聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究

聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究 聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株 生物多样性研究 45卷6期 2005年12月 微生物 ActaMicrobiologicaSinica Vo1.45No.6 December2oo5 聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究 徐平李文均H高慧英徐丽华姜成林 (云南大学云南省微生物所教育部微生物资源开放研究重点实验室和云南省生物资源保护与利用重点实验室昆明650091) (华北制药集团新药中心石家庄050015) 摘要:从中国云南省采集土样,采用GPY培养基,淀粉一酪素琼脂培养基和甘油天门冬酰胺琼脂培养基分离得到 了876株细菌放线菌菌株.经聚酮类化合物基因筛选得到75株I型和?型聚酮类化合物生物合成基因双阳性的 菌株,经抗菌活性,形态,生理等结果分析比较,选取其中的1O株进行了16SrDNA序列分析.在物种多样性方面, 分离到的菌分布至少有7个科,8个属.其中有链霉菌科的链霉菌属,分枝杆菌科的分枝杆菌属,链孢囊菌科的链 孢囊菌属和野野村菌属,诺卡氏菌科的诺卡氏菌属,微球菌亚目的一新属,产碱杆菌科的无色杆菌属和8一亚纲中与 紫色杆菌属紧邻的一革兰氏阴性菌新属.综合其型,基因型特征,初步确定其中8株为新物种.研究表明利用 新的思路和程序从自然环境分离,鉴定未知菌是微生物资源开发利用的关键. 关键词:聚酮类化合物,基因筛选,放线菌,16SrDNA,生物多样性 中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:0001—6209(2005)06—0821—07 放线菌广泛分布于自然环境,是重要的资源微 生物.自20世纪40年代至今发现的12000余种微 生物来源的新活性物质中,70%以上是由放线菌产 生的.其中链霉菌(Streptomyces)是微生物来源的新 活性物质的最主要产生菌,其产生的新活性物质的 数量占微生物来源的新活性物质总数的55%以 上….但随着已经发现的新化合物数量的增加,从 链霉菌中重复发现化合物的机率逐渐增加,因而从 已进行过深入研究的链霉菌中分离到新的有用的次 级代谢产物的难度日益增加.自上世纪60年代后 期从小单孢菌中发现临床上重要的氨基糖苷类抗生 素——庆大霉素(Gentamicin)以来,放线菌中除链霉 菌以外的其它放线菌,即稀有放线菌的分离,筛选一 直是微生物来源的新活性物质筛选活动中微生物资 分子生态研究结果表明自然界中 源研究的热点. 存在着大量确实存在的未知(不能培养,未经鉴定) 微生物,已知的微生物数量还不到微生物总数的 1%.研究开发99%以上的未知微生物是微生物 资源开发利用的重要研究内容. 聚酮类化合物(PKS)是由聚酮类化合物生物合 成途径合成的化合物的总称.已知聚酮类化合物分 芳香环聚酮类化合物和非芳香环聚酮类化合物即大 环聚酮类化合物两种.这两类化合物分别由?型聚 酮合酶合成途径(PKSII)和I型聚酮合酶合成途径 (PKSI)合成.以雷帕霉素((Rapamycin),FK506, 阿维菌素(Avermectin)为代表的大环内酯类抗生素 是由PKSI途径合成的.而以四环素(Tetracycline) 为代表的四环类抗生素和以阿霉素(Doxorubicin),柔 红霉素(Daunorubicin)为代表的蒽环类抗生素均是由 PKSII途径合成的.由于生物合成途径中构件的改 变及其组合方式的千变万化,可形成的化合物的数 量极其庞大.结构的多样性导致了生物活性的多样 性.在至今上市的医药或农用抗生素结构中聚酮类 化合物来源的比例居已知六大类天然产物结构的首 位,具有重要的商业价值.这些抗生素几乎都是 由放线菌产生的.因此具有聚酮类化合物生物合成 基因的新颖的放线菌的分离,筛选和鉴定是新药筛 选领域函待探索的课. