家蚕“明”死卵突变体lem与野生型间卵巢的差异表达基因研究

家蚕“明”死卵突变体lem与野生型间卵巢的差异达基因研究 家蚕“明”死卵突变体lem与野生型间卵巢的差异表达 基因研究 m l-e 学校代码: 10289___ 分 类 号: S881.2_ 江 江 江 江 江 江 家 密 级: 公开 _ 苏 苏 苏 苏 苏 苏 蚕 科 科 科 科 科 科 “ 学 号:102300022_ 技 技 技 技 技 技 明大 大 大 大 大 大 ” 学 学 学 学 学 学 死科 卵技 突 大 变 学 体 江苏科技大学 与 野 生 硕 士 学 位 论 文 型间 卵巢的 差 m 异 家蚕 “明 ” 死卵突 变体 l-e 与野生型 间 表 达 江 基 苏 因 卵巢 的差 异表达基 因研究 科 研 技 究 大学 高 研究生姓 名高 鹏导 师 姓 名赵巧玲 鹏 申请学位类别 理学硕士 学位授予单位 江 苏 科 技 大 学学 科 专 业 生物化学 与分子生物学论文提交日期 2013 年 5 月 2 日研 究 方 向家蚕育 种 与分子生物学论文答辩日期2013 年 6 月 9 日 江 苏 科 答辩委员会主席 吴福安 评 阅人 技 大 学2013 年 6 月 1 日分类号: S881.2 密 级:公开 学 号: 102300022 理学 硕士 学位论文 m 家蚕“明”死卵突变 体 l-e 与 野 生 型 间 卵 巢 的差异表达基因研究 学生姓名 高 鹏 指导教师 赵巧玲 研 究 员江苏科技 大学 二 O 一 三年 六月 A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of ScienceAnalysis of differentially expressed genes between the m wild type and the l-e mutant ovaries Submitted by Peng Gao Supervised by Qiaolin Zhao Jiangsu University of Science and Technology June, 2013 江 苏 科技 大 学学 位 论文 原 创性 声 明 本人郑重 声明: 所 呈交的学 位论文 , 是本人在 导师的 指 导下, 独 立进 行研究 工 作所取 得 的成果。 除文 中已 经注明引 用的内 容 外, 本论文不 包含 任何其他 个人或 集 体已经发 表或撰 写 过的作品 成果。 对 本文的研 究做出 重 要贡献的 个人和 集 体, 均已在文 中以 明确方式 标明。 本 人完全意 识到本 声 明的法律 结果由 本 人承担。学位论文 作者签 名 :年 月 日江 苏 科技 大 学学 位 论文 版 权使 用 授权 书 本学位论 文作者 完 全了解学 校有关 保 留、 使用学位 论文 的规定, 同意 学校保留 并向国 家 有关部门 或机构 送 交论文的 复印件 和 电子版, 允许论 文 被查阅和 借阅。 本 人授 权江 苏科技 大 学可以将 本学位 论 文的全部 或部分 内 容编入有 关数据 库 进行检索, 可 以采 用影印、 缩印 或扫 描等复制 手段保 存 和汇编本 学位论 文 。 本学位论 文属于 : 1 保 密?, 在年解密后适 用本授 权 书。 2 不 保密? 。学位论文 作者签 名 :指 导教师签 名: 2013 年 月 日 2013 年 月 日摘 要 摘 要 m 家蚕 “ 明” 死卵突变体 (lethal egg of “ming”, l-e 产下的卵在很短时 间内即发生失 水致死, 已研究显示 导致 该现象是由 BmEP80 突变 引起的。 卵黄膜蛋白 BmEP80 为家 m 蚕卵巢结构蛋白,本课题以 l-e 为材料,采用数字基因表达谱 技术研究 卵巢差异表达 基因,以期为阐明家蚕卵子发生机制奠定基础。 m 1. 野生型 与 l-e 突变体间 卵巢差异表达基因的研究 m 通过对 野 生 型 和 l-e 突变体蛹期第 6 日 卵 巢 的 数 字 基 因 表 达 谱 (Digital gene expression, DGE ) 研究 , 分别获得 3,463,495 和 3,607,936 个清洁标签 (clean tag ),两 m 者间存在 239 个差异表达基因, 在 l-e 突变体 中, 有 181 个基因显示上调,58 个下调, m 仅 在 l-e 突 变 体 中 表 达 的 基 因 有 34 个, 仅 在 野 生 型 中 表 达 的 基 因 有 5 个。KEGG pathway 显示, 在 134 个 KEGG 路径中, 没有发现显著富集的 pathway , 在相对富 集的 前 5 个 pathway 中, 共有 3 个 与蛋白质合成有关。 