【word】 单增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展

【word】 单增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展 单增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展 doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2011.12.19 单增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展? 中国免疫学杂志2011年第27卷 周云潘蕾郝春秋贾战生(陕西省西安市第四军医大学唐都医院传染科,西安710038) 中国图分类号R392.11文献标识码A文章编号1000-484X(2011)12-1132-03 单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytohenes)存活,通过LLO,PI.PLC和PC—PLC溶解宿主细胞吞 简称单增李斯特菌(I朋),是一种革兰氏阳性兼性厌噬体膜逃离吞噬体,进入胞浆后复制繁殖,ActA引 氧,胞内寄生菌,对环境耐受性强,可在较高的盐浓起宿主细胞肌动蛋白聚合,实现细胞内或细胞间的 度(可高达40%NaC1)以及宽泛的pH(pH3—12)和温扩散,避免遭遇胞外环境以进一步逃逸机体免疫系 度范围(0,45?)内生长,并可形成夹膜,因而LM统l引. 广泛存在于自然界的不同环境中(土壤,水源,植物 及动物体内等),易污染各种食品(肉,奶,海产品及 蔬菜等),属条件致病性人畜共患病原菌?1J.和其他 细菌相比(如分枝杆菌,沙门氏菌,志贺菌等),LM不 仅能耐受极端环境,还能通过激活CD4,CD8T细 胞而有效的诱发完全细胞免疫_2I3J.野生型LM的 致死剂量比其他细菌高很多,安全性好,鉴于上述特 点,LM作为基因疫苗的载体应用于科学研究越来越 广泛.本文对LM生物学特性,免疫应答,载体的构 建及其临床应用等方面的研究进展作. 1生物学特性 LM的毒力主要由六个基因组成的基因簇所决 定,顺序是pffA,picA,hly,mpl,actA和plcB.由转录 调控因子prfA调节的内化素InlA和luIB为最早鉴 定出的与细菌侵袭力相关的毒力因子,InlA通过与 上皮细胞钙粘蛋白(E—cadherin)相互作用而发挥效 应,InlB介导LM侵入肝细胞和非上皮细胞等;hly编 码的李斯特菌溶素0(LL0)是其最基本的毒力因子, 能裂解吞噬体膜,使LM逸入胞浆并大量繁殖;plcA 和DlcB分别编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI—PLC) 和卵磷脂酶(PC.PLC),有助于LM逃离吞噬小体; actA编码一种面蛋白,诱导宿主细胞肌动蛋白聚 集,在细菌表面形成极化的肌动蛋白尾,使LM在胞 浆内运动并促进其向邻近细胞扩散_4j.LM侵入机 体后首先感染专职抗原提呈细胞(APEs)并在胞内 ?本文为国家”十一五”重大传染病防治专项(2009ZX10004—715) 作者简介:周云(1986年一),女,在读硕士,主要从事病毒性肝炎 的基础与临床研究; 通讯作者及指导教师:贾战生(1959年一),男,博士生导师,主要从 事病毒性肝炎的基础与临床研究,E—mail:ii— azsh@fmmu.edu.cn 2LM诱发的免疫反应 2.1固有免疫固有免疫在清除LM和控制感染 的早期起重要作用.脾脏的吞噬细胞和树突状细胞 (DC)是LM在体内生长的主要寄居处,感染第一天, 包含活细菌的这些细胞迁移到脾脏白质的T细胞 区,建立二级防御并激发嗜中性粒细胞反应.在肝 脏中枯否细胞清除大部分循环细菌,嗜中性粒细胞 通过IL-6和其他趋化因子迅速聚集在感染位点,分 泌IL.8,CSF.1,MCP.1,这些细胞因子在炎性反应和 诱导巨噬细胞中起重要作用L6J.巨噬细胞(M)感 染LM后,产生大量促炎因子和细胞因子,其中最重 要的早期细胞因子是IL.12p70,工型干扰素,IL-18. 这些细胞因子及其下游的细胞因子诱导大量嗜中性 粒细胞的涌入,吞噬和杀死循环细菌,募集NK细胞 并合成IFN进一步刺激APCs的成熟l_7J.LM对刺 激DC成熟和激发CD8T细胞活性也有影响.LM 侵入DC胞质,可诱导共刺激分子(CD40,CD80和 CD86)的高表达及IL-12,IL-10,IL-6和TNF—a的有效 生成.DC产生的细胞因子(尤其是IL-12和IIJ-1O) 是决定产生IFN.7的T细胞比例的主要因素,表明 I34进入细胞质是T细胞产生细胞因子的最佳诱导 条件,是对抗病菌并产生保护性细胞毒T淋巴细胞 (cTL)反应的重要因素_8J.