栀子与黄连解毒汤肝毒性的比较研究

栀子与黄连解毒汤肝毒性的比较研究[摘要]目的:观察黄连解毒汤中其他药物与栀子合用对栀子肝毒性的影响及作用机制。方法:大鼠分别灌胃给予栀子及“黄连解毒汤”水煎液，剂量均10倍于临床用量，每天给药1次，3d后测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)。取肝脏，计算肝重指数。测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。TUNEL法测肝组织中细胞凋亡;免疫组化法测肝组织中凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2的表达。结果:栀子组与对照组相比，肝重指数显著增加;ALT，AST，ALP，TBA显著升高;SOD，SOD/MDA及GSH-PX显著降低，MDA，TNF-α含量显著升高;累积吸光度，凋亡指数，Bax，Bax/Bcl-2显著升高。黄连解毒汤组与栀子组相比，肝重指数显著减小;ALT，AST，ALP，TBA显著降低，SOD，SOD/MDA及1GSH-PX显著升高，MDA，TNF-α含量显著降低;累积吸光度与凋亡指数显著降低;Bcl-2显著升高，Bax/Bcl-2显著降低。结论:栀子有一定的肝毒性，机制与炎症、氧化应激反应诱导肝细胞的坏死与凋亡有关;黄连解毒汤中除栀子外的其他中药可通过提高清除自由基酶的活性、抑制炎症反应拮抗栀子引起的肝细胞损伤而降低栀子的肝毒性。[关键词]栀子;肝毒性;黄连解毒汤中药及其组方配伍理论是传统中医药理论的重要组成部分，在临床，配伍应用不仅可提高单味药的疗效，还可减少或消除单味药的毒副作用。栀子是临床常用中药之一，具有泻火除烦、清热利湿、凉血散瘀的功效;主要用于热病心烦、急性黄疸型肝炎、膀胱炎、目赤肿痛、上消化道出血、局部出血及扭挫伤的治疗[1]。但有文献报道，大剂量栀子具有明显的肝毒性[2]。黄连解毒汤出自唐王焘所著《外台秘要》，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味中药组成，为清热解毒的代表方。本课选择含有栀子的黄连解毒汤与等量栀子单用的肝毒性进行比较研究，结合栀子肝毒性机制黄连解毒汤中其他药物与栀子合用对栀子肝毒性的影响及作用机制，为临床安全用药提供参考。11.1药材生栀子，批号110816，产地浙江;黄连，批号111027，产地四川;黄柏，批号111114，产地四川;黄芩，批号120110，产地内蒙古。以上药材均购自上海养和堂中药饮片有限公司。1.2制备方法栀子2及黄连解毒汤组方药材分别置于不锈钢锅中，加8,10倍量的蒸馏水，浸泡过夜，加热煮沸，沸腾后改用文火，保持微沸30min，搅拌，趁热过滤，药渣再加蒸馏水同法煎煮，沸后30min，滤过，合并滤液，浓缩，使用前用蒸馏水稀释调整至所需浓度。1.3动物Wistar大鼠，雄性，中国科学院实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2007-2005，饲养于上海中医药大学实验动物中心。1.4试剂超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝、谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)等检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子(TNF-α)购于上海西唐生物科技有限公司;凋亡检测试剂盒，FragELTMDNAFragmentationDetectionKit，Colorimetric-TdTEnzyme购于Merck公司;免疫组化一抗:兔多克隆抗体Bax，兔多克隆抗体Bc1-2购自天津津脉基因有限公司;免疫组化二抗:HRP标记羊抗兔购自福州迈新生物技术开发有限公司。2方法2.1动物分组及给药Wistar大鼠，体重(140?10)g，预适应5d后，分为3组，每组10只，分别为正常对照组、栀子组(9gkg-1)、黄连解毒汤组。栀子为临床用药等效量的10倍，黄连解毒汤中所含栀子与单用栀子的量相同，其他各药量均相应扩大为临床用药等效量的10倍。每天灌胃给予受试药或对照液1次，连续3d。2.2指标的检测给予受试药或对照液连续3d后动物取血，制备3血清，测定ALT，AST，ALP，TBA;肝称重后取肝大叶，10%福尔马林固定;其余肝组织保存在超低温冰箱中。