同时,分析了 19.5 kDa 热激蛋 白(19.5 kDa heat shock protein, HSP19.5 ) 基因、 卵黄膜蛋白基因 BmVMP30 等 8 个显 著差异表达基因 的表达谱, 其中 Hsp19.5 在野生型中维持高表达,而在突变体中不表 达。 2. 昆虫激素 诱导下 Hsp19.5 和 BmEP80 的表达 研究。 激 素 调 节 在 家 蚕 卵 巢 发 育 中 发 挥 重 要 作 用 , 为 了 探 索 昆 虫 激 素 对Hsp19.5 和 m BmEP80影响作用, 对野生型和l-e 突变体分 别添食蜕皮激素 (Molting hormone, MH)、 保幼激素Juvenile hormone, JH 和 注 射 滞 育 激 素 (Diapause hormone, DH ) , 分 析 了 Hsp19.5 和BmEP80 激 素 处理前 后 表达 的变化 。 结果显 示,MH 和DH可以 诱导 卵黄膜蛋 白BmEP80 上调 表 达 。Hsp19.5 的 表 达 量 在MH 诱 导 的 野 生 型 中 显 示 上 调 , 在JH 诱导下 m 的表 达量显示下调, 而滞育激素对其诱导性不明显。 在l-e 突变体中, Hsp19.5 不受MH 、 JH 和DH 诱导。 m 本论文 研究了野生型与l-e 突变体间的差异表 达基因的研究 , 为进一步阐明卵子发 生机制提供了理论依据。 m 关键词 : l-e 突变体; 数字 基因表达谱;差异表达基因; 昆虫激素 I 江苏科技大学理硕士学位论文 IIAbstract Abstract m Lethal egg of “ming” l-e is an egg mutant in silkworm, Bombyx mori. The eggs laid m by the l-e mutant lose water, ultimately causing death within short time. Previous studies m have shown that the deletion of BmEP80 is responsible for the l-e mutation. BmEP80 is a vitelline membrane protein as a kind of structural protein in the ovary of Silkworm, Bombyx m mori. Differentially expressed genes were researched in ovaries of l-e mutant using Digital gene expression DGE, which gives the basic information for further research on the oogenesis in Silkworm, Bombyx morim 1. Differentially expressed genes between the wild type and the l-e mutant ovaries DGE was performed to investigate the difference of gene expression in ovaries m between wild type and l-e mutant on the sixth day of the pupal stage to obtain a global m view of gene expression profiles using the ovaries of l-e mutants and wild types. The m results showed a total of 3,463,495 and 3,607,936 clean tags in the wild type and the l-e mutant libraries, respectively. Compared with those of wild type, 239 differentially m expressed genes were detected in the l-e mutant, wherein 181 genes are up-regulated and 58 genes are down-regulated in the mutant strain. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG pathway analysis results showed that no pathway was significantly enriched and three pathways are tightly related to protein synthesis among the five leading pathways. Moreover, the expression profiles of eight important differentially expressed genes, including 19.5 kDa heat shock protein gene Hsp19.5 and BmVMP30, were made. In the present study, Hsp19.5 was highly expressed and maintained at a certain level of m expression in the wild type, but not in the l-e mutant 2. Expression of Hsp19.5 and BmEP80 induced by insect hormoneHormonal regulation plays an important role in the development of ovaries in silkwormIn order to explore the interaction between insect hormone and Hsp19.5 or BmEP80, Molting hormone MH, Juvenile hormone JH and Diapause hormone DH were fed into m the wild type and the l-e mutant, respectively. Meanwhile, the expression profiles of Hsp19.5 and BmEP80 were built. Results showed that the expression of BmEP80 was up-regulated in MH- and DH-induced ovaries. The expression of Hsp19.5 was up-regulated in MH-induced wild type and down-regulated in JH-induced wild type, while it was not m clear in DH-induced wild type. But it was no induction in MH-, JH- or DH-induced l-e III 江苏科技大学理硕士学位论文 mutantThe current study of the differentially expressed genes between the wild type and the m l-e mutant provide theoretical basis for elucidating the molecular mechanism of the oogenesis Key words: lethal egg of “ming”; Digital gene expression; differentially expressed gene; insect hormone IV目 录 目 录 摘 要 I Abstract. III 第 1 章 绪 论1 1.1 研究背景1 1.1.1 昆虫的卵子发生. 1 1.1.2 家蚕卵的 突变体. 3 1.1.3 激素对家蚕卵巢发育的调节4 1.1.4 基因差异表达研究进展. 6 1.2 研究目的意义和内容 9 m 第 2 章 家蚕“明”死卵突变体(l-e )蛹期 的差异表达基因研究11 2.1 引言11 2.2 材料、试剂和仪器11 2.2.1 材料. 11 2.2.2 试剂. 12 2.2.3 仪器. 12 2.2.4 所用引物12 2.3 方法 13 2.3.1 家蚕基因组提取与突变体的鉴定. 