荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征患者5、7、8号染色体异常及临床意义

荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征患者5、7、8号染色体异常及临床意义 荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征患者5、7、8号染色体异常及临床意义 ? 6?2007年1月第28卷第1期ChinJHemat0I,』塑型:! 荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征 患者5,7,8号染色体异常及临床意义 蔡宇秦尤文王椿杨隽颜式可 【摘要】目的用荧光原位杂交(FISH)技术分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者的染色体改 变及预后.方法用常规细胞遗传学分析和FISH法分析37例MDS患者8,5,7号染色体的异常变 化.用SPSS11.5统计软件,对患者的遗传学异常与疾病转归,预后之间关系进行相关性检验.结果 检出染色体异常21例(56.8%),其中复杂异常6例(16.2%),8号染色体异常9例(24.3%),一5/ 5q一异常2例(5.4%),一7/7q一异常2例(5.4%).平均随访12个月,1例失访,22例存活,14例死 亡,12例转变为急性白血病.复杂核型与MDS的急性白血病转化及死亡密切相关;8号染色体三体和 一 7/7q一与死亡相关.结论FISH能敏感地检测出小克隆的异常,应用多种探针并结合染色体检测 能较准确判断MDS患者的预后,异常核型比例高提示预后差. 【关键词】骨髓增生异常综合征;原位杂交,荧光;预后 Detnofcytogeneficabnormalitiesinvolvingchromosomes5.7and8inmyelodysplasticsyn dromes withfluorescenceinsituhybridizationanditsclinicalsignificanceC,Yu. QINYou—wen.WANG Chun,YangJuan,YANShi— ke.DepartmentofHematology,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedFirstPeo— pie'SHospital,Shanghai200080,China Correspondingauthor:WANGChun 【Abstract】 ObjectiveToidentifytheabnormalkaryotypesbyfluorescenceinsituhybridization (FISH)andexploreprognosticimplicationsinpatientswithmyelodysplasticsyndromes(MDS).Methods FISHwasusedtodetectthe~equenflyoccurringchromosomeabnormalities(一5/5q,+8,一 7/7q一)in37 MDScases.SPSS11.5softwareandcorrelationanalysiswereUSedtoanalyzetherelativityamongtheabnor. realchromosomes,theprognosisandthediseaseconversionin37MDSpatients.ResultsKaryotypeabnor- realitieswerefoundin21(56.8%)of37cases,amongwhich6(16.2%)werecomplexkaryotypes.9 (24.3%)+8,2(5.4%)一5/5q一,2(5.4%)一7/7q一.Inthemediantimeoffoliow— upof12months. 12Casestransformedintoacuteleukemia.ComplexkaryotypesweresignificantlyassociatedwiththeDoor prognosisandleukemiatransformation.