测定前取超低温冰箱冻存的肝组织加冷生理盐水制备成肝匀浆，离心，取上清液备用。取0.5%肝组织匀浆按照试剂盒说明，用考马斯亮蓝方法测定肝组织中蛋白含量及肝组织中SOD活性，取1%肝组织匀浆测定肝组织中MDA含量，计算SOD/MDA;取1.5%肝组织匀浆测定肝组织中GSH-PX活性。取10%肝组织匀浆采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测TNF-α浓度，具体操作按试剂盒说明进行。肝组织匀浆中TNF-α浓度以单位蛋白含量表示。取10%福尔马林固定的肝组织常规脱水包埋，切片。TUNEL染色法检测细胞凋亡:石蜡切片脱蜡水化后，蛋白酶K工作液(20mgL-1)室温孵育20min。TBS冲洗3次后，加3%的过氧化氢100μL封闭液灭活内源性过氧化物酶室温孵育5min。滴加脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)平衡缓冲液100μL，室温孵育30min，加入TdT标记反应液60μL;阴性对照用TBS缓冲溶液代替TdT标记反应液，置于避光的湿盒中37?孵育1.5h。反应终止后DAB显色10min，100μL甲基绿复染，孵育3min，封片，在光学显微镜下观察并结果。照片拍摄于200倍显微镜头，凋亡细胞计数采用100倍视野。凋亡指数=凋亡细胞/(凋亡细胞计数+非凋亡细胞计数)×100%。免疫组化法检测凋亡相关蛋白的表达:4石蜡切片脱蜡水化后，PBS冲洗3次，使用0.01molL-1柠檬酸缓冲液进行抗原修复。3%的过氧化氢封闭液灭活内源性过氧化物酶室温孵育10min。依次滴加10%正常牛血清、一抗、二抗，最后滴加DAB显色液，苏木素复染，脱水透明和封片。一抗工作浓度为1?100，以PBS代替作为阴性对照。照片拍摄于200倍显微镜头，用专业图像分析软件Imageproplus6.0测得免疫组化图像中阳性区域面积、吸光度(A);棕色为阳性表达，计算阳性表达率。阳性表达率=阳性面积/累积吸光度×100%。2.3数据处理实验数据采用?s表示，使用SPSS15.0软件进行统计处理，多组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，2组间比较采用Student-Newman-Keulstest分析，方差不齐时采用dunnettt′sT3检验，P3结果3.1对肝重指数的影响栀子组、黄连解毒汤组与对照组相比，肝重指数均显著升高;但黄连解毒汤组的肝重指数与栀子组相比显著降低，见表1。表1栀子及黄连解毒汤对大鼠肝重指数的影响(?s，n=8)Table1EffectofGardeniaeFructusandHuanglianJieduTangonliverweightindexinrats(?s，n=8)3.2对血清生化指标的影响栀子组与对照组相比，ALT，AST，ALP，TBA均极显著升高;黄连解毒汤与对照组相比，ALT，AST，ALP，TBA没有明显差异;黄连解毒汤与栀子组相比，ALT，AST，ALP，TBA均极显著降低，见表2。53.3对肝组织氧化应激指标的影响栀子组与对照组相比，SOD，SOD/MDA及GSH-PX极显著降低，MDA显著升高;黄连解毒汤与对照组相比，SOD，MDA，SOD/MDA及GSH-PX均没有明显差异，与栀子组相比，SOD，SOD/MDA及GSH-PX极显著升高，MDA显著降低，见表3。3.4对肝组织TNF-α含量的影响栀子组与对照组相比，大鼠肝组织中TNF-α的含量极显著升高;黄连解毒汤组与对照组相比，大鼠肝组织中TNF-α的含量没有明显差异，与栀子组相比TNF-α的含量极显著降低，见表4。3.5对肝细胞凋亡率的影响TUNEL染色法检测凋亡细胞，显微镜下显示，对照组细胞核正常，大多显示为蓝色，偶见少量褐色细胞核;栀子组细胞核变形，可见大量棕色、褐色细胞核;黄连解毒汤组细胞核正常，大多显示为蓝色，偶见少量褐色细胞核，见图1。栀子组肝组织阳性细胞的累积吸光度和凋亡指数与对照组相比显著性升高，黄连解毒汤组与对照组相比没有明显差异，与栀子组相比则显著降低，见表5。3.6对肝细胞中Bax，Bcl-2表达的影响免疫组化法检测凋亡相关蛋白的表达，图像中棕色为阳性表达，可见栀子组肝组织中的Bax，Bax/Bcl-2与对照组相比显著升高，黄连解毒汤组Bax，Bcl-2与对照组相比显著升高，Bax/Bcl-2没有明显差异，与栀子组相比Bax/Bcl-2极显著降低，见图2，表6。