13 2.3.2 数字基因表达谱14 2.3.3 实时荧光定量 PCR 18 2.4 实验结果与分析 20 2.4.1 总 RNA 质量检测 20 2.4.2 参考标签数 据库 21 2.4.3 测序结果分析 21 2.4.4 Clean tag 比对统 计23 2.4.5 标签统计分析 24 2.4.6 Clean Tag 数的标 准化处理. 26 2.4.7 差异表达基因与验证 27 2.4.8 GO 和 KEGG 分析28 2.4.9 部分差异基因表达谱的构建 30 2.5 讨论31 2.6 本章小结 33 第 3 章 昆虫激素对 Hsp19.5 和 BmEP80 的影 响35 3.1 引言35 3.2 材料、试剂和仪器 35 3.2.1 材料. 35 3.2.2 试剂. 35 3.2.3 仪器. 35 3.3 方法 35 V 江苏科技大学理硕士学位论文 3.3.1 溶液配制35 3.3.2 激素处理36 3.3.3 家蚕基因组 DNA 的提取与突变体的鉴定36 3.3.4 卵巢总 RNA 的提取 36 3.3.5 实时荧光定量 36 3.4 实验结果与分析 36 3.4.1 实验观察结果 36 3.4.2 总 RNA 质量检验 36 3.4.3 Real-Time PCR 中扩增曲线和溶解曲线 37 3.4.4 五龄第 7 日 MH 诱导后 Hsp19.5 和 BmEP80 的转录水平. 37 3.4.5 五龄第 7 日 JH 诱 导后 Hsp19.5 的转录水平. 38 3.4.6 蛹期第 2 日的滞育激素诱导后 Hsp19.5 和 BmEP80 的转录水平 39 3.5 讨论40 3.6 本章小结 41 结 论43 参考文献45 攻读硕士期间发表的学术论文51 致 谢53VICatalogue CATALOGUE Abstract Chinese. ? Abstract English. ? Chapter 1 Introduction. 1 1.1 Research Background1 1.1.1 Insect oogenesis. 1 1.1.2 Silkworm egg mutations 3 1.1.3 The regulation of hormones on ovarian development of silkworm 4 1.1.4 Research progress of differentially expressed gene 5 1.2 The main content of this paper 9 Chapter 2 Differentially expressed genes in the ovary of pupal “Ming” lethal egg mutant of Silkworm, Bombyx mor. 11 2.1 Introduction 11 2.2 Materials, reagents and equipment. 11 2.2.1 Materials. 11 2.2.2 Reagents. 12 2.2.3 Equipment. 12 2.2.4 Primers. 12 2.3 Methods 13 2.3.1 Total DNA extraction from silkworm and mutant identification13 2.3.2 Digital gene expression14 2.3.3 Quantitative PCR 18 2.4 Results and analysis 20 2.4.1 Quality inspection of tatal RNA. 20 2.4.2 Reference Tag Database. 21 2.4.3 Analysis of sequencing results 21 2.4.4 Alignment statistics of the Clean tags. 23 2.4.5 Distributions of tags. 24 2.4.6 Normalization of clean tags26 2.4.7 Identification of differentially expressed genes and verification27 2.4.8 Go analysis and KEGG pathways. 28 2.4.9 Expression analysis of the candidate genes30 2.5 Discussion31 2.6 Summary. 33 Chapter 3 Insect hormones on Hsp19.5 and BmEP80 35 3.1 Introduction 35 3.2 Materials, reagents and equipment. 35 3.2.1 Materials. 35 3.2.2 Reagents. 35 V II江苏科技大学理硕士学位论文 3.2.3 Equipment. 35 3.3 Methods 35 3.3.1 Solution preparation. 