输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析研究（可编辑）

输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析研究（可编辑） 输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析研究 1 分类号:. 密级: 单位代码: 学 号:?‖篓办 博士学位论文 论文题目:输血前血液筛查中新型基因 突变及抗原分析的研究 作者 姓名学院 名 称专业 名称指导 教 师合作 导师 孙波医学院 免疫学 侯桂华 教授 年月日2 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 碱生 期: 型?: :丛 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:丝途 导师签名:3 山东大学博士学位论文 目录 中文摘要? 英文摘要? 符号 论文正文 序言? 第一部分输血前应用大规模筛查乙肝病毒的模式构建及应 用研究 实验材料和方法实验结果讨论? 第二部分 /献血者 血清学模式和病毒变 异分析 实验材料和方法实验结果讨论? 第三 部分 /献血者血抗原抗体确认与分析 实验材料和方法实验结果??4 山东大学博士学位论文 讨论? 第四部分.肝癌细胞表达及的调 控作用 实验材料和方法实验结果讨论? 全文小结全文创新点? 附图 表 参考文献致谢? 攻读博士学位期间发表学术论文情况? 攻读博士 学位期间参加科研课题情况? 外文论文 外文论文 文献综述? ?5 山东大学博士学位论 文 ........................................................................ ........................................................................ .....................................................................: ..........................................................................................:: :.................................................................................: .....................................................................: .......................................................................................:; ....................................................................................:;: :?/ .................................................................................:; .....................................................................:; ............................................................................... ........ .................................................................................... :/................................................................................. ..................................................................... .......................................................................................; ....................................................................................;: :................................................................................. .....................................................................;; .......................................................................................; ....................................................................................; ?6 山东大学博士学位论 文 .................................................................................... ........................................................................ ........................................................................... .................................................................................... ........................................................................... .................................................................. ....... ........................................................... .......................................................... ............................. ?7 山东大学博士学位论文 输血前血液筛查中新型基因突变及抗原分析的研究 研究生: 导师: 专业: 孙波 侯桂华教授 免疫学 中文摘要 研究背景及目的 输血是挽救人类生命的重要手段,输血前对血液进行一系列生物学筛查和 安全性评价,对保障安全用血和生命健康具有重要意义。目前我国输血前血液筛 查大多仍采用传统的酶联免疫吸附分析检测血液中的病原生物及其成 分。近年来随着检测试剂盒灵敏度的不断提高,经输血传播病原微生物的危险性 已经处于较低水平。然而,由于病毒感染者“窗口期献血、隐匿性感染现象与 病毒变异的存在,病毒反应性阳性献血者的漏检问题依然存在,输血或输注 血液制品仍有一定的传播病毒的残余风险,对接受输血者的生命安全造成极大危 害。因此探索新的血液筛查方法,采用更加敏感特异方法消除漏检,对于增强输 血及血液制品安全性具有重要的实际意义。 乙型肝炎是由感染乙型肝炎病毒引起的乙类传染病。我国是乙型肝 炎的高发区,一般人群感染率高达.%,携带率高达.%, 乙型肝炎病毒表面抗原阴性的隐匿性感染在我国普遍存在。感染可 引起肝硬化和肝癌,严重危害机体健康和生命安全。因此在输血前血液安全筛查 中,乙型肝炎抗原及核酸成分的检测就成为主要靶点。 利用检测是应用最早,开展最广的检测方法,但由于该技术 是利用酶催化底物显色的方法,灵敏度较低,操作误差大,易出现假反应性或假 非反 应性,给血液安全检测带来不确定性。目前我国地市级血站系统采用由双人 两次通过法检测的方法以减少误差,但实际上此方法仅仅是增加了检 测的次数,虽可减少操作者方面的实验误差,但不能避免因加样、洗板、变异系 数较大等引起的方法学上的固有误差。 近年来,核酸检测技术, 在输血前血液筛查中 8 山东大学博士学位论文 的应用受到高度关注。是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称,利用该 技术可在病毒感染后数天后即能检出标本中极微量的核酸,大大缩短“窗口期。 敏感性高,与传统的方法相比,虽然不能完全消除感染“窗口期”, 但由于病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,通过检测,能够明显减少隐匿 性感染和病毒变异株,最大限度地预防经输血传播病毒性疾病,因此,可使 经输血传播疾病的危险性降到最低,有望成为一种新型的血液筛查传染病的检测 技术。 隐匿性感染即血清阴性而?阳性的感染,表 现为病毒载量持续处于低水平复制状态。血液可以通过输血导致受血者感染 ,其感染率与各地区的感染率和基因型相关。阴性的隐匿性 感染在我国普遍存在,约有%的正常人或献血员为阴性的携带率者, 在单一抗阳性人群中有%%血清 阳性,是形成隐匿性乙肝病毒 感染的基础。 多种原因可能造成隐匿性感染,位于~的“’’表位是 的免疫优势表位,是当前检测的主要靶点,表位基因突变是导致 漏检是最主要原因之一。有报道一氨基酸突变可引起抗 原活性的明显改变。由于“”表位也是乙肝疫苗的主要保护性表位以及抗乙肝 免疫球蛋白的主要靶点, “表位突变可使现有乙肝疫苗及诊断试剂的灵敏度 下降,因此研 究“表位对应的 区基因序列具有特别重要的理论 和实际意义。 本课题以省级血液中心为研究基地,选择份无偿献血标本,采用、 基因突变检测和化学发光免疫技术对血液中乙型肝炎病毒的核酸和抗原、抗体联 合检测,并与传统的对比研究;对酶联免疫法检测阴性但检测 阳性的血清标本进行序列分析和抗体蛋白的确认与分型,探讨阴 性血清模式与 的关系,寻找窗口期和隐匿性感染者;对隐匿性 感染者病毒株基因变异进行分析,对病毒株的“力表位区域进行基因序列测定, 分析“一表位基因突变情况。 