【doc】猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

【doc】猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定 猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定 ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyVol32No.42002 制,半年内该猪场彻底扑灭了猪瘟.而另一施行超前免疫的规 模化猪场.至2000年3月仍有猪瘟流行 实践对比结果表明.该免疫程序是可行的,其临床免疫效果 与免疫抗体监测的结果相一致. 3和讨论 3.1对4,2,2头份及4,4,4头份猪瘟疫苗3次免疫的2组猪 抗体水平进行了追踪视I定,其抗体阳性率和平均抗体教价无显 着差异(P>0.05).至180日龄出栏时,抗体群体阳性率均在 80.0以上,平均抗体效价达1:8以上.该免疫程序在猪瘟流 行区使用,可使仔猪在整个生长育肥阶段维持较高的抗体水平 和群体阳性率,在断奶至50日龄阶段不留免疫空白.不同剂量 免疫的仔猪虽然免疫效果差异不显着,但第2组的抗体效价较 高.在生产中,可酌情确定免疫剂量,但最低不能低于4,2,2头 份,最高不能超过4,4,4头份.还可采用4,2,4头份的免疫剂 量.既可保证高效价的抗体水平又可节约2头份疫苗. 3.2该免疫程序在猪瘟流行期间应用能较快地控制疫情.明显 忧于超前免疫}该程序同时还在该地区的其他猪场和个体养猪 户中试用,均能有效地控制猪瘟的流行. 3.3目前国内推荐使用的仔猪免疫程序有3种:第1种是仔楮 断乳后甚至到65日龄一次性免疫2,4头份.以后至出栏时再 不免疫}第2种是20日龄首免2头份,6O日龄加强免疫2头份 或4头份;第3种是超前免疫(亦称乳前免疫,零时免疫),即仔 猪出生后注苗2头份,注苗2h后让其吃初乳近几年全国各 地对超前免疫进行了大量的研究,一致认为用该程序接种的猪 瘟弱毒抗原避开了母源抗体的干扰和中和,能使仔猪较早地产 生特异性抗体而发挥主动性免疫作用,尤其在猪瘟流行区使用 可有效地抵御病毒的侵袭.但也有^认为乳前一次性免疫难以 使仔猪的抗体保护水平维持至出栏1],多数猪场改为出生后 l,2h未吃初乳前注射2头份疫苗.至6O,7o日龄甚或30, 35日龄加强注射2头份或4头份疫苗..150日龄时抗体阳性 率可维持在90以上,可以保护至出栏.实践证明.以上3种 免疫程序,在猪瘟流行期间使用前2种不甚可靠,只有超前免疫 在猪瘟流行区适用,但也有超前免疫发生免疫失败的报道-,主 要原因是多数母猪在夜间分娩,饲养员和管理人员无法守候母 猪分娩注苗.致使部分仔猪已吃过初乳,而又照例进行乳前免 疫.往往导致部分仔猪的免疫失败.尤其是规模化猪场,由于产 仔母楮多,施行超前免疫对管理^员和饲养人员来说均难以准 确把握.而本研究制定的免疫程序,只要于母楮配种前免疫4 头份疫苗,仔猪在25日龄以前受高教价的母源抗体保护是不会 发病的,然后在25,40日龄时间厢15d进行2次基础免疫,60 日龄时加强免疫即可安全保护仔猪出栏该程序首免剂量必须 保证4头份以冲破部分母源抗体的干扰;第2敬免疫可产生免 疫应答反应,使免疫比较整齐,且能够产生多量的lgG抗体,此 次免疫比较重要,生产中如果忽略此次免疫,在猪瘟流行期间会 有部分仔猪在50日龄左右因抗体水平的下降而染病死亡;第3 次免疫可刺激机体产生高效价的IgG抗体,延长抗体的持续 期该程序虽然比超前免疫多用2,4头份疫苗,但实际上省 工,省力,可节约防疫工费,且易于操作不会出现漏洞,从而保证 了免疫效果,因而推荐在猪瘟流行区进一步推广应用. 参考文献: [1]何存利,胨祝三+谢琴.等.猪瘟乳前免疫及其抗体 [J].中国畜禽传染病,1998,20(3)t143. [2]朱建国.原泉水.集约化养猪场猪瘟免疫程序的研究[J]. 中国预防兽医,1990.2l(1);4043. [83吕宗吉,埭长春,余兴龙.等.我国猪瘟的流行病学现状分 析[J].