+8and一7/7q— abnormalitieswerecorrelatedwiththedeath. CondnsionsFISHWasmoresensitivethanconventionalcytogeneticsfordetectingmini— clona1abnormalitv. TherealesomedifferencesinabnormalkaryotypesbetweenpatientsinChinaandtheWesterac0untries.Mu1. tiprobesusedincytogeneticdetectionsmaypredictthepatient'prognosismoreaccurately.Thehigherpro— portionofabnormalkaryotypesthepoorerprognosis. 【Keywords】Myelodysplasticsyndrome;Insituhybridization,fluorescence:Prognosis 骨髓增生异常综合征(MDS)是由一个异常造 血干细胞衍生的恶性克隆发展起来的克隆性疾病, 可出现不同的染色体异常,其中一些染色体异常类 型被认为是提示预后的独立因素之一.虽然常规细 胞遗传学分析在MDS中的应用越来越广泛,但克隆 性异常的检出率仍然较低,这可能与常规的细胞遗 传学检查对小克隆改变的敏感性不高及细胞分裂相 质量不佳有关.荧光原位杂交(FISH)技术是运用 作者单位:200080上海交通大学附属第一人民医院血液科 通信作者:王椿 ? 论着? 碱基互补配对的原则,以核酸探针来检测染色体上 相应序列的改变,不受染色体形态和细胞周期状态 的限制,可用于间期细胞.我们用FISH技术对 MDS中3种常见染色体异常进行检测,探讨MDS的 遗传学异常及其临床意义. 对象和方法 一 ,研究对象 2002年l2月至2005年3月初治及随访的37 例MDS患者.男21例,女16例;中位年龄60(17, 血液学杂志!生!旦箜垫鲞箜!塑』!』型7J!::1 83)岁.根据WHO进行疾病分型,难治性贫血 (RA)4例,环形铁粒幼细胞性难治性贫血(RAS)1 例.难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)16例,难治 性贫血伴多系增生异常(RCMD)14例,不能分类的 MDS(MDS.U)2例.对照组为同期住院缺铁性贫血 患者6例. 二,研究方法 1.常规细胞遗传学分析:无菌条件下抽取 MDS患者以及对照组患者骨髓5m1,注入含肝素的 20%NBCS.RPMI1640培养基中.采用直接法和24 , 48h短期培养法制备染色体标本,然后进行RHG 显带处理.按《人类细胞遗传学国际命名体制 (ISCN1995)》进行核型描述?.剩余骨髓细胞悬液 置一20?冰箱中保存备用. 2.FISH分析:取出一20?冰箱中保存的骨髓 细胞悬液,气干法滴片,玻片变性处理后,分别用 Vysis公司的3种探针,按照探针:去离子水:杂交 缓冲液1:2:7的比例配制探针混合液.?CEP8 探针:SpectrumGreen特异性地识别人类8号染色 体短臂1区1带第一亚带到长臂1区l带第一亚带 片段(1ocusD8Z2);?LSI5qEGRISO/D5$23SG探 针:SpectrumOrange识别人类5号染色体长臂3区 1带(LsIEGR!),SpectrumGreen识别人类5号染色 体短臂1区5带第二亚带(LSID5S721);?LSI D7S522/CEP7探针:SpectrumOrange识别人类7号 染色体长臂3区1带(LSID7S522),SpectrumGreen 识别CEP7.将探针混合液和玻片杂交,杂交后清 洗.用Axioplan2imaging荧光显微镜,在DAPI/ FITC/Cy5/TRITC滤色片激发下观察间期细胞的荧 光杂交信号.以患者单个荧光杂交信号的百分比大 于对照组x+3s作为克隆性异常的阳性标准,同时 观察中期分裂相荧光信号的显示情况,并应用Axio. vision软件经AxiocamcolorCCD采集图像. 三,统计学处理 应用SPSS11.5统计软件,对37例患者的遗传 学异常和疾病的转归,患者的生存期之间的关系作 相关性检验. 结果 一 ,常规细胞遗传学分析结果 (34.0%)检出异常核 37例MDS患者中l3例 型,其中7例(18.9%)出现单一8号染色体异常;4 例检出复杂异常,其中1例包括5号染色体异常 (一5),1例包括7号染色体异常(一7).另有1例 出现了核型演变(表1). 二,FISH分析 1.