本论文旨在了解目前我国筛查体系下献血者隐匿性感染及 突变株流行状况,建立更为灵敏、准确、符合国际标准要求的输血前血液筛查新 模式,并根据筛查结果计算输血传播传染性疾病的残余风险。此外,本文还初步 9 山东大学博士学位论文 探讨了肝癌细胞/信号转导通路对细胞凋亡抑制蛋白变化的影 响,旨在为密切相关的肝癌诊断及治疗提供实验依据。 第一部分输血前应用大规模筛查乙肝病毒的模式构建及 应用研究 研究方法: .核酸检测实验室体系的构建:按照卫生部颁发的《临床基因扩增实验室管理 暂行办法》,建立标准核酸检验实验室,之后所有检测均在此实验室进行。 .不同采血点血液标本的汇集和处理:将不同采血点冷链运送来的标本信息录 入采供血及临床输血管理网络体系平台。样品处理:采用血清或抗凝血浆,离心 后,取上清用于核酸检测。收集的样品置保存,小时内进行检测。 .建立健全样品采集.预处理.保存.使用的标准化。标本离心后,经全自动 加样仪自动读取标本条码并加样,生成加样文件,发送至实验室服务器的 相应加 样数据目录下,由全自动酶免分析仪和核酸检测仪处理,将其检测结果相关数据 发送至实验室服务器的相应检测数据目录下,实验室信息管理系统将对 应的加样数据与检测结果相关数据进行处理后,生成每个标本相应检测项目的检 测结果释放至血站信息管理系统 ,。通过深孔板的同步留样,避免人工误差和传统辫血留样错误, 配以信息化的管理方式取代人工保存,保证血样检测结果的还原性。 .法检测相应的抗原或抗体:法采用双抗原夹心法或双抗体夹心 法检测相应的抗体或抗原。最后在/锄处测读吸光度值。按照试剂说明 书设立临界值。检测孔值大于临界值则为反应性,否则为非反应性。酶联免 疫法的操作严格按照使用说明书进行,其中核心抗体检测时用生理盐水作: 稀释。 .标准检测自动化流程建立:初期采用半自动化设备进行测试,探索出试 剂准备、样品核酸提取到检测的适宜条件,最后形成样品自动汇集、检测的标准 自动化流程。配套条码扫描,测试过程可全程监控。 .核酸测定:采用合并检测方式进行。选择阴性,测定阴 性、抗 阴性、抗 阴性的样品以及仅种试剂为阴性的 标本进行、和病原体核酸的检测。初筛检测方式为合并检测 10 山东大学博士学位论文 个混合。当合并检测汇集池样品中 、、任何项为反应性时,对该汇集池样品再进行拆分检测,挑选出对应的单份反应 性样品。合并检测方式同时需满足单份样品临床检测的敏感性要求。 .体系的方法学评价:采用卫生部临检中心及国际血筛标准品对检测结果 的有效性进行评估。当发现检测结果出现偏差时,立即停止试验,查明原因后再 继续进行,确保实验结果准确有效。 使用该体系对本中心近份样本进行连 续检测,有效评估实验整体的性能及稳定性。 .复检及确认:所有非反应性,反应性标本都将备份管寄送至中国 卫生部临检中心作 、和分项定量检测。并对献血者进 行随访,以观察是否为抗体检测窗口期标本。 .统计学处理 数据处理分析采用.软件进行方差分析,’检验来判断差 异的统计学意义,.具有显著性意义。 研究结果 .检测模式和流程的设计:构建了大规模筛查乙肝病毒的检测模式和 流程。 .检测的数据统计:份无偿献血的标本中,经筛查、 抗和抗./非反应性及仅种试剂为非反应性的标本共 份,经检测其中有例反应性标本,反应性检出率为.%。 .反应性标本定量检测:分项鉴别实验反应性率为.%/。 在我国经血传播疾病病毒酶免试剂阴性核酸试剂阳性献血者标本中,以为 主,不同于国外为主的流行模式。 .反应性标本病毒含量分布:例 反应性标本中病毒含量 /的标本例,占.%: /的标本例,占.%。 .检测单试剂反应分析: 例单试剂反应性样本中,使用中国产试剂 例,使用美国雅培公司试剂例;经确认反应性例,为美国雅培公 司试剂单试剂检出。 .血液筛查核酸检测系统指标:血液筛查核酸检测系统的单项检测灵敏度? %,单项检测特异性?%,单项检测检测下限是 /,单项检测下限检 出率?%。检测通量/例样本/每日。 山东大学博士学位论文 第二部分 一/的血清学模式和病毒变异分 析 研究方法 . 提取:使用 病毒核酸提取试剂盒提取血清标本中 病毒。 .扩增:扩增使用 高保真聚合酶在 梯 度扩增仪或 扩增仪上进行目的片段扩增。引物: : 从; : 从从;? ’;:’,扩增产物理论上 包含 ?和区基因。 反应体系中加入× 各. , , , ~,上述提取的模板 , . /. ,灭菌蒸馏水加至 。反应条件为‘预变 性 。?变性 ,?退火 ,?延 ,共个循环。? 。反 . 应体系: . . , .“, , , . . . ,。 , 。每轮均设阴阳性对照,以不同拷贝数 的标准质粒为阳性对照,敏感度为 /。产物取肛用%琼脂糖凝 胶电泳观察。 .产物纯化:使用缓冲液制作.%琼脂糖凝胶,然后对目的进行 琼脂糖凝胶电泳,载样液中加入 。对于扩增产物量大电泳条亮带 的标本扩增 体系后电泳,对于扩增产物量小的标本扩增“体系后电 泳,使用胶纯化试剂盒纯化扩增产物。 .测序:产物克隆,质粒抽提,使用 测序反应试剂盒在 型全自动测序仪上进行双向测序。 .基因分型和序列分析:对扩增阳性的产物进行序列测定和进化 分析, 确定所携的基因型。 .生物信息学软件处理:测序结果采用、生物信息学软件 进行分析处理。测得基因片段序列与各基因型参比序列用进行同 源列队, 比较分析基因突变情况。 山东大学博士学位论文 研究结果 . 