中国预防兽医,2001,23(4):301. 猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定 祁贤,张婉华,叶向阳,朱永军 (上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106) 摘要:从上海某猪场发痛仔猪体内分离到1株病毒.谊毒株能在鸡胚成圩雏细胞,RK,Veto,BHK21,ST,PK15知胞 上增殖并产生细胞痛变.通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在BHK2l知胞上的TCI.为5ot*L10稀释液.靠 病毒能棱曲枉犬病毒(PRV)性血清中和.接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应.电镜观察可见直径110,1813 nm的典型疱疹病毒粒子用最病毒接种兔和仔精均出现典型的伪枉戈病癌状.袁明靠分离毒株为PRV. 关键词:猪伪狂戈病毒;分离鉴定;蚀斑试验;克隆 中图分类号:S852.659.1文献标识码:B文章编号:1000—6419(2002)04—0024—03 伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)I起 的一种高度接触性,急性传染病,以发热,脑脊髓炎为主要症状, 该病毒可引起各种家畜及野生动物发病,楮是该病原的传播者 收稿日期:2001-11-19 基金项目:上悔农蚕科技兴寰重点攻关项目(98-05—17) 作者简介:韩贤(1971一),男,山西省太同市人,助理研究员 硕士. 和自然宿主.临床表现为母猪流产,死产,产弱仔等繁殖障碍症, 新生仔猪发热,出现神经症状.死亡率较高].该病被国际兽疫 局列为二类传染病近几年殴美国家本病的发生有突然增加的 趋势,国内至今已有近2O个省(市)报道曾发生伪狂犬病上海 郊县某猪场1999年以来多次发生原因不明的母楮流产,死胎, 新生仔猪发病后3,6d大部分死亡剖检病死仔褚肾,脾肿 胀,并伴有出血点,脑组织水肿.从脑组织及内脏病料中分离出 1抹病毒,经鉴定确定为PRV. 中国兽医科技第32卷第4期2002年 1材料 1.1营养琼脂糖古20mL/L小牛血清,10g/L199营养液, 10g/L琼脂糖(pH7.4)及i0mL/L青霉索,链霉索(1000 IU/'mL). 1.2细胞鸡胚成纤维细胞,由本实验室自制;Veto,PK15, BHK2l,ST,Mare145,RK细胞为本实验室保存. 1.3PRV覆标准阳性血清PRV闽A株,PRV和猪瘟病毒 <HCV)阳性血清.购自中国兽医药品检察所}日本乙型脑炎病 毒(JEV),猪生殖与呼吸综舍征病毒(PRRSV)猪细小病毒 (PPV)及其阳性血清.由本实验室{6i备 1.4荧光抗体PRV,HCV,PPV,pRRSV和JEV荧光抗体, 由率实验室自{6i l_5MEM培养基古i00mL/'L犊牛血清的MEM粉末培养 基.购自GIBCO公司. 2方法 2.1病料赴理无菌采集肝,脾,肺,肾,琳巴结和脑组织.用 MEM培养液(古青霉紊链霉紊10001U/mL)制成l;l0的组 织悬液.冻融3状后.离心取上清涟,置--30?冰箱保存. 22动插接种将上述方法处理的组织悬灌接种健康青年兔 2只t2mL/,q,另用MEM液接种2只健康兔作为对照.每日 观察发病情况 23病毒分离将上述离心后的上清液经0.45m滤膜过滤 接种长满单层的BHK21细胞.接种前用Hanks液清洗细胞 单层1攻,37?吸附1.O,1.5h.加古20mL/L牛血清的 MEM维持液.每日观察细胞,盲传3代.待病变稳定,病变率 达8.%时收获,一2O?保存备用 2.4病毒增殖将分离出的病毒分鄹接种长满单层的鸡胚戚 纤维细胞,PK15,ST,Marcl~5,VeTO和RK细胞.逐日观察 病变 25电镜检查将分离毒冻融,离心,浓缩后负染.电镜观察 2.6病毒蚀斑纯化将文献[2]方法略加改进.BHK21在24 孔细胞板上长满单层后.用Hanks液洗涤2次.将分离毒l0 倍稀释,分作lO,l0.1O,.10,.10,,lO叫和lO7个稀 释度.每个稀释度接种4孔,每孔50L,37?吸附1h,将保温 于44?的营养琼脂糖加入孔中.凝固后37?倒置培养.每日 观察,待出现细胞病变时加入0.5mL/L中性红.用滴管挑选典 型蚀斑.