阳性标准的建立:观察6例贫血患者骨髓细 胞,计数600,1000个间期细胞. (1)CEP8探针:正常间期细胞可见2个绿色 荧光信号,对照组显示3个绿色荧光杂交信号的间 期细胞的百分比为(0.35?0.24)%,8号染色体三 体(+8)的阳性判断标准定为>1.07%. (2)LSI5qEGR1SO/D5s23SG(5q31)探针: 正常间期细胞可见2个红色荧光信号及2个绿色荧 光信号;对照组有2个绿色荧光信号和1个红色荧 光杂交信号的间期细胞的百分比为(5.16? 1.29)%,将5q一阳性判断标准定为>9.02%;对照 组有1个绿色荧光信号和1个红色荧光信号的问期 细胞的百分比为(1.864-0.86)%,将一5阳性判断 标准定为>4.44%;对照组有3个绿色荧光信号和 3个红色荧光杂交信号的间期细胞的百分比为 (1.074-0.25)%,将+5阳性判断标准定为> 1.83%. (3)LSID7S522/CEP7(7q31)探针:正常间期 细胞可见2个红色荧光信号及2个绿色荧光信号; 对照组有2个绿色荧光信号和1个红色荧光杂交信 号的间期细胞的百分比为(1.29?0.57)%,将7q一 阳性判断标准定为>3.00%;对照组有1个绿色荧 光信号和1个红色荧光杂交信号的间期细胞的百分 0.23)%,将一7阳性判断标准定为> 比为(0.32? 1.01%. 2.MDS患者骨髓细胞FISH分析结果 (1)8号染色体异常的检测:在检测的37例 MDS患者中,+8阳性病例从常规染色体核型分析 的7例(18.9%)升到了13例(35.1%)(表1);1 例(例14)常规细胞遗传学检查存在不包括+8的 复杂的核型异常,但是FISH均显示有+8的存在;1 例(例30)核型分析未见分裂相,FISH显示有+8; 余4例常规细胞遗传学分析正常.例33(图1)8号 染色体四体细胞占5.00%. (2)5号染色体异常的检测:在检测的34例 MDS患者中,5号染色体异常阳性率从常规染色体 核型分析的1例(2.9%)升到了4例(11.8%)(表 1).1例(例14,图2)显示5q一细胞占67.26%;1 例患者(例1)同时存在着5q一细胞和一5细胞,分 别占9.45%和4.98%;1例(例11,图3)核型分析 未见分裂相,但是FISH提示存在一5;1例(例2)在 首次染色体检查时正常,但3个月后复查无论常规 2007年1月第28卷第1期ChinJHematol 表137例MDS患者染色体分析和FISH检测结果 注:N:正常核型 细胞遗传学分析还是FISH分析均有异常,除检测 到+11外,FISH还检出+5,而未发现+8和+7,说 明该例不是三倍体而是仅仅克隆性的增加一条5号 染色体. (3)7号染色体异常的检测:在检测的36例 MDS患者中,7号染色体异常阳性率从常规染色体 核型分析的1例(2.8%)上升到了5例(13.9%) (表1),其中4例患者(例14,17,30,37)(图4)的 问期细胞中均显示有7q一细胞,占3.26%0, 10.00%,例l4还伴随着包括5号染色体在内的其 他异常;1例患者(例16)的间期细胞显示一7,占 23.0l%,同时该患者的常规细胞遗传学分析显示核 型为复杂异常. 综合上述3个探针及常规细胞遗传学分析结 果,37例MDS患者中共检出2l例(56.8%)染色体 异常,其中复杂异常6例(16.22%);单一5号染色 体?抽崛.冉4乜甍光惰的怍自H乜体件 娜胞 lsH2缘芭的营情lt色n毙圯信 7q3I觇 怍芹常2例(54%);一7染色体异常2倒 (54%1;一8弓染色怍铎常9倒(2432ch);" f『2例分gII存住20q和l7q部分缺戋: _二 ,预历5析 37倒患者中位随沂l21,J1.I例失访.22例仔 活,I2例转变为急性FI【『『L病,I4例死亡.其中3例蚝 于颅内出血,余ll例均于白m病按疾病演变 结果"盟6H内.6,l2个月,l2—24个月死亡例 数分组统计疾病转归的统汁学分析:复杂棱型异 常与VIDe;向急性帆病转化密玎]相跫(…0802. P(01),世挂单一5.7.8号染乜体异常与自血病 转化没有相芙性(r德分别勾08940.894.0236.P 2007年1月第28卷第1期ChinJHematol,January2007,Vol28,No.1 值均>0.05).+8细胞比例低于10%的4例患者 中1例死亡,而比例高于10%的5例患者中3例死 亡.复杂核型异常与死亡密切相关(r=0.936,P< 0.001);8,7号染色体异常和死亡之间的相关系数 分别为0.884和0.810(P<0.01),表明+8和一7/ 7q一和死亡相关;5,17,20号染色体异常与死亡之 间没有相关性. 讨论 FISH技术由于稳定性好,操作安全,便捷,空间 定位准确,不受分裂相的影响,所需样本量少,可分 析细胞数量大,一张玻片上可以使用多种荧光标记, 具有高度的敏感性和特异性,已逐渐成为研究肿瘤 遗传学的主要方法.