体内实验结果与上述体 外实验相一致I9l.Feng~m发现LM可以诱导DC产 生足量IFN.B以诱发抗原特异性T细胞活化,产生 保护性细胞免疫. 2.2适应性免疫由于LM可以存在于M胞浆 内,因此可以同时引起MHC工类和MHCII类抗原 提呈反应,有效诱导抗原特异性CIM,CD8T细胞 应答【11].同时,LM独特的生理特点可起到加强抗 原提呈的作用,LM表面的脂胞壁酸质,肽聚糖,载脂 周云等单增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展第12期 蛋白等可以与DC表面的特异性Toll样受体结合, DC在识别这些抗原后可以通过调节CD80和CD86, MHC?类分子及炎性分子如IL-12,TNF.d而起到加 强抗原提呈作用,没有DC,就不能有效诱发CD8T 细胞免疫[12].CD4和CD8T细胞是清除LM感染 的重要效应细胞,CD8T细胞产生穿孔素,颗粒酶, IFN.7;CIMT细胞产生Thl细胞因子,如TNFa, IFN一7,IL-2;其他细胞如B细胞,调节性T细胞和非 经典MHC型T细胞主要通过影响CD4和CD8T 细胞来发挥作用_10I1. 3重组LM作为疫苗载体 3.1LM的减毒LM作为疫苗载体用于临床,需要 进行菌株减毒.目前普遍的减毒方法是细菌毒力基 因的缺失或插入突变,使LM减毒并保持其免疫原 性.通过插人外源性基因片段,导致编码LLO的基 因发生突变,可使LM毒力下降10万倍.单基因敲 除actA可使毒力下降1万倍.双缺失actA/InlB以 及actA/plcB也已经成功应用于实验中N5].另有研 究小组开发灭活但有代谢活性(KBMA)的LM疫苗, 同时具有活疫苗的功能和死疫苗的安全性,为重组 疫苗治疗感染性疾病和癌症提供了一个平台_1. 与革兰氏阴性菌(沙门氏菌和大肠杆菌)相比,革兰 氏阳性菌LM不会过早的激活机体的免疫系统,导 致载体被迅速清除_1.单增LM使用的便利之处在 于它不同的基因组株已测序,生物体的基因易于处 理,众多毒力减弱突变株已构建成功. 3.2利用LM运送核酸利用单增李斯特菌运送 DNA或RNA已被证明,它通过一个自杀机制来释放 质粒DNA或RNA直接进入哺乳动物的细胞质 中l_1.这种自杀的李斯特菌使用减毒骨干,其中缺 失的基因用于芳香族氨基酸合成的aroA和用于色 氨酰tRNA合成的tws;并利用包含噬菌体A】18裂 解基因(plyl18)的自裂解质粒来运送DNA.一旦细 菌进入受感染的哺乳动物细胞质,1)lyl18表达,李斯 特菌载体裂解.Souders等[19]用类似的方法构建了 单增李斯特菌DNA疫苗,通过DNA运送肿瘤相关 抗原和自杀质粒.还有种增加DNA运送效率的替 代方法是使用bactofection,包括用抗生素治疗以促 进细菌裂解和质粒DNA的释放[20J.在这个研究 中,减毒的LM突变体对氨苄西林敏感,并且质粒中 包含能导致细菌裂解的真核转录的细胞溶素.使用 氨苄西林能诱导细菌裂解并且转移质粒DNA到宿 主细胞质. 3.3李斯特菌作为疫苗载体的应用LM作为强大 的,安全的疫苗载体的优点有:(1)李斯特菌能在标 准BSL2实验室中很容易地生长;(2)基因操作李斯 特菌使重组减毒的疫苗株能安全应用于人类的技术 已经建立;(3)容易操作,利用质粒或染色体系统可 以表达多个基因产物;(4)对其生命周期,遗传学和 免疫学特性有广泛的知识;(5)直接感染APCs并在 细胞内生长,如单核细胞,Me?和Dc,从而运送TAA 到细胞质中,通过免疫系统导致加工和抗原提呈. 这些特性使得李斯特菌作为疫苗的运送载体,不仅 可以运送抗原蛋白,而且可以运送DNA和RNA_2. 重组LM作为疫苗载体诱导抗病毒或肿瘤抗原 的特异性细胞免疫,已应用于表达流感病毒,淋巴细 胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV),人类乳头瘤病毒 HPV.16E7,人类免疫缺陷综合症病毒HIVgag,酪氨 酸酶相关蛋白(Trp2),前列腺特异性抗原(PSA), HER-2/neu等[22-26].研究者已证明了一个高度减毒 的表达HPVE7抗原的LM株在治疗宫颈癌患者一 期临床试验中的安全性,这项试验指出了载体的安 全性和耐受性,并提出LM作为一种载体在临床治 疗方面的可能性_27j.最近(2011年)Sciaranghella 等【28j构建了减毒圳载体,Lmdd.BdopSIVgag,编码 SIVmac239gag.胃内给予猕猴3×10个细菌是安 全的,并能诱导抗gag细胞免疫反应,但体液免疫无 应答.