重复克隆3欢. 2.7克隆株毒价鳓定采用96孔微量板在BHK21细胞上测 定,用Reed-Mueneh法计算TCIc 2.8攘酸型鉴定待BHK21细胞长满单层后,取4瓶加入 5一碘脱氧尿棱苷<IUDR,终浓度为,50#g/mL),另设4瓶细胞作 为对照.将100TCII~.的病毒液分别接种上述细胞,37?吸附 4ht换维持液-适时收毒.分别测定加IUDR细胞毒和对照细 胞毒的效价. 2.9抗原性洲定 2.91中和试验在96孔微量板上进行,采用周定病毒稀释 血清法. 2.9.2荧光抗体试验按文献E33所述方法进行.在用于细胞 培养的小管内放置玻片,待细胞形成单层后接种分离毒.48,72 h后取出玻片,用PBS轻轻洗绦单层,冷丙酮固定10min,滴加 PRV荧光抗体,置湿盒于37_c作用30min再用pBS漂诜.吹 干封片.荧光显微镜观察. 2.10致璃性 2.10.1接种家兔将细胞分离毒皮下接种成年兔2只.0.2 mL/只.同时用MEM液接种2只健康兔作对照. 2.10.2接种仔猪将细胞分离毒腹腔接种PRV阴性仔猪2 头?2mL/只,同时设未接种对Jl}{猪1头 3结果 3.1病毒分离死亡仔猪病料组织悬液接种BHK21细胞盲 传4代,观察到稳定的细胞病变(cPE).表现为细胞聚集,圆 缩,有台胞体形成,进而脱落.病料组织悬灌接种2只兔都出现 悸动,尖叫,由于发痒而啃畦注射部位等症状3d后死亡;对照 兔健康存括 3.2细胞痛变分离毒在鸡胚成纤维细胞,PK15,ST, Marc145,Vero和RK细胞上产生典型的CPE.病变特征与 BHK21细胞相似. 3.3电镜观察将接种48h的细胞培养物冻融3扶后.10000 r/rain离心25rain,击沉淀.取上清液负染.观察到直径uO, 180nm的病毒粒子.为典型的瘪疹病毒粒子. 3.'枉酸型当细胞培养液中加入1uDR后,接种的分离毒 TCIDs.为50LlO稀释液.而培养灌中未加1uDR.接种的分 离毒TCID为50FL10"稀释液.可见该分离毒可棱IunR 抑制.属DNA病毒. 3.5分离株TCID5.分离毒经3妖蚀斑克隆后.在BHK21细 胞上产生鞍为规律的细胞病变.一般在12h出现病变.24~36h 病变细胞可达80.在96孔细胞板上测定其毒价t该分离株 的TCI.为50L10稀释的病毒液,结果见表1. 寰1PRVS1株的II2I.测定 病毒棱细胞孔观察结果累计细胞孔数接种CPE阳性 稀释度CPE阳性CPE阴性CPE阳性CPE阴性总数宰() 10—50260Z6100 10一5021021l00 10一'50160l6100 10—50110l】l00 l0—4161786 10一2324633 10—050990 10—005014l40 l0一0050l9190 3.6分离毒的抗原性 3.6.1荧光抗体试验BHK2l细胞接种分离毒后l8,38h 取出玻片,用PRV闽A株荧光抗体染色,在脑浆内出现黄绿色 荧光;未接种的BHK21细胞没有见到荧光.用HCV,FPV, JEV,PRRSV四价荧光抗体染色接种分离毒的BHK21细胞同 样未见特异性荧光. 3.6.2血清中和试验将200TCI.的分离毒分别与2倍稀 ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyVo1.32No.42002 释的PRV闰A株阳性血清,PRRSV阳性血清,PPV阳性血清, JEV阳性血清和HCV阳性血清混台.37?作用1h后接种 BHK21细胞.结果分离毒能被PRV闰A株阳性血清抑制(血 清抗体效价为1:32),而不被PRRSV,PPV,HCV及JEv阳性 血清抑制.证实分离毒的抗原性与PRV闽A株一致: 3.7分离毒的致病性接种分离毒24h后兔开始出现症状, 表现惊悸,尖叫,奇痒.频繁用嘴啃碗接种部位,使接种部位出 血,被毛脱落.48h内衰竭死亡;对照组兔体温,食欲,精神正常. 仔猪接种分离毒后出现发抖,痉挛,呕吐,腹泻,运动失调等症 状.体温达42?,3d后试验组仔猪相继死亡,对照组仔猪体温, 食欲正常而健康存活 4讨论 41该猪场近几年多次发生母猪流产,死胎及新生仔猪死亡. 经调查母猪配种前都进行了猪瘟,猪细小病毒病,猪乙型脑炎和 猪生殖与呼吸综合征疫苗免疫接种.根据流行病学特点及临床 症状,怀疑为PRV感染从死亡猪体病料分离出的毒株经细胞 增殖,感染力测定,中和试验及荧光抗体试验等证实为PRV,并 命名为pRV-S1毒株.