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1主要试剂和仪器:微波炉(TurBomicrowave OvenDMR一604),EBA12R高速冷冻离心机(Hettich), VortexGenie2涡漩振荡器,TGL-16C高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂),HW一8B型超级微量恒温器 (上海浦江分析仪器厂),电泳仪Mupid.2MiniGel 基金项目:国家"973项目"(2004CB719601);国家自然科学基金(30270004);云南省自然科学基金(2oo4C0002Q) '通讯作者.Tel:86—871—6231202;Fax:86—871—5173878;E-mail:wjli@ynu.edu.cn,liact@hotmail.Corn 作者简介:徐平(1969一),男,博士,高级工程师,主要从事微生物药物筛选工作.E-mail:xupingghy@yahoo.COrn.cn 收稿日期:2005—04—19,修回日期:2005—06—29 微生物ActaMicrobiologicaSinica MigrationTrough(CosmoBioCo.,Ltd,AdvanceCo., Ltd.).溶菌酶,蛋白酶K,20%SDS,酚/氯仿(V/V, 1/1),3mol/LNaAc(pH4.8),异丙醇,70%乙醇,1×TE Buffer(pH8.0).PCR所用引物由TaKaRa公司合 成.PCR仪是PE.9600型PCR仪.10×ExTaq buffer,dNTPMix(各2.5mmol/L),ExTaqDNA polymerase(5U/t~L),均购自TaKaRa公司. 1.1.2培养基:GPY培养基:每升含葡萄糖10g, 蛋白胨5g,酵母浸膏5g,MgSO?7H2O0.2g,K2HPO 1g,琼脂20g,pH7.2,7.4.淀粉.酪素琼脂培养基: 每升含可溶性淀粉10g,Casein0.3g,KNO2g,MgSO . 7H2O0.05g,K2HPO42g,CaCO30.02g,FeSO410mg, 琼脂20g,pH7.2,7.4.甘油.天门冬酰胺培养基 (ISP5):每升含L.天门冬酰胺lg,甘油10g,K2HPO 1g,琼脂20g,pH7.2,7.4. 1.2样品采集和菌株分离 从云南的西北,东北,东南,滇西,元阳,绿春等 地采集300余份土样.样品经稀释涂布平板,在 28?培养2,3周,根据菌落大小,形态,颜色等进行 初步分离筛选并纯化. 1.3I型和?型聚酮类化合物生物合成途径基因 阳性菌株的筛选 PKS工和PKS11基因阳性菌株的筛选参照徐平 等的方法进行. 1.4菌株的初步鉴定 1.4.1形态观察:对放线菌分别用察氏琼脂培养 基,酵母膏.麦芽膏琼脂培养基(ISP2),燕麦片琼脂 培养基,甘油.天门冬酰胺琼脂(ISP5),改良的 SautonS副琼脂培养基和改良的Bennett'S琼脂培养 基于28?条件下进行埋片培养.培养7,14,21和 28d,分别取出埋片,先用光学显微镜观察形态,并选 择生长密度适宜的培养物进行电镜观察.对细菌则 采用营养琼脂培养基,肉汁胨琼脂培养基和马铃薯 琼脂培养基于37cI=条件下培养,过夜观察.培养物 颜色与ISSC.NBScolorcharts(standardsampleNo. 2106)色卡比较确定. 1.4.2生理学特性研究:生理生化特征的选择主 要根据文献[10]中相应属,种鉴定的有关内容进行. 主要进行了唯一碳,氮源生长试验,酶的产生,明胶 液化,牛奶胨化和凝固,纤维素分解,硫化氢产生和 硝酸盐还原等试验. 1.4.3全细胞壁氨基酸分析:采用Hasagawa等" 的薄层层析法(Thinlayerchromatography,TLC)进行 全细胞壁氨基酸分析. 1.516SrDNAPCR扩增 1.5.1菌体总DNA的提取:参照徐平等n的方法 提取菌体总DNA. 1.5.216SrDNAPCR扩增:正向引物PA(对应于 E.coli的16SrDNA5端8,27f位核苷酸):5, AGAGT1TGATCCFGGCTCAG.3;反向引物PB(对应于 E.coli的16SrDNA5端1523,1504r位核苷酸):5. TTAAGGATGGTGATGCCGCA-3. PCR扩增条件:以热启动方式进行扩增,95?变 性5min;加Taq酶后95?变性1min,55?退火1min, 72?延伸2.5min,共30个循环;最后再72?延伸 5raino 1.5.316SrDNAPCR扩增产物的纯化及测序:由 TaKaRa公司协助完成.测序引物同李文均等n的 方法. 1.6系统进化树的构建和分析 将所得到的序列用BLAST软件在GenBank/ EMBO/DDBJ等数据库中进行相似性搜索,选取同源 性比较高的典型菌株的16SrDNA序列作为参比对 象,以BLAST2n软件进行16SrDNA序列的两两 比对,得到供试菌株与参比菌株间的序列相似性;然 后用CLASTW软件引进行多重序列比对,根据 Kimur~2参数法H计算进化距离,采用邻接法 (Neighbor.Joining)n副构建系统进化树. 2结果和讨论 2.1菌种分离,筛选和表型特征分析 经纯化并淘汰重复菌株后,从云南不同地区采 集的300余份土样中共分离到876株菌.经PKS工 和PKS11基因筛选,得到75株PKS工和PKS11型基 因双阳性的菌株'.