35 3.3.2 Hormone treatment 36 3.3.3 Total DNA extraction from silkworm and mutant identification36 3.3.4 Isolation of tatal RNA of ovary36 3.3.5 Quantitative PCR 36 3.4 Results and analysis 36 3.4.1 Experimental observations 36 3.4.2 Quality inspection of tatal RNA. 36 3.4.3 Amplification Curves and Melting Curves of Real-Time PCR37 3.4.4 Expression levels of Hsp19.5 and BmEP80 induced by MH37 3.4.5 Expression levels of Hsp19.5 induced by JH38 3.4.6 Expression levels of Hsp19.5 and BmEP80 induced by DH39 3.5 Discussion40 3.6 Summary. 41 Conclusion43 References45 Published Papers During Study for a Master Degree. 51 Acknowledge. 53 VIII第 1 章 绪论 第 1 章 绪 论 1.1 研究背景 1.1.1 昆虫的 卵子发生 卵子发生oogenesis 是 指卵原细胞oogonia 形 成成熟卵细胞的过程。 在昆虫中,卵 子形成 在卵巢管ovariole 的生长区 进行,主要 有 3 个阶段组成,即从生殖期形成的卵 原细胞 , 至生长期形成的卵母细胞oocyte , 最后 再到成熟期的卵细胞ootide 。 卵子在 昆虫体内的成熟 经历了 5 个过程:卵母细胞的形成和分化、卵黄蛋白的合成、滤泡细 [1] 胞的分化、卵母细胞对卵黄蛋白的摄取和卵壳的形成 。 昆 虫 卵子 的发生 不仅 受到体 内激素水平 的 影响,还 受到 外界因子 的影响。 随着对其细胞 水平和分 子水平的研究, 昆虫卵子 发生 的机制有待进一步 得到阐述。 1.1.1.1 家蚕卵巢 发育 家蚕卵巢是 产生卵子 的 器官,位于 家蚕第五 腹 节背脉管两 侧, 左右 对 称,呈三 角 形状, 乳白色半透明状。 卵巢外层是一层无构造的卵巢膜, 卵巢内有疏松的结缔组织。 内腔的构造随蚕的生长而有变化,蚁蚕 仅在向背脉管的一边 有 3 片隔膜,随蚕生长而 延伸,将卵巢分为 4 个 卵巢小室,小室追逐渐延长形成卵巢管。化蛹后 1-2 日,由于 卵巢管显著伸长而使卵巢膜破裂,每个卵巢生成 4 条卵巢管,游离在体腔 内。化蛾前 卵巢管内排列着开始成熟的卵 ,化蛹第 6-7 日 ,卵子按发育时期的先后顺 序依次排列 在卵巢管中 (图 1.1) 1 江苏科技大学理硕士学位论文 [2] 图 1.1 化 蛹第 6 日 解剖 的 1 条卵 巢管Swevers L 等,2003 Fig. 1.1 Developing ovariole dissected from a pharate adult, 6 days after larval?pupal [2] ecdysisSwevers L, et al. 2003 +1 标 记的 为绒 毛膜 发生 初始阶 段 , 绒 毛膜 发生 之 后阶段 用正 数标 记; (-1) 标记的 为卵 黄发 生 结束阶 段, 卵黄 发生 之前 阶段用 负数 标记 Follicles are staged by numbers with respect to the start of choriogenesis +1 and the end of vitellogenesis -1; Later stages of choriogenesis are designated by increasing positive numbers. Earlier stages of vitellogenesis are designated by increasing negative numbers 1.1.1.2 卵子发生 卵子的形成是在雌性家蚕第 5 腹节背脉管两侧的卵巢内发生的 ,其形成过程可以 分为增殖期、生长期和成熟期 3 个时期。蚁蚕的每个卵巢内可划分为 4 个小室,每个 小室均含有卵原细胞。 卵原细胞随蚕龄推进而分裂增殖。2 龄开始小室逐伸长,3 龄时 已伸长为卵巢管,之后继续伸长并可分为前后 2 个部分。