲j工 u二工Q、nouUoquUk驾匕要一划Uo卜 。立匕哥uo黾3uou疑r广I刚铡删 吲剑埘剑引矧引( U雹《(气啊Hb卜 n ?器u11(ICI oo墨_们01 口价一-9 , 刀 1―暑o―JLI c(2 仉n口I-N口口_