根据培养物抗菌活性,菌落形 态,大小,颜色等特征,选择10株菌进行了多相分类 研究.表1为这10株供试菌的生理生化特性. 2.2全细胞壁氨基酸分析和革兰氏染色特性研究 表2为供试菌的革兰氏染色特性.其中革兰氏 阳性菌株8个,革兰氏阴性菌株2个. 全细胞壁氨基酸分析的结果表明(表2),YIM 33361,YIM33378,YIM34827,YIM33309,YIM37251 和YIM37225含有me$o.DAP,菌株YIM001和YIM 31724含有L.DAP,菌株YIM34793含有L.Lys,而菌 株YIM31775在这个实验条件下没有发现已知的特 征性氨基酸. 2005,Vo1.45No.6徐平等:聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研 究823 表110株供试菌的部分生理生化特性 Table1Somephysiologicalandbiochemicalpmpertiesofthe10testedstrains IsolatesNo.12345679 Growthat4%NaCl一+一一一一一一一一 Optimumgrowthtemperature(?)28283737283728282828 Gelatinliquefaction++++一一一一一一 Milkpeptonization—'''''————— Milkcoagulation一一一一一一一一一一 Starchhydrolysis一+一一一一十十一十 Nitratereduetion?一一一一一一一一一 H2Sproduction一一+一一一一十一一 Melaninproduction++++一一一一一 Growthineellulose一一一一一一一一一一 Xanthinehydrolysis++++十++十一一 nypoxanthinehydrolysis一4-一4-一一一一一 Carbonutilization(1%) Ribose++++4-+++++ Xylose++++4-+++++ Glucose++++4-+++++ Arabinofie++++4-+++++ Fructose+++4-4-+++++ Galactose+++4-4-+++++ Maltose4-4-4-4-4-4-++++ Melibiose+++4-4-+++++ Raffinose+++4-++++++ Rha/nnose+一一十一一+一一一 Sucrose++一十++++++ Trehalofie+一一十一一+一一一 Me$o.inositol+一十+++++一 Mannitol+++4-++++++ Sorbitol+一一十一一+一一一 Sodiumcitrate一一一一一一一一一 Sodiumacetate+........ representstrainsYIM31724YIM3177533309YIM33361YIM3337837225and1. 2.……YIM00l,,,YIM,,,Y1M34J7,YlM327,lM, YIM37251respectively;+:Positive;-:Negative;?:Variable? 表210株茵的革兰氏染色,氨基酸组份及16SrDNA序列的BLAST分析结果 2.3系统发育分析 在PKS基因筛选的基础上我们根据培养物抗 菌活性,菌落形态,大小,颜色等特征选择10株菌进 行了16SrDNA序列测定和系统进化分析.根据供 试菌株的16SrDNA序列在GenBank等数据库中进 行相似性搜索,选定其中同源性较高的相关菌株构 建了系统进化树(图1,A.F). 从系统进化树状图可以看出,这10株供试菌 824微生物ActaMicrobiologicaSinica2005.Vo1.45No.6 I:I 10 837) 001 I1 00 733) 圈1对聚酮类化合物生物合成途径基因阳性部分菌株及其从GenBank等数据库中调集的该属同源性 最高相关菌种16SrDNA序列构建的系统发育树状关系圈 Fig.1PhflogenefictreeshowingtherelationshipsamongsometypeI&IIpolyketidesyn thesisgenepositivestrainsandrelmivespecies andothertaxadownloadedfromGenBankbasedon16SrDNAsequences Numbersonbranchnodesarebootstrapvalues(1000resamplings).A,ErepresentsstrainsYIM001andYIM31724(A),YIM33361 andYIM33378(B),YIM33309andYIM37251(C),YIM37225(D),YIM34827(E),YIM31 775andYIM34793(F).resoectivelv 徐平等:聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究 分属于7个科,8个属.