例标本中有例标本扩增不佳,仅 ?/基因扩增结果: 有例标本产物电泳均可看到 的特异性条带。大部分标本扩增产 物量较小,特异性条带较弱。 .无偿献血者中隐匿性感染情况及基因型分析:例 阳性标 本和例隐匿性标本经巢式扩增阳性检测基因型,结果显示,基因 型在隐匿性中的比例.明显高于在阳性标本中的比例.%, .。 .隐匿性感染者表面抗原区基因突变分析:株基因型和株基因 型的区序列分析。有例在该区域内出现了基因序列点突变,其中 有例 为个碱基点突变,例发生个位点的碱基点突变。例基因型感 染者有例出现基因点突变,而另例基因型感染者中,例出现基 因突变株。 . 基因“决定簇内点突变分析:例 ?标本测序结 果表明“”决定簇内点突变较多,有例标本存在个位点处的“决 定簇内 碱基点突变,主要以突变多见。 第三部分 /献血者血液抗原抗体确认的研究 研究方法 . /献血者随访策略和随访流程的设计和建立 .标本采集及处理 .法检测抗体和抗原。 .检测 .统计学处理 研究结果 /献血者随访策略和随访流程的设计和建立。 . .一献血者随访:对名一,献血者立 即进行随访,追踪成功人人次。乙型肝炎病毒表面抗原转阳的有人; 核酸转阴的人;乙型肝炎病毒表面抗原未转阳但核酸仍为反应性的人。 .无偿献血者中窗口期标本追踪检测概况 一/献血者抗体确认。对将人份核酸检测阳性血液标 . 山东大学博士学位论文 本进行乙肝“两对半’’检测,结果显示,其中有人阳性,阳性 人、阳性人,单阳性人。 .抗.的表达与乙型肝炎隐匿性感染的关联研究:抗.与隐匿性感 染有一定的相关性,抗.不仅可以作为既往感染的标志,也可以提示隐 匿性感染的可能。 第四部分 肝癌细胞表达及的调控作用 研究方法 .细胞培养:培养肝癌细胞系,培养基为含有%小牛血清的 培养基。每?天传代一次。根据文献及预实验结果对将培养的细胞 进行不同浓度,不同时间的或处理。 .细胞处理:将对数生长期细胞 /,接种于培养瓶,待达到%融合 时换成无血清培养液孵育过夜,使细胞同步化,然后按时间点和 浓度点分 组施加因素。 . 分析:将样品加适量样品悬浮缓冲液后,超声破碎,离心取上 清, 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用%电泳后,将凝胶中的蛋白转 移至硝酸纤维素膜。加入一抗 进行 。最后定影、 显影,分析结果。 .检测细胞中的表达。 提取细胞总,设计特异性引物,,产物经%凝胶电泳, 凝胶成像仪观察结果并拍照。 .细胞周期分析:收集消化的贴壁细胞,加入%冷乙醇固定, 染色,用流式细胞仪进行测定荧光强度。分析软件进行细胞周期 含量分析。 .统计学处理 研究结果 .经处理后肝癌细胞活性变化 .经处理后肝癌细胞 表达的变化 .抑制剂对诱导肝癌细胞 表达的影响。 .对肝癌细胞凋亡和增殖的影响 山东大学博士学位论文 研究结论: .在输血前乙型肝炎病毒的血液筛查中,采用技术对血液标本进行初检, 技术进行复检的模式,能够对标本进行精确的定性检测,对窗口期的标本和 隐匿性肝炎标本具有更强的检出率。 .目前常规血液筛查中检测为阴性的合格血液,仍然存在着窗口期漏检 和隐匿性乙肝感染,以隐匿性乙肝为主,病毒株多为型,且存在着变异株, 型病毒株较少,但突变株较高,突变株可逃避现有的诊断试剂的筛查。 .抗一与隐匿性感染有一定的相关性,抗一不仅可以作为既往感 染的标志,也可以提示隐匿性感染的可能。在不具备开展核酸检测的地区, 可以开展抗一检测,以降低输血风险。 .通过依赖/途径调节肝癌细胞的转录活性,促进其表 达,进而抑制肝癌细胞凋亡,/抑制剂可抑制该作用,并导 致表达的下调。 创新点 、以省级血液中心为基础,选择例大样本,对现有血液筛查模式下 及对血液筛查的应用价值和输血残余风险进行对比研究。 、成功构建以核酸检测技术组合酶联免疫筛查技术的输血前经血传播病毒性疾 病的检测模式来取代目前单一免疫学检测模式,显著降低经血传播疾病的风险。 、首次研究了本地区感染者基因类型的分布和变异株的基因序列。丰 富了国内基因型分布的数据,为乙肝疫苗研制和乙肝诊断试剂的改进提供 实验基础和理论依据,具有重要意义。 、抗.与隐匿性感染有一定的相关性,抗.不仅可以作为既往 感染的标志,也可以提示隐匿性感染的可能,在不具备开展核酸检测的地 区,开展抗.检测可降低经血传播疾病的风险。 .首次证实刺激.细胞后,通过依赖/途径调节 的转录活性,促进其表达,进而抑制肝癌细胞凋亡。 关键词: 输血前血液筛查模式;乙型肝炎病毒;核酸检测技术;基因突变; 隐匿性感染 山东大学博士学位论文 :. : : . . , ,. . ? ,, , ., .., , , . . , ,%%.. ., . ,山东大学博士学位论文 、, , . , , , , ‘ .. , , . , . . , . 、? , ” 嘀 ?. ” ”, . ., ,.. 、?廿 , 、析.% ., %?%, . .”” 甜 ~ . 山东大学博士学位论文 . ?’’ ? . ?? ,, ’?’,’’ . ,, ,, . 瑙, 、析 ,. ., ?? , ”?. ,也 ,,. , / , . 山东大学博士学位论文 . :? ”, . . 鞭舯?, . :.. , .?? . ,, , .、, . . : /. ..监. .谢 ,:、析 . : “’ .