我们的结果显示常规细胞遗传 学在MDS中的异常检出率仅为34.0%,而用FISH 的方法则将阳性率提高到了56.8%.8号,5号,7 号染色体异常的阳性率分别由18.9%,2.9%, 2.8%上升到了35.1%,11.8%,13.9%,提示间期 的FISH较常规的细胞遗传学分析敏感性高,能够 提高MDS患者异常核型的检出率,是常规细胞遗传 学检测的重要补充.Olney等报道,在MDS患者 中正常核型,+8,一5/5q一,一7/7q一,同时具有5 号和7号染色体异常,一Y,17p一,20q一,11q一分 另?占40%,10%,8%,8%,15%,7%,7%,4%,1%. 李建勇等刮先后报道了分别应用3种探针检测 MDS患者核型,+8占总例数的22.39%,5q一占总 例数的27.08%,一7/7q一占18.75%,但没有区分 单纯异常与复杂核型.我们同时应用3种探针结合 常规细胞遗传学检测37例MDS患者的结果显示正 常染色体占43.24%,一5/5q一占l1.8%,一7/7q一 占13.9%,与Olney等结果相似.但未观察到单 纯的5q一,与国外的报道不同,需要更多的病例证 实.本研究+8的比例占24.13%,与李建勇等的结 果相似,较国外Jenkins等报道的高,提示中国 MDS患者中+8更为常见. 1997年WHO制订了MDS的国际预后积分系 统(IPSS),参数包括骨髓原始细胞,血细胞减少系 列和染色体核型三组.核型分析的临床意义越来越 显着.国内目前均借鉴这一积分系统,但缺乏相应 的预后分析资料.我们对37例MDS患者的细胞遗 传学结果与预后关系进行了初步分析.6例复杂核 型异常患者的形态学诊断有5例为REAB,1例为 RCMD,与WHO分类系统中复杂核型百分比RA< RCMD<RAEB的结论相符,也进一步说明RAEB患 者的预后差.统计分析表明,复杂的核型异常与患 者向急性白血病转化和死亡均有密切关系.这与 IPSS积分系统的结果相符.临床上,如果不结合核 型或不用多种探针就不能准确地评估MDS患者的 预后. WHO将5q一综合征单独作为一个亚型,因为 它提示较好的预后.本组37例MDS患者中无一例 单独的5q一综合征,仅有1例复杂异常伴有5q一, 该例随访36个月后仍然存活.值得注意的是例2 在随访中(3个月后)出现了新的核型异常.在常规 细胞遗传学分析显示的+11异常外还存在小克隆 的+5,提示遗传学出现变化,该例6个月后死于急 性白血病,这表明FISH能敏感地检出小克隆的核 型异常,对于疾病的发展和转归有早期发现和预测 的作用.虽然本研究中我们未观察到7,8号染色体 异常与白血病转化之间的关系,但两者均与MDS患 者的死亡有关,说明它们均提示预后不良.在IPSS 中+8被划分在中危组,丘镜滢等对国内42例 +8的患者随访18个月,40%的患者进展为急性白 血病,中位总生存期为20个月.另外,我们还观察 到+8细胞低于10%的4例患者中1例死亡,而高 于10%的5例患者中3例死亡.可能提示异常核 型的比例与预后有关,比例高的患者预后差,这点尚 需扩大样本量进一步验证. 参考文献 1秦尤文,蔡宇,王椿,等.骨髓增生异常综合征的遗传学研究.诊断 学理论与实践,2005,4:371—374. 2OlneyHJ,leBeauMM.Thecytogeneticsofmyelodysplasticsyn— dromes.BestPractResClinHaematol,2001,14:479495, 3李建勇,潘金兰,薛永权,等,间期荧光杂交检测骨髓增生异常综 合征8号染色体三体,中华血液学杂志,2000,21:179—188, 4申咏梅,薛永权,李建勇,等.间期荧光杂交检测骨髓增生异常综 合征一5/5q一染色体异常.中华血液学杂志,2001,22:517-519. 5申咏梅,薛永权,李建勇,等.骨髓增生异常综合征的一7/7q一染 色体异常的检测.中华医学遗传学杂志,2001,18:258-259. 6JenkinsRB,BeauMM,KrakerWJ,eta1.Fluorescenceinsituhy— bridization:asensitivemethodfortrisomy8detectioninbonemalTow specimens.Blood.1992.79:3307—3315. 7邱镜滢,张艳,陆道培,等.骨髓增生异常综合征中的亚急性髓性 白血病临床与细胞遗传学研究.中华内科杂志,2005,44:407— 4l0. (收稿13期:2006-04-21)