实验认为这种新的减毒活性Lmdd—BdopSIV. gag可能为口服疫苗提供一个有吸引力的平台l. 另有研究者应用两种减毒的李斯特菌:act_A_一/plcB. (BMB72)或act_A_一/InlB.(BMB54),都表达A型流感 病毒核蛋白融合抗原,体外和小鼠体内评估这两株 的安全性和毒性,并且有22名健康志愿者接受单次 口服其中一种疫苗,观察其安全性,保护作用及免疫 原性Lm].结果表明该口服疫苗安全,能诱发中等强 度的针对IJM复合抗原的粘膜免疫和细胞免疫,但 是没有诱发针对流感病毒抗原的特异性免疫反应. 4重组减毒的应用前景和问题 作为递呈外源基因的细菌疫苗载体需满足以下 几个条件:(1)安全性好,即在动物模型中毒力比其 亲本菌株至少低4个对数倍数;(2)能在感染细胞的 胞质中稳定表达外源基因;(3)能优先感染专职 APCs;(4)储存条件下性能稳定,不会发生外源基因 丢失;(5)价格低廉.携带特异性抗原的减毒重组 LM能够引起肿瘤退行性变,抵抗病毒进一步感染, 为肿瘤和难治性病毒感染的治疗提供了新思路.然 而,重组LM作为疫苗载体应用于临床仍存在一些 问题,如基因敲除后的减毒菌株毒力能否保持稳定, 1134? 李斯特菌携带的外源性抗原编码基因是否能稳定表 达蛋白,表达的蛋白是否有功能,人体内预存的针对 LM的免疫能否影响有效的内源性免疫和适应性免 疫,保证患者安全的剂量及患者免疫情况的纳入和 排除是什么等等?7j.Leong等[3o]就发现人体有 高水平的(所测志愿者的6o%)预先存在的针对LM 的细胞免疫,阻碍LM载体所携带的治疗基因或疫 苗的治疗效果.但是,最近有学者研究证明预先存 在的抗LM的免疫不会减弱口服LM疫苗抗HIVgag 的免疫效应,LM空载体也没有诱发猕猴的抗体免疫 反应,表明进一步研究口服减毒LM疫苗的可行 性_3.随着研究的不断深入,减毒重组LM必将得 到不断改进,为肿瘤和难治性病毒感染的治疗提供 更为广阔的前景. 5参考文献 1VazquezBolandJA.KuhnM.BerchePetaf.Listeriapathogenesisand molecularvimlencedeterminantslJj.ClinMicrobiolRev,2001;14:584— 640. 2WallechaA,CarrollKD,MaciagPCeta.Multipieeffectormechanisms inducedbyrecombinantlisteriamonocytogenesanticancerinffnunothera— peutics[J].AdvancesinAppliedMicrobiology,2o09;66:1-27. 3BruhnKW,CraftN,MillerJF.Listefiaasavaccinevector[JJ.Microbes andInfection,2O07;9:1226—1235. 4Po~noyDA,ChakrabortyT,GoebelWeta1.Moleculardeterminantsof Listeriamonocytogenespathogenesis[J].InfectInanun,1992;60:1263— 1267. 5DussurgetO,Pizarm-CerdaJ,CossartP.MoleculardeterminantsofListeri- amonocytogenesvirulence[J].AnnnRevMicrobiol,2004;58:587—610. 6GuleriaI.PollardJW.Aberrantmacrophageandneutmphilpopulation dynamicsandimpaired1responsetoListeriamonocytogenesincolony. stimulatingfactor1-deficientwiee[J].InfectImmun,2001;69:1795- 1807. 7BrockstedtDG,DubenskyJrTW.Promisesandchallengesforthedevel- opmentofListeriamonocytogenes—basedimmunotherapies[J]ExpertRev Vaccines,2008;7(7):1069.1084. 8BrzozaKL.RockelAB,HiltboldEM.CytoplasmicantryofListeria monocytogenesenhancesdendriticcellmaturationandTcelldifferentia- tionandfunction[Jj.JImmunol,20o4;173(4):2641—2651. 