其中菌株YIM001,YIM 31724属于链霉菌科(Streptomycetace?e)的链霉菌属 (Streptomyces).从16SrDNA序列相似性分析结果 看,YIM001与其最近邻的链霉菌属的典型种桑氏 链霉菌(S.sampsoniiATCC25495)间的同源性为 97.6%.综合对其所做的包括形态,生理学特性,细 胞化学组分,基因组DNA(G+c)mol%含量测定和 DNA.DNA同源性分析等在内的多相分类的结果, YIM001属于链霉菌属的一新种,我们将其命名为 河北链霉菌(Streptomyceshebeiensissp.IlOV)(其分类鉴 定的结果已另文发表).菌株YIM31724与其最 近邻的链霉菌属的典型种龟裂链霉菌龟裂亚种(s. r/mosussubsp.rimosusJCM4667)间的同源性为 98.8%.根据我们对其所做的多相分类的结果, YIM31724也应是链霉菌属的一新种,我们将其命 名为大理链霉菌(Streptomycesdaliensissp.nov)(其分 类鉴定的结果将另文发表).已知链霉菌是普通土 壤环境中的优势菌,也是生物活性化合物的主要产 生菌.经过几十年的研究,链霉菌属的有效发表种 已有近500种,因此重复发现链霉菌已知种的概率 越来越高.但链霉菌来源的新生理活性物质仍不断 被发现,新的特殊链霉菌的分离,鉴定和新生物活性 物质筛选依然是微生物来源新药筛选工作的重要课 题.加.我们基于基因筛选选择的两株链霉菌经多 相分类鉴定是链霉菌属的两新种,表明利用新的思 路和程序从自然环境分离,鉴定新的特殊链霉菌是 微生物资源开发利用的关键. 菌株YIM37225属分枝杆菌科(Mycobacteriaceae) 的分枝杆菌属(Mycobacterium).从16SrDNA序列相 似性分析结果看,YIM37225与最近邻的分枝杆菌 属的典型种霍氏分枝杆菌(Mycobacteriumhodleri DSM44183.)的同源性为97.9%.形态,生理学特 性,细胞化学组分,基因组DNA(G+C)mol%含量 的测定结果表明该菌与分枝杆菌属的典型特征相 符,应归为分枝杆菌属,但其分类地位需要通过与近 缘的分枝杆菌属典型种的DNA.DNA杂交才能最后 确定.YIM33361和YIM33378属于诺卡氏菌科 (Nocardiaceae)的诺卡氏菌属(Nocardia).从16S rDNA序列相似性分析结果看,YIM33361与其最近 邻的诺卡氏菌属的典型种少食诺卡氏菌(?. paucivoransDSM44386')间的同源性为96.9%,低于 97%的鉴定.根据我们对其所做的包括形态, 生理学特性,细胞化学组分,基因组DNA(G+c) mo1%含量测定等多相分类结果也支持YIM33361 为诺卡氏菌属的新种,因其对多种测试的抗生素均 表现为抗性,定名为多抗诺卡氏菌(?0c.. polyresistenssp.nov.).YIM33378与其最近邻的诺卡 氏菌属的典型种少食诺卡氏菌(N.pnm船DSM 44386)间的同源性为97.9%.YIM33378与YIM 33361的16SrDNA序列相似性最高,为98.9%,但两 者的基因组DNA.DNA杂交的相似性为49%,远低 于70%的新种鉴定标准,应为诺卡氏菌属的新种. 我们对其所做的包括形态,生理学特性,细胞化学组 分,基因组DNA(G+c)mol%含量测定等多相分类 结果也支持YIM33378为诺卡氏菌属的新种,定名 为大理诺卡氏菌(Nocardiadaliensissp.nov.).已知 分枝杆菌,诺卡氏菌多为病原菌,至今尚无这类菌产 生生理活性物质的报道.我们的工作不仅表明了分 枝杆菌,诺卡氏菌物种的多样性,而且表明这类菌也 具有产生聚酮类化合物的潜力,为微生物资源学研 究拓展了菌源. YIM37251属于链孢囊菌科(Streptosporangiaceae) 的链孢囊菌属(Streptosporangium).从16SrDNA序列 相似性分析结果看,YIM37251与其最近邻的链孢囊 菌属的典型种产紫晶链孢囊菌(Streptosporangium amethystogenesDSM43197.)间的同源性为98.9%. 形态,生理学特性,细胞化学组分和基因组DNA (G+c)tool%含量测定结果表明,该菌与链孢囊菌 属的典型特征相符,应归为链孢囊菌属,但其分类地 位需通过与近缘的链孢囊菌属典型种的DNA.DNA 杂交才能最后确定.而YIM33309则属于链孢囊菌 科(Streptosporangiaceae)的野野村菌属(Nonomuraea). 