圮 . . ,山东大学博士学位论文 .: . , , 、析. . , ,, , ,; . . . : . , ,. , . . :?, , . . ..: , ’,. .. :. .: , /, ,;,,.%. 山东大学博士学位论文 . :.% /. ,.驴 ..: / , , .%. / .%;~ , .:?, , ; .. ., ? ; :.%, %, /.%./. : . .::; . : ;?: 不,. ;: . 山东大学博士学位论文 矿 , . ,肛, , , . /山.山, .? .。,? ? ? . , .. . :× .山, , .山, , . ., , .肛., , /. “ % . . , : .% , ., 山, . , 山 . . :, ..: : , . .: , , .、舫 .. ?/ : , , . ’山东大学博士学位论文 .. : , .% .%,.. .: . , , . , 埘 , . .’’’’ : ”’’ ’?’,黜. ,?/ ./.. .. . .山东大学博士学位论文 /’. .一// :” ’ , , , , . .. . . /.抢?: , .. , : % , .诵,. . :/ , % ? , 、访 , , . .: ,, ,. %? , . ,, , . . 一 . ?, ? , 山东大学博士学位论文 % . % . , :. ”. . .. . 一. .. .. .一. ,, . ,, , .. . . . , . . . / . 山东大学博士学位论文 ., .. : . . . , ,、析 . . ,, ,,, . . , /, . : , , . 山东大学博士学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文译名 谷丙转氨酶血站信息管理系统 碱性成纤维细胞生长因子 临界值 变异系数脱氧核糖核酸 ’ 改良培养基 ’ 电化学发光免疫分析 ? .胺四乙酸二钾 酶联免疫吸附分析 ? 咂全自动酶免分析仪 成纤维细胞生长因子乙型肝炎病毒抗体 山东大学博士学位论文。 乙型肝炎病毒抗体 ‘ 乙型肝炎病毒抗原。乙型肝炎病毒表面抗体 ’ 乙型肝炎病毒表面抗原‘ 乙型肝炎病毒’ 丙型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒凋亡抑制蛋白 底物酶 实验室信息管理系统 ? 丝裂原活化蛋白激酶 聚丙烯酰氨凝胶电泳磷酸盐缓冲液卜一 位磷脂酰肌醇依赖激酶 磷脂酶 ???? 磷脂酰肌醇激酶山东大学博士学位论文 输血前血液筛查中新型基因突变及抗原分析的研究 研究生: 孙波 导师: 侯桂华 专业: 免疫学 序 言 输血是现代医学中一种非常重要的治疗手段。输血能够维持血容量,防止 出血性休克,纠正因红细胞减少或其带氧能力降低所导致的急性缺氧症,补充各 种凝血因子。外科手术、新生儿溶血病的换血治疗、大面积烧伤的抢救等都需要 输血。血液是一种特殊宝贵资源,主要来源于人类的捐献,但是由于经血传播病 毒的存在,输血也具有一定的风险,因此对病人输注安全有效的血液,保障输血 安全具有重要意义。 多年来有关输血前的血液筛查,采供血机构一直存在着多种检验模式:如对 献血者体检后采血的初复检形式;直接采血后以不同供应商来源的试剂,不同操 作人员对血液重复进行两次检测的筛查形式等。目前采供血机构常用的酶联免疫 吸附分析. ,检测模式,是以检测血液 中相应病原体的抗原或抗体为基础,其准确性是通过统计学处理,计算出概率值 来显示。从概率角度出发,检测次数越多,结果越可靠,但实际工作中,不可能 对每份标本无限次筛查。免疫诊断试剂由于各生产商用于包被的抗原或抗 体片段以及生产工艺不统一,试剂质量不均一,易出现检测误差。因此在统一质 量标准前提下,选择两种试剂组合使用,有助于提高检测准确性。由于血 液筛查只涉及某些病毒抗原抗体的检测,并不能直接判定血液中是否存在某种病 毒,因此仅仅依靠检测病原体抗原或抗体在保证血液安全方面存在一定的 风险。 提高诊断试剂的灵敏性、特异性及改进血液筛查手段是提高血液筛查安全 性的首要途径。因此采用更灵敏、更特异的诊断试剂和检测方法,有助于解决目 前我国血液筛查过程中存在的诸多问题。 山东大学博士学位论文 核酸检测技术 ,能够直接检测病原体核酸,在 病毒感染后数天即可检出标本中极微量的核酸,大大缩短“窗口期。尽管 从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极 低,核酸检测技术还能检测出一些隐匿性乙肝和病毒变异株标本,可以有效地预 防经输血传播病毒性疾病。因此,采用核酸检测技术可使输血传播疾病的危险性 降到最低。 输血前血液筛查的模式是随着经济社会的发展而逐步改进,与公民对献血知 识的理解程度、政府行政规定等诸多因素有关。近年来随献血群体的显著改变, 既往血液学检测模式已经不适合中国的采供血现状,迫切需要一套适合中国国情 并与国际接轨的输血前血液筛查的模式。 目前我国血站实验室通常采用的血液检测模式和流程包括:.仅用试管标 本再检的血液检测模式。这一模式存在以下问题:不能发现由于标本留取错误, 造成错检,从而导致检测结果表面正确,实际却是错误的判定结论;存在将合格 血报废,将不合格血放行的风险;标本留取错误不易发现,不安全性极高;不能 正确排除由于交叉污染造成的假反应性检测结果,致使合格血液报废。.