4讨论有些中药过量使用会造成体内自由基堆积，产6生过氧化脂质，导致肝细胞膜及亚微结构的损伤，影响肝细胞的正常代谢[3]，引起肝细胞衰老与凋亡，这种“过氧化损伤”已成为目前公认且重要的肝毒性损伤机制之一。杨洪军等发现，栀子3.08gkg-1水提物灌胃给药3d，即可致大鼠肝重指数增加，血清ALT，AST活性增高，肝细胞肿胀、坏死，从而揭示栀子具有一定肝毒性[2]。栀子是临床常用药，含有栀子的复方在临床使用的频率很高。中医药理论与临床实践提示，中药合理配伍使用，能提高用药的疗效和安全性、减少毒副作用。因而探索合理配伍是否具有减少栀子肝毒性作用具有重要意义。本实验采用栀子单用与含栀子的古方黄连解毒汤进行比较研究的方法，栀子的剂量约为杨氏[2]实验用量的3倍，同样给药3d，结果显示单用栀子确能产生毒性。栀子使肝组织SOD，SOD/MDA及GSH-PX显著降低，MDA显著升高，表明氧化应激可能是栀子致大鼠肝损伤的机制之一。黄连解毒汤组肝毒性并不明显，与栀子组比较SOD，SOD/MDA及GSH-PX显著升高，MDA显著降低，说明黄连解毒汤中的其他中药可能通过提高清除自由基酶的活性拮抗栀子的肝毒性。TNF-α与肝重炎症、肝细胞再生等病理生理过程密切相关，是肝重疾病发生发展中的重要细胞因子，不仅能直接对肝细胞造成损伤[4]，且TNF-α的水平可以反应肝重疾病的严重程度[5-6]。本实验研究结果显示，栀子组大鼠肝组织中TNF-α的含量7极显著升高;黄连解毒汤组与栀子组相比，大鼠肝组织中TNF-α的含量显著降低。炎症反应可能是栀子肝损伤的机制之一，黄连解毒汤中的其他中药可能通过抑制炎症反应减轻栀子的肝毒性。栀子组肝组织细胞的凋亡率显著升高，黄连解毒汤组与栀子组相比肝细胞凋亡率显著降低。栀子通过诱导肝细胞的凋亡产生肝毒性，黄连解毒汤中的其他中药可以抑制栀子引起的肝细胞凋亡。细胞凋亡是由促进凋亡和抑制凋亡的2类基因共同调控的，两者相互配合才能启动凋亡，Bax和Bcl-2是调节凋亡的重要因子，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抑制凋亡的因子，Bax和Bcl-2两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。如Bax过表达，Bax之间形成同源二聚体促进凋亡，如Bcl-2和Bax表达量平衡，Bcl-2与Bax形成异源二聚体则抑制凋亡，因此Bax和Bcl-2两者之间的比值影响着细胞的凋亡状态。本实验显示，栀子组肝组织细胞中的Bax，Bax/Bcl-2显著升高，黄连解毒汤组与栀子组相比Bax/Bcl-2极显著降低。栀子可升高Bax/Bcl-2，诱导肝细胞凋亡，产生肝毒性，黄连解毒汤减轻栀子肝毒性，也与其降低Bax/Bcl-2有关。上述结果提示，栀子确有一定的肝毒性，不宜单独过量服用。但其与黄连、黄柏、黄芩组方成黄连解毒汤使用，即使用量达到临床等效量的10倍，肝毒性仍可明显减轻，安全范围扩大。说明有些古方的合理配伍能8够产生对有毒中药的减毒作用。因此，研究、运用好古方的合理配伍有利于提高药物的疗效，避免或减轻有些药物的毒性反应。[参考文献][1]傅春升，娄红祥，张学顺，等.栀子的化学成分与药理作用[J].国外医药植物药分册，2004，19(4):152.[2]杨洪军，付红梅，吴子伦，等.栀子苷对大鼠肝毒性的实验研究[J].中国中药杂志，2006，31(3):1091.[3]赵建国，周先保，张金柱.肝损伤96例诊治体会[J].中国医药导报，2008，5(2):146[4]WatanabeT，JonoH，HanJ，etal.SynergisticactivationofNF-kappaBbynontypeableHaenophilusinfluenzaeandtumornecrosisfactoralpha[J].ProcnatLAcadSciUSA，2004，101(10):3563.[5]NagakiM，IwaiH，naikiT，etal.Highlevelsofseruminterleukin-10andtumornecrosisfactor-alphaareassociatedwithfatal-ityinfulminanthepatitis[J].InfectDis，2000，182(4):1103.