表明伪狂犬病已在上海地区流行.其危 害应引起业由人士足够重视. 4.2PRV为疱疹病毒科病毒.其宿主范围广.可在多种原代及 传代细胞上增殖PRV-S1可以在鸡胚成纤维细胞,ST,Vero, PK15,BHK21和Mare[45细胞上增殖,表明这些细胞具有针对 PRV的共同受体表位.为PRV增殖提供了更多的宿主细胞. S1株在这些细胞上的增殖规律是否相同,有待进一步 但PRV— 研究. . 3研究表明.试验动物中兔对PRV强毒最敏感.本试验用 病料和细胞分离毒接种兔,都出现了典型的伪狂犬病症状.因此 认为用病料直接接种兔是一种快蘧,准确的伪狂犬病诊断方法. 兔也可以作为判断PRV毒力强弱的标记动物. 4.42O世纪40年代我国首次在猫体发现PRV,8O年代以来, 猪伪狂犬病的暴发流行逐渐增多-.].伪狂犬病的流行给我国 养猪业造成了巨大的经济损失.同时给其他动物的养殖带来了 潜在的危胁.欧美一些发达国家通过伪狂犬病基因缺失疫苗已 在实施伪狂犬病根脒PRV研究近年来已成为我国兽医 科学研究的热点,并取得了重大进展].在加入WTO的新形 势下,必须加快伪狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研制.并制定相应 的伪狂犬病根除计划,以促进我国养猪业的健康发展和提高猪 肉产品的国际竞争力 参考文献: Eli蔡宝样.家畜传染病学[M].第3版.北京:中国农业出 版社,l998.116—118. [22教震.刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京科学出版 社,1997.323—437. [3]叶向阳,粟寿初,谱雪珠,等.应用荧光抗体技术检测猪细 小病毒抗原[J].上海农业.k98B.4(4):卜8. [4]童光志,陈焕春.伪狂犬病流行现状丑我国应采取的防制 [J].中国兽医.1999—19(1):1-2. Es]陈焕春.方六荣.何启盖.等.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分 离鉴定[J].畜牧兽医.1998.29(2):156一I61. E6]白新盛,卢景良.畜禽重大疫病生物技术防制研究[M]. 北京:中国农业科技出版社.1998.149—298. 地克珠利与中药联合应用对鸡球虫病的疗效试验 李蕴玉,李佩国,陈丽凤,张香斋,段玲欣 (河北职业技术师范学院.河北昌黎966600) 摘要:对中药与西药联台应用防治鸡球虫病的拉果进行丁试验研究.结果,地克珠 利05mg/kg一-中菇5.0g/kg和 地克珠利1.omgkg一中药s.0g/2十联合用药组的抗球虫指数(ACI)分剐为202.4 扣202.8,比单独使用地克球利或 中药分别提高了11.89,l2.1]和23.34,23.58.表明联台用药防治鸡球虫藉是增强药物 疗效,减少西药用量,延 长药物效用期的有效方击. 关键词:地克珠利;中药{联合用药;抗球虫指数}药垃 中图分类号:S852.723文献标识码:B文章编号:1001N6419(2002)04—0026—92 鸡球虫病是严重危害养鸡业的疾病之一,呈全球性流行. 目前.该病的防治仍"药物预防为主,用西药防治鸡球虫病,见 教快.疗教显着,但长期使用.虫体易产生耐药性.对雏鸡的毒副 作用亦较大,且可在肉,蛋中残留;应用中药制剂毒副作用小,无 残留,且有促进生长的优点?.但发病初期使用见效慢.治疗期 收稿日期:2002~51—18 基盒项目:河北省畜牧局(g86)和河北省教育厅(9902i5)资助项目 作者简介:李蕴玉(1963一),女.河北省乐亭县^.副教授,硕士 长不利于迅速控制病情.本试验采用地克璩剥与中药联合应 用的方法对人工感染柔嫩艾美球虫病鸡进行了药效试验. 1材料与方法 1.1球虫卵囊采取因球虫病死亡鸡的盲脑内窖物.用饱和盐 水漂浮法分离出柔嫩艾美球虫卵囊.孢子化后计数备用. 1.2试验药物中药:白头翁,苦参,地榆,乌梅,黄柏,黄芪,甘 草,青蒿,白茅根,当归按一定比例混匀后粉碎,过20耳筛备用 地克珠利:新昌国邦鲁药厂生产,批号99D81. i.3试验动物1日龄黄盘褐蛋公雏129只.购自河北职业技