试管 标本与血辫标本平行再检的血液检测模式:这种方式存在以下几个问题: 使用血液标本自动处理设备,一般使用抗凝血液检测标本。检测标本过度稀释, 会造成血液检测结果偏离真值; 如果试管标本与血辫标本传染病标志物检 测结果出现一阳一阴现象,应具体问题具体分析,应考虑到相同血型之间的试管 标本发生了交叉颠倒差错。 目前我国现行的采供血机构可在很大程度保障血液的安全,但仍存在着一定 的风险。第一是人员素质、检测试剂、仪器设备的配置、标本留取等诸多因素有 可能导致漏检。但是通过严格的培训和规范,可以避免人为因素造成的漏检。第 二是检测技术限制。窗口期和隐匿性感染是造成漏检的主要原因之一,且难以避 免。第三是实验室血液检测模式和流程。血液检测模式和流程与血液检测结果的 最终判定密切相关,直接影响到血液的质量和安全。选择正确、合理、科学的血 液检测模式和流程可避免血液的错检和漏检。而如果血液检测模式和流程选择不 当,则可能造成错检,漏检等严重错误。 乙型肝炎是中国最严重的输血传播性疾病之一,其中以窗口期感染和隐匿性 感染最为常见。血清学检测非反应性的结果因其方法特异性和灵敏度问题 山东大学博士学位论文 不能排除这种病毒感染。隐匿性感染即血清阴性而 阳性的感染,表现为病毒载量持续处于低水平复制状态。可以通过输血 导致受血者感染,其感染率与各地区的感染率和基因型相关。我 国是乙 肝的高发区,阴性的隐匿性感染在我国普遍存在,约有%的正常人 或献血员为阴性的携带者,在单一抗阳性人群中有%一%血清 阳性,是形成隐匿性乙肝病毒感染的基础。多种原因可能造成隐匿性 感染,位于的“表位是的免疫优势表位,也是现有 检测试剂的主要靶点,其突变是导致试剂漏检是最主要原因之一。 多篇文献报道氨基酸突变能引起抗原活性的明显改变。由于 “表位同时也是乙肝疫苗的主要保护性表位以及乙肝免疫球蛋白的主要靶点, “表位突变株的流行可能会使现有乙肝疫苗及诊断试剂的灵敏度下降,因此 研究“”表位及其对应的区序列基因具有特别重要的意义。 乙肝病毒是导致肝癌的重要因素之一,肝癌是我国发病率和死亡率最高的 恶性肿瘤之一,因此研究导致肝癌增殖和信号调控机制,具有重要的理论意义。 多项研究表明,癌症是一种凋亡失控性疾病,是内源性血管生成抑制剂和促进剂 在肿瘤组织中局部浓度失平衡的结果,而最重要的血管生成促进剂是,其 作用机制尚不明确。是超家族中的重要成员,在体内分布广泛,参与 了胚胎发育、血管形成、肿瘤生长、细胞凋亡等多项生理及病理过程。肝癌细胞 也高表达和,并通过自分泌或旁分泌机制促进肝癌细胞的生长。 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有证据表明可与/的区域结合, 直接活化/的上游激酶,进而活化/。活化的从细胞浆转到 细胞核内,刺激与增殖有关的基因转录及蛋白质合成等,发挥其在细胞增殖调控 中的作用。 细胞凋亡是基因调控下的细胞自杀行为,细胞凋亡过程受凋亡促进因子 、等和凋亡抑制因子如、家族、等的共同调节。研究表 明,是迄今发现最强的凋亡抑制因子。直接作用于, 主要抑制、的活性,阻断细胞的凋亡过程。目前对 的研究多集中在其在肿瘤细胞中的表达,而对其信号传导通路的具体机制仍末清 楚。有报导的表达可能与介导的信号传导通路有关。由于在肿瘤 细胞和肿瘤血管生成中高表达,而其它正常细胞不表达,成为一个潜 山东大学博士学位论文 在的靶向对癌治疗,诱发或靶向这些蛋白的抑制可能被认为一个 潜在的抗血管生 成治疗策略。 综上所述,由于目前输血前血液筛查模式存在诸多问题,严重影响血液安全, 而血液仍然是其他物质不可替代的宝贵资源,如何最大程度保障血液的安全性已 成为迫切需要解决的问题。本研究以省级血液中心为研究平台,选择例大 样本,采用技术对无偿献血者血液中经血传播病原微生物乙型肝炎病毒进行 抗原、抗体和核酸的联合检测,并与传统的对比研究,旨在建立更为灵敏、 准确,符合国际标准要求的新型输血前血液筛查模式;并通过对酶联免疫分 析阴性而核酸检测阳性的标本进行随访追踪和基因突变测序研究,分析本地区 船基因类型的分布情况,为判断病情发展及预后,乙肝疫苗研制和诊断试剂的改 进提供实验及理论依据。本课题还通过刺激培养的人肝癌细胞株, 通过抑制剂阻断的信号转导通路,观察凋亡抑制蛋白 的变化。结果证实的表达依赖于/信号转导通路,从而为 的上游信号转导通路的研究奠定理论基础,并为密切相关的肝癌 的治疗提供新的策略。 山东人学博士学位论文 第一部分 输血前利用大规模筛查乙肝病毒的新型模式 的构建及应用研究 血液安全问题是全球广泛关注的焦点,目前血液筛检普遍应用技术, 尽管该技术的灵敏度和特异性不断提高,但每年仍有少数输血后肝炎的病例报 道。据报道美国经输血传播、和的危险性分别为:、: 和:。造成这些危险的主要原因是病毒感染者“窗口期”献血、隐 匿性感染和病毒变异等。 “窗口期”是指从病原感染开始,直至用某种检测 方法能够检测到该病原存在为止的一段时期。、抗一、抗一血清 学检测的“窗口期”分别为~天、天、天,。 删?一????一 同??叫?臼口~】一一 ~。』一 竺咿删 肭 ’柚?啊 :蕊 病毒急性感染抗原抗体进程慢性感染者抗原抗体进程 “窗口期”漏检是当前影响血液安全进一步提高的瓶颈,美国%以上经输 血传播和以及%以上经输血传播的危险性来自“窗口期”感染的 血液。