前部为卵原区,后 部为卵黄 区。卵原细胞 在卵原区 进行有丝分裂 增殖,一 个卵原细胞连 续有丝分 裂增殖 3 次。4 龄时, 每个细胞群的 8 个细胞中的 1 个分化为 初级卵母细胞,另外 7 个分化成滋养细 胞。 在蛹期由卵巢管上皮细胞分化出来的卵泡细胞包围形成小室,含有 7 个滋养细胞 的小室成为营养室, 即滋养室, 含有初级卵母细胞的小室为卵室。 滋养细胞以 滋养丝与 初 级卵母细胞 相连而供 给 其所需营养 。滋养细 胞 供给的营 养 枯竭以后又由 卵泡细胞 继续提供营养 供初级卵 母细胞不断生 长。卵室 呈半球形,滋养 室一侧扁平, 相反一侧 拱出呈弧形。 卵继续生 长变成椭圆形 。初级卵 母细胞完成生长 时, 在卵母细 胞的周围 由卵泡细胞分 泌物形成 一层卵黄膜。 之后又 有 卵泡细胞在卵黄 膜表面逐步分泌形成分层结构的卵壳 (图 1.2) 。 化蛾 1-2 日,初级卵 母细胞进入成熟 期, 在接近输卵管时开始第一次成熟分裂, 但到分裂中期即停止。 这时 28 对染色体排 列在赤道板附近处于等待受精的状态。 化蛾交配后 ,精子进 入 卵后 ,停止 在第一成 熟 分裂中期的 卵核受刺 激 而又重新 恢 复分裂状态。 蚕卵被排 出体外 ,40 分钟左右后 第一成熟分裂完成。 经 过第一次成熟 分 裂,卵母细胞分裂成 1 个含半数染色体的第 1 极体,另一个成为次级卵母细胞。1 小 时左右次级卵母细胞开始第二次成 熟分裂,产生第 2 极体和含有 28 条染色体的卵核。 2第 1 章 绪论 同时,第 1 极体分裂为 2 个极体,1 个初级 卵母细胞成熟分裂产生 1 个含半数染色体 而具有生殖能力的卵核和 3 个极体。 [3] 图 1.2 绒毛 膜发 生阶 段的 透射电 子显 微图Regier 等,1982 [3] Fig. 1.2 Transmission electron micrograph of the stage of choriogenesis Regier, et al. 1982 1.1.2 家蚕 卵的突变体 家蚕在卵的形成过程中 由于基因突变而产生 了卵突变体, 有些突变体具有致死性, 它们分别在 卵的大小形状、绒毛膜的颜色和结构、卵黄的颜色等 表型上发生了变化 。 1.1.2.1 卵 形突变体 n n 小形卵 sm small egg 和无卵 sm (no egg type )是一对等位基因。在 sm 中,雌 性家蚕 的卵母 细胞、滋 养细胞和滤泡 上皮细胞 的发育 异常, 卵黄的积 累 受阻 ,最终导 致卵的 死亡 。在 sm 中, 其体积不及正常卵的一半,卵管和卵壳构造异常,且不能受 精、不能形成 胚子及浆 液膜。它的致 死可能是 卵黄原 蛋白不 能顺利透 过卵巢,而使卵 内缺乏卵黄。 第二小卵 sm-2 small egg-2 产下 的卵 因缺少卵黄球蛋白而 致死, 其卵巢 的重量和蛋白 组分在卵 巢发育期间保 持 不变。 突变体中的脂 肪体合成 卵黄原蛋白后分 泌到血淋巴中 ,但是不 能被卵巢 吸收 ,因此血 淋巴中的卵黄 原蛋白浓 度很高。 第三小 卵 sm-3 small egg-3 产下的卵 和 sm 的大小类似 ,产下的数量和正常的产卵数量没有 [4] 区别,但其卵 因缺少卵黄粒而致死 。 纺锤死卵 l-sp (lethal-spindle egg )倾向于形成 双受精和多倍体 ,致使卵 不能正常 发育 , 在胚 子发生 初期 致死 。 肾形 卵 突变 体 ki (kidney ) 中, 同质 型 母蛾产 卵呈 肾脏 形,其形状的 畸形有滤 泡细胞异常所 导致,无 论胚子基因为 同质型还 是异质型,其胚 c 子中胚层结构均不能形成而致死。 与 ki 具有相 似的表现还有筑紫肾形卵 (Ki ) 和玉泽 t 肾形卵(ki ) 。 3 江苏科技大学理硕士学位论文 1.1.2.2 卵黄色 突变体 卵黄素缺乏 卵 vit scanty vitellin ,其产下的卵 由于缺少卵黄蛋白 而 为纯白色,进 一步分析后显示该突变的卵具有大量的卵特殊蛋白(ESP ) 但 缺少大的卵 黄粒。该卵 可以 受精, 却不能够孵化 而最终致死。 1.1.2.3 卵壳突变体 16 B K col 灰色卵 (Gr)、 欧 16 灰色卵 (Gr ) 、 鸟 眼卵 (Gr ) 、 桂灰卵 (Gr )和 溃卵Gr B col 是一组复等位基因群,其中 Gr 和 Gr 表现 出卵致死现象,前者是由受精的卵孔缺 col 乏而导致的, 后者 Gr 是一种卵壳蛋白缺失引起的 突变体。 