9MurailleE,GianninoR,GuimaldaPeta1.Distinctinvivodendriticeell activationbyliveversuskilledListeriamonocytogenes[J].EurJhn— mullO1,20o5;35:l4631471. 10FengHP,ZhangD,PalliserDetol ceilsproduceIFN—B,primingTcell 175:421_432. Listeria-infectedmyeloiddendritic activation[J].JImmunol,2005; l1LadelCH.F1esnhIE.AmoldiJeta1.Studieswi山MHCdeficient knock-outmicerevealimpactofbothMHCI-andMHCIIdependentT cellresponsesonListeriamonocytogenesinfection[J3.JImmunol,1994; 153:3116-3122. 12JungS,UnutmazD,WongPeta1.InvivodepletionofCDIlc(+)den— as- driticcellsabrogatesprimingofCD8(+)Tcellsbyexogenouscell— sociatedantigens[JJ.Immunity,20o2;17:211-220. 13ZenewiczLA,ShenH.InnateandadaptiveiInnluneresponsestoListeria monocytogenes:ashortoverview[J].MicrobesInfect,2007;9(10): 1208—1215. 14WallechaA,CarrollKD,MaciagPCetaf.Multipleeffectormocha. nismsinducedbyrecombinantlisteriamonocytogenesanticancerim. 中国免疫学杂志2011年第27卷 munotherapeutics[J].AdvApplMicrobiol,2009;66:1-27 15AngelakopoulosH,LoockK,SisulDMeta/.Safetyandsheddingofan attenuatedstrainofListeriamonocytogeneswithadeletionofactA/plcB inadultvolunteers:adoseescalationstudyoforalinoculation[J].Infect Immun,2O02;70(7):3592.3601. 16BrockstedtDG,BahjatKS,GiedlinMAeta1.KiIIedbutmetabolically activemicrobes:flnewvaccineparadigmforelicitingeffectorT_eeI1Ie— sponsesandprotectiveimmunity[J].Naturemedicine,2005;ll(8):853: 860. 17VassanxG,NitcheuJ,JezzardSeta1.Bacterialgenetherapystrates lJJ.JPathol,2006;208(2):290—298. 18PilmS,StritzkerJ,SehoenCeto1.Bae)ofectionofmammaliancellsby Listeriamonocytogenes:improvementandmechanismofDNAdelivery lJj.GeneTher,2003;10:2036—2045. 19SoudersNC,VerehT,PatersonY.Invivobactofection:listeriacanfunc— tionasaDNA—cancervaccine[JJ.DNACellBiol,20O6;25:142151. 20vanPijkerenJP,MorrisseyD,MonkIReto1.AnovelLi~eriamonocy— togenes-basedDNAdeliverysystemforcancergenetherapy[J].Hum GeneTher,2010;21:405416. 21LoL~lerD1.SchocnCU.GoebelWet?f.Comparisonofdifferentlive vaccinestrategiesinvivofordeliveryofproteinantigenorantigen--encod?