因此在对献血者的血液病原筛选中,单纯靠抗原或抗体的血清学检测 山东大学博士学位论文 难以有效地保障血液安全。 核酸检测技术 是直接检测病原体核酸的一 , 系列技术的总称,其基本步骤包括核酸提取、扩增和检测。可在病毒感染后 数天即能检出标本中极微量的核酸,明显缩短“窗口期。初步研究表明,混合 血样检测可将、和感染的平均“窗口期”分别缩短天、天 和天,。此外还可以检出因上述其它种原因而漏检的被感染血液。 据报道法国应用从大约万份献血中筛检出份 反应性、抗体非 反应性的样本,其中份为隐匿性感染感染。因此,的引入可使输血传 播疾病的危险性降到最低。日本是世界上最早在全国范围内对血液进行、、 核酸筛检的国家;德国和荷兰从年起开始核酸筛检的尝试,; 年月美国批准将应用于常规血液筛检。中国自年起即有学 者对在国内血液筛查的应用做了初步探讨。 作为中国卫生部第一批核酸检测的试点单位,年月,本论文作者所 在血液中心开展了无偿献血者血液筛选的研究,以评估本地区血液筛查中采 用核酸检测的可行性和输血传染病残余风险,探索适合中国国情的核酸检测模 式,为在中国普及筛查血液奠定基础。初步研究结果表明,中国经血传染性 疾病核酸检测的结果与其他国家的结果有较大差异,具有一定特殊性,需要引起 高度关注并进行深入研究。 、实验材料 .试剂 .. 检测试剂上海科华生物股份有限公司和美国雅培生物 有限公司 ..抗一 检测试剂北京金豪公司和珠海丽珠试剂有限公司 ..抗/ 检测试剂法国伯乐公司和北京吉比爱公司 .. 试剂:乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒型 核酸联合检测试剂罗氏诊断公司 .. 电化学发光分析试剂罗氏诊断公司 、实验仪器 山东大学博士学位论文 . 全自动加样仪 .全自动酶免分析系统瑞士 . 全自动核酸提取、扩增检测系统 . 全自动混样仪 .核酸提取仪 .核酸扩增检测仪罗氏诊断公司 .低速离心机公司 . 冰箱公司 . 全自动免疫电化学发光分析仪 、实验方法 .核酸检测实验室体系的构建:按照卫生部颁发的《临床基因扩增 实验室管理 暂行办法》规定,新建立一套标准的核酸检验实验室。所有核酸检测均在此实验 室进行。 .标本处理:年月 年月作者所在省血液中心采集的无偿献血 者血液标本共份。每位献血者采集血液管:支 ?真空抗 凝管分别用于和、血型的检测;支 带分离胶的真空抗 凝管无酶、无热源用于检测;‘支 带分离胶的?真空抗凝管无 酶、无热源用于标本保存。将不同采血点冷链运送来的标本信息录入采供血及 临床输血管理网络体系平台。所有血液标本采集后置~冰箱保存,采血后 内, ,室温,离心 分离出血浆,~?保存, 内完成核酸 检测。 .建立健全样品采集一预处理一保存一使用的标准化流程。标本离心后,经全自 动加样仪自动读取标本条码并加样,生成加样文件,发送至实验室服务器的相应 加样数据目录下,由全自动酶免分析仪和核酸检测仪处理,将其检测结果相关数 据发送至实验室服务器的相应检测数据目录下,将对应的加样数据与检测结 果相关数据进行处理后,生成每个标本相应检测项目的检测结果释放至。通 过深孔板的同步留样,避免了人工误差和传统辫血留样错误的风险,配以信息化 的管理方式取代人工保存,保证了血样检测结果的还原性。 . 法采用双抗原夹心法或双抗体夹心法检测相应的抗原或抗体。最后在 山东大学博士学位论文 /处测读吸光度值。按照试剂说明书设立临界值。检测孔值大于临界 值则为反应性,否则为非反应性。酶联免疫法的操作严格按照使用说明书进行, 其中核心抗体检测时用生理盐水作:稀释。 .标准检测自动化流程建立:初期采用半自动化设备进行测试,摸索检测 的适宜条件,最后形成样品自动汇集、检测的标准自动化流程。配套条码扫描, 测试过程可全程监控。 . 检测:采用合并检测方式进行,选择测定阴性、抗 阴性、抗 阴性的样品以及仅种试剂为阴性的标本进行三种病原 体核酸的检测。初筛检测方式为合并检测个样本混合。采用 全自动核酸提取、扩增检测系统对标本进行检测:每个一级混样池 包含个纳入核酸检测的无偿献血者标本,全自动混样仪加样;一级混样池标本 在全自动核酸提取仪中应用磁珠分离技术原理提取核酸,核酸扩增检测仪扩 增检测、、靶序列,在服务器 系统服务器 中自动判读结果。每批检测均设置个阴性质控和个阳性质控 //一卜/一卜/一,每个一级混样池均含内对照 ,。全自动核酸提取、扩增检测系统检出的反应性一级混样池拆分 为个组,组成该一级混样池的原始标本做单标本检测,单标本检测反应性判定 为反应性,单标本检测非反应性判定为非反应性。当合并检测汇集池样 、 、 品中 任何项为反应性时,对该汇集池样品再进 行拆分检测,挑选出对应的单份反应性样品。合并检测方式同时需满足单份样品 临床检测的敏感性要求。 . 体系的方法学评价:采用卫生部临检中心和国际血筛标准品对检测结果 的有效性进行评估。 .. / 的敏感性评价:使用公司的阳性系列标准品,范围为 /,作为标准模板进行敏感性试验。同时设无模板阴性对照。 ..实时定量方法的特异性评价:使用公司低值阳性单人份质控 品,低值阳性六人份混合质控品。对这些样品进行特异性试验,同时以制备的阳 性标准品作为阳性对照,并设无模板阴性对照。 ..实时定量方法的重复性评价:对制备的阳性标准品进行倍比稀释, /一 取个稀释度作为标准模板,范围为 /,分别进行批内重复 山东大学博士学位论文 和批间重复试验。每个重复分别设个复孔,并设无模板阴性对照。