[6]WangJY，LiuP.Abnormalimmunitiveandgenemutationinpatientswithseverehepatitis-B[J].Gastroenterology，2003，9(9):2009.ComparativestudyonhepatictoxicityofGardeniaeFructusandHuanglianJiedudecoctionWANGKun，JINRuo-min，CHENChang-xun*(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，9China)[Abstract]Objective:ToobservetheeffectofingredientsinHuanglianJiedudecoction(HLJDT)combinedwithGardeniaeFructusonthehepatictoxicityofGardeniaeFructusanditsmechanism.Method:RatsweregivenGardeniaeFructusandHLJDTdecoctionatthedoseof10timesofclinicaldosagefor3days.TheirALTAST，ALP，TBAweredetected，andtheirliverweightindexwascalculated.SODactivity，MDAcontent，GSH-PXactivity，TNF-αcontentinhepatictissuesweredetermined.ThecellapoptosisinlivertissuewasdeterminedbyTUNEL，andtheexpressionsofapoptosisrelatedproteinsBax，Bcl-2weremeasuredbyimmunohistochemicalmethod.Result:Comparedwiththenormalcontrolgroup，theGardeniaeFructusgroupshowedsignificantincreaseinthel栀子与黄连解毒汤肝毒性的比较研究iverweightindex，ALT，AST，TBAandALP，notabledecreaseinSOD，SOD/MDAandGSH-PX，andremarkableriseinMDA，TNF-αconcentration，accumulatedopticaldensity，apoptosisindex，BaxandBax/Bcl-2.ComparewiththatintheGardeniaeFructusgroup，theliverindex，ALT，AST，TBA，ALPreducedobviously;SOD，SOD/MDAandGSH-PXmarkedlyincreased;MDAandTNF-α10significantlyreduced;theaccumulatedopticaldensityandapoptosisindexsignificantlyreduced;andBax/Bcl-2wasmuchlowerinHLJDTgroup.Conclusion:ThehepatictoxicitycausedbyGardeniaeFructusmayberelatedtoinflammation，oxidativestress-inducedhepatocytenecrosisandapoptosis.OtheringredientsinHLJDT，apartfromGardeniaeFructus，candecreasethehepatictoxicitycausedbyGardeniaeFructusbyincreasingtheenzymeactivityeliminatingradicalsandinhibitinghepatocyteinjurycausedbyinflammatoryreactionagainstGardeniaeFructus.[Keywords]GardeniaeFructus;hepatictoxicity;HuanglianJiedudecoctiondoi:10.4268/cjcmm20131430百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图馆11