该突变体的卵壳很薄且疏 col 松, 其卵在产下后不久便失水凹陷致死, 研究显示 Gr 的绒毛膜蛋白在绒毛膜发生前 中期 能正常 合 成和积累 ,合成速率和 时间上与 正常绒毛膜发 生没有差 异,但后期绒毛 [5] 膜蛋白逐渐消失。 因缺少绒毛膜蛋白而不能形成正常 的绒毛膜而致死 。 1.1.2.4 卵黄膜 突变体 在实用品种“ 苏? 菊× 明? 虎” 母本品系“ 明” 的生产和保存过程中发现 的一种突变体 (图 1.1) ,其卵在产下在 很短时间内即发生失水凹陷,1 小时左右即完全 失水 溃死。 卵壳表面凹陷 处小室的 边缘有明显的 裂纹,卵 壳纵断面中间 层亦出现 不连续的裂缝。 [6] 该突变 是 隐 性 基 因 致 死, 遵 循 家 蚕 卵 壳 性 状 的伪 母 性 遗 传 规 律 。 陈 安利 等 的研究证 m 实了卵黄膜蛋白 BmEP80 基因的突变是导致 l-e 卵突变体产生的主要原因 。 m [6] 图 1.1 野生 型卵 与 l-e 突 变体卵 的对 比图Chen anli 等,2013 m [6] Fig. 1.1 Appearance shape of the wild type and the l-e mutant Chen anli, et al. 2013 m m A 野生 型B l-e 突变 体 A wild type B l-e mutant 1.1.3 激素对家蚕卵巢发育的调节 1.1.3.1 蜕皮激素 蜕皮激素Moltinghormone ,MH 在诱 导 家蚕卵 巢发育 方面发挥着重要 的作用 。微 克级的 MH 就会引起卵巢结构的形态学 变化, 针对除去 内源 MH 的蛹, 当 MH 注射后, 保护性的卵巢被膜很快破裂, 卵巢管逐步伸长进入腹腔。 从分子水平的研究显示,MH 首先结合到 核受体(BmUSP ) ,即 BmCF1 和蜕皮激素受体(BmEcR )组成的复合物 4第 1 章 绪论 上,MH 与 EcR/USP 结 合到靶基因上游启动子区的 MH 应答元件上, 调节相关的下游 基因的表达发 生变化 , 诱导初级应答 靶基因的 表达,初级转 录因子调 节了大量下游的 次级应答基因 的表达, 而次级应答因 子调控了 发育时期或组 织对激素 信号的特异生物 [7, 8] 学应答 ,进而导致 一系列有序的 发育 。 对发育停滞的家蚕腹部 注射 MH ,在 1 小时内,MH 应答的早期基因开始在卵巢 [9] 中表达, 包括蜕皮激素受体和一些核受体, 如 BmE75A 和 BmE75C 。在 2-4 小时内, [10] 核受体 BmHR3 的 B- 和 C- 两亚型开始了少量表达 , 同时与另一 个核受体 BmFTZ-F1 [11] [12] 的下降表达 保持同步 。在 6-24 小时内, 核受体 BmHNF-4 开始表达 。 在卵黄发生 前期向卵黄发生期转变过 程中, 特殊卵蛋白 (egg-specific protein , ESP ) 的表达标志着 卵黄发生阶段 的开始, 其 表达同时在 MH 滴度达到顶峰后 才进行;而 ESP 的基因的表 达推迟, 它的延迟应答暗示了 ESP 没有受到蜕 皮激素的直接诱导。 然而在 ESP 表达过 [13] 程 中 , 与 其 密 切 相 关 的 是 晚 期 蜕 皮 激 素 应 答 核 受 体 BmHR3A 。 另 外 , 转 录 因 子 BmGATA β在卵黄发生 前期转向卵黄发生期过程中表达变化 也很大。 在化蛹初始 阶段里, 卵巢受到 MH 的调控是 明显的; 然而在卵黄发生转向绒毛膜 发 生 阶 段 , 绒 毛 膜 的发生 只有 在 MH 滴 度 降 到 很 低 时 才 进 行 。 在 体 外 实 验 中 , 添加 [14] MH 没能实现使卵的发育 从卵黄发生向绒毛膜发生阶段转变 。这也 意味着此阶段不 需要 MH 的调节。在绒毛膜发生早期,蜕皮激素的异源二聚受体 BmEcR/BmUSP 和 [15] BmE75C 的表达都下调 ,研究显示该阶段也不受 MH 的调节 。 1.1.3.2 保幼激素 除了蜕皮激素 对昆虫卵巢的发育调节作用 外,保幼激素 (Juvenile hormone ,JH ) 对部分昆虫的卵巢发育也发挥着重要的调节作用 。在家蚕中 JH 对家 蚕 卵巢发育有调 节作用 还少见 报道 。在 不同的昆虫物 种中, 调 节卵子发生的 主导激素 也不同。在果 蝇 属中,MH 和 JH 共同调节卵黄的发生 ,JH 刺激了卵巢中的卵黄蛋白的合成 ,同时刺 [16] 激蜕皮激素的产生。在天蛾中,JH 控制绒毛 膜的发生 。 1.1.3.3 滞育激素 滞育激素(Diapause hormone ,DH )是控制家 蚕胚胎滞育的激素,它由咽下神经 节的神经分泌细胞分泌。DH 主要的靶标器官是卵巢, 在家