- ingDNAandmRNAbyvimlence-attenuatedListeriamonacytogenes[J]. InfectImlnnn,2006;74:3946.3957. 22BruhnKW,CraftN,MillerJF.Listeriaasavaccinevector[J].Mi. crobesInfect,2Oo7:9:1226—1235. 23GunnGR,ZubairA,PetersCetaZ.TwoListeriamonecytogenesvaccine vectorsthatexpressdifferentmolecularformsofhumanpapillomaviIlls一 16(V-16)E7inducequalitativelydifferentTcellimmunitythatcot— relateswi山theirabilitytoindueeregressionofestablishedtn/nor$im— mortalizedby}?)v一16[JJ.JImmunol,200l;167:6471-6479. 24LiebermanJ,FrankelFR.EngineeredListeriamonocytnganesasan AIDSvaccine[Jj.Vaccine,2002;20(15):2007.2010. 25SinghR,PatersonY.In山eF,,B/N皿R.2/neutransgenicmousebo山 peripheralandcentraltolerancelimittheimmuneresponsetargeting HER.2/nuinducedbyListeriamonocytogenes—basedvaccines[J].Can— cerIrmnunolImmunother.2OO7:56:927—938. 26ShahabiV.Reyes.ReyesM.WlechaAeta/.DevelopmentofaListeria monocytogenesbasedvaccineagainstprostatecancerlJj.CancerIm— manolImmunother,20o8:57:1301.1313. 27MaciagPC,RadulovicS,RothmanJ.Thefirstclinicaluseofalive—at— tenuatedListeriamonocytogenesvaccine:aPhaseIsafetystudyofLm- uJ0一E7inpatientswithadvancedcarcinomaofthecervix[Jj.Vaccine, 3983. 2O09:27(30):3975— 28SciaranghellaG,LakhasheaSK,Ayash—RashkovskyMet.Aliveat tenuatedListeriamonacytogenesvaccinevectorexpressingSIVGagis safeandimmunogenicinmacaquesandcanbeadministeredrepeatedly lJj.Vaccine,20l1;29:476486. 29JohnsonPV.B1airBM.ZellerSeta1.Attenuated?steriamonocyto— genesvaccinevectorsexpressingInfluenzaAnueleopretein:preclinieale— valuonaIld0r丑lin0culad叩0fv0lunteerslJJ.cmbi0lh眦nmol, 2Ol1:55:3O4.317. 30LoDngML,H舭lplJ,IjuWe,?Z.h印act0fpn捌stingVect0npeci6c immuni竹0nvaccinep0t即cy:charactzation0flistamonocyt0enes— specmchm日I】dcdlularimtvinh1?T脚s趴dm0de1ingsttIdies usingrec0硼binantvaccinesinIllicelJJ.IrctIrn?m,2O09;77(9): 3958—3968. 31WhitIleYJB,Mirsha}lidiS,?mSY.蹦0r嘲)0suret0粕a【l即uat. edstavaccined0esn0treduceimmunoenicity:pre—cliIlicalassess— rnent0ftIle娟cacy0faListavaccineint|leinducti0n0fin?HLlIleIe— sp衄sesanstHIVlJj.Jlm珊meBasederVaccines,2oI1;l8(9): 2—2. [收稿20l1?0r7—13修回20l!一o7.26] (编辑倪鹏)