16SrDNA序列相似性分析结果表明YIM33309与其 最近邻的野野村菌属的典型种土库曼野野村菌 (NonomuraeaturkmeniaceDSM43926')间的同源性为 98.1%.形态,生理学特性,细胞化学组分,基因组 DNA(G+c)mol%含量测定的结果表明该菌与野 野村菌属的典型特征相符,应归为野野村菌属,其分 类地位还需要通过与近缘的野野村菌属的相关典型 种的DNA.DNA杂交才能最后确定. YIM34827属于微球菌亚目.从16SrDNA序列 相似性分析结果看,YIM34827与其最近邻乔氏菌 属(Georgenia)的相似性只有96%,而与其近邻纤维 单胞菌属(Cellulomonas)的相似性只有93.7%.从 系统进化树的自举值可看出,YIM34827在乔氏菌 属和纤维单胞菌属间形成稳定的单独分支,表明 YIM34827应与乔氏菌属和纤维单胞菌属并列,独 立成一个新属.另外从16SrDNA序列的特征性核 826微生物Act口MicrobiologicaSinica2005,Vo1.45No.6 苷酸看,YIM34827与其最近邻乔氏菌属间有两处 不同,而与微球菌亚目(Micrococcineae)的其它属间 至少有6个差异,表明不能将YIM34827归入微球 菌亚目已知的属.根据我们对其所做的多相分类研 究结果,我们拟将此株菌定为微球菌亚目的一个新 属(名称待定). 从 YIM31775和YIM34793是革兰氏阴性菌.16SrDNA序列相似性分析结果看,YIM31775与一 亚纲中的紫色杆菌属(Janthinobacterium)紧邻,与伞 有害紫色杆菌(Janthinobacteriumagaricidamnosum Wlr3)的相似性只有95.5%,而与"草酸杆菌科" ("Ox0f0bacteraceae")的其它属的相似性均低于 95%.另外在细胞形态,鞭毛着生方式,细胞脂肪酸 组成和对碳源的资化性上,YIM31775均与"草酸杆 菌科"的各属间有明显差别.根据我们对其所做的 多相分类研究结果,我们将这株菌定为"草酸杆菌 科"的一个新属——纳西杆菌属(Naxibacter),其典 型种为耐碱纳西杆菌(NaxibacteralkalitoleransYIM 31775)(其分类鉴定的结果已另文发表).YIM 34793属于产碱杆菌科(Alcaligertaceae)的无色杆菌 属(Achromobacter).从16SrDNA序列相似性分析结 果看,YIM34793与其最近邻的无色杆菌属的典型种 皮氏无色杆菌(AchromobacterpiechaudiiATCC 43552)间的同源性为99.2%.形态,生理学特性, 细胞化学组分,基因组DNA(G+c)mo1%含量测定 的结果表明该菌与无色杆菌属的典型特征相符,应 归为无色杆菌属,但其分类地位需要通过与近缘的 无色杆菌属相关典型种的DNA—DNA杂交才能最后 确定.本研究所用的分菌方法很难分到革兰氏阴性 菌,因此只有较为特殊的革兰氏阴性菌才能被分离 到,我们研究的两个革兰氏阴性菌就发现了一个新 属,证明了我们选择菌种思路的正确.已知革兰氏 阴性菌多产生多肽类抗生素,很少有产生聚酮类生 理活性物质的报道.我们的工作不仅表明了革兰氏 阴性菌物种的多样性,而且表明这类菌也具有产生 聚酮类化合物的潜力,为微生物资源学研究拓展了 另一个新的菌源. 我们从云南各地采集了一系列的土壤样品,设 计尽可能多的培养基进行细菌,放线菌的分离和聚 酮类化合物生物合成途径基因筛选,并对其生物多 样性进行了初步研究.上述结果表明我国的云南省 多样的生态环境孕育了大量的未知微生物,如何从 普通环境中分离,发现和鉴定未知微生物并将其资 源化是微生物资源学工作者函待研究的重要课题. 国外普遍采用纯培养技术和分子生物学,化学分析 手段相结合的综合分析方法.我们根据国内研 究的实际情况,避开使用昂贵的大型实验装备,利用 实验室建立的快速,高效的放线菌基因组DNA提取 技术n和聚酮类化合物生物合成途径基因快速筛 选技术',将新物种的挖掘和新药筛选有机地结 合起来,为菌种,基因和化合物之间关系的探索开辟 了一条新的途径.我们鉴定的10个菌株分别属于 7个科,8个属,其中发现新属两个,新种6个.这种 新物种发现的概率是比较高的,表明我们所建立,使 用的研究体系的有效性.多样的新的微生物菌种资 源是进行有效新药筛选的前提和基础,目前这批聚 酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株正在进行发 酵产物新生理活性物质评价研究. 参考文献 山田晴宇.放线菌学分野最近话题.生物工学会志,1998, 76:58—81. 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