将扩增结果 获得的数据进行平均数、标准偏差以及变异系数等统计分析。当发现检测结果出 现偏差时,立即停止试验,查明原因后再继续进行。确保实验结果 准确有效。使 用该体系对本中心不少于份的临床样本进行连续检测,有效评估实验整体 的性能及稳定性,同时对检测全部非反应性的例样本进行进一步的 核酸检测。 .复检及确认:所有非反应性,反应性标本都将备份管寄送至中国 、 卫生部临检中心作 和 分项定量检测。并对献血者进 行随访,以观察是否为抗体检测窗口期标本。 .统计学处理 数据处理分析采用.软件进行方差分析,’检验来判断差异的 统计学意义,.具有显著性意义。 、实验结果 . 检测模式和流程的设计:构建了利用大规模筛查血液乙肝病毒核酸 的检测模式和流程,见图。 . 检测的数据统计:三联检测的反应性检出率,见表。 份无偿献血的标本中,经筛查、抗一和抗一一/无 反应性及仅种试剂为反应性的标本共份,经检测发现例反应性 标本,反应性检出率为.%。 因检测是对检测非反应性的标本进 行复检,基于安全输血的考虑,无论检测标本多少例,只要核酸检 测能够杜绝一 例经血传播疾病的发生,都具有重要意义,故未做与在反应性 检出率的统计学处理。 . 反应性标本定量检测: 将例检测反应性的标本寄送卫生部临检中心确认,其中例标本未 反应性, 检测到//;例标本溶血,无法进行实验;例为 见表。分项鉴别实验反应性率为.%/,检出的病毒均为,未 检测出 和 反应性。结果提示在我国经血传播疾病病毒酶免试剂 阴性核酸试剂阳性献血者标本中,以为主,与国外为主的流行模 式不同。 山东大学博士学位论文 . 反应性标本病毒含量分布 例 反应性标本中病毒含量 /的标本例,占.% /的标本例,占.%,结果见表。其构成比结果见图。 . 单试剂反应性结果确认 例单试剂阳性中,中国产试剂例,美国雅培公司试剂例;经 确认阳性例,为美国雅培公司试剂单试剂检出。例单试剂检测阳性中, 中国产试剂例,法国伯乐公司试剂例;经检测为例,为法国伯乐公司 试剂,结果见表。因伯乐公司试剂含抗原检测,而中国产试剂均为抗体检测, 因此造成国产试剂的例漏检。表明国产试剂灵敏度较高,但特异性比进口 试剂低。 国产试剂的假反应性率分析:份无偿献血的标本中,经筛查 为反应性的标本共份,反应性检出率为.%.双试剂反应性 份,单试剂反应性份。 由于方法学的限制,检测具有一定比例的假反应性。对于在 实验中单试剂检测反应性的份标本,都进行了初复检的双孔 复试的再检检测,有份再检为非反应性,份依旧单试剂反应性。见表。 根据结果统计其假反应性的比例.%,结果见图。 .系统指标符合情况: 检测体系的方法学评价结果 .. 检测体系的敏感性评价结果: 使用公司的阳性系列标准品,范围为 /一 /,作为标准模 由图结果可以看 板进行扩增试验,扩增结果如表所示,定性结果见图。 出:定性准确,能够准确定性不同梯度的标准。结果提示有较高的敏感 性,能够检出模板的浓度为 /。 .. 检测体系的特异性评价结果: 使用世界卫生组织输血服务合作中心的质控品进行检测。检测结果如图所 示。结果表明,阴性标准品、阳性标准品、阳性混合血浆、阳性血浆、 低拷贝标本,高拷贝标本,本系统均鉴定正确。该实验结果证明我们建立的关于 检测体系特异性良好。 .. 检测体系的重复评价结果: /、 以阴性标准品、 /的标准品为模板,分别进行次重复试验。 山东大学博士学位论文 结果如图.由图可以看出,高、低浓度和阴性标本的结果定性稳定性良 好。经过年的检测,其阴阳对照定性准确率为%。表明我们建立的检 测方法的重复性良好。该系统的检测结果符合美国血液筛查核酸检测系统的单项 检测灵敏度?%,单项检测特异性,单项检测检测下限是 /?,单 项检测下限检出率?%的要求。检测通量例样本/每日。 .讨论 目前,乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病是中国最严重的输血传播性感染性疾病。 多项研究证实仅依赖血清学检测、抗一、抗一非反应性的结果,不 能完全排除这三种病毒感染。有文献表明,美国以上输血传播和以 及%以上输血传播的危险性均来自“窗口期感染献血。近年来, 技术不断完善,使其在采供血常规应用成为可能,许多发达国家已实施常规、 、核酸检测。检测可将、和 检测的“窗口期 分别缩短%、%和,还可检测出因病毒变异、隐匿性感染、人工操作错误 等漏检的血液,可有效预防经输血传播疾病。研究报道表明,检测合 格的献血者中, 反应性率为.%.%, 反应性率为... .%;在暴露率%一,%的地区,献血者中有%一%为非反应性 感染者,而非反应性 反应性血%可导致输血后乙肝感染。 据报道,美国年血清学检测和的输血感染机率分别低于: 万和:万。技术的应用,使得和因“窗口期’’感染的机 率降低到:一万,极大地降低了经输血传播疾病的风险。 年之后,我国开始在检测合格基础上,着手研究的应用。 检测, 年,上海市血液中心对份无偿献血标本进行了/ 证实和的感染危险性已经:,基本接近发达国家水平。目 前关于 的研究较少,在北京、上海、深圳的研究报道中, 总计检测名合格献血者,未检出 反应性者。 关于检测方面,研究报道感染后个月平均 即可检测出 ,这是最早出现的感染标志,它早于抗、抗一和抗一的出现, 感染后最早 可检测出 。由于复制周期较长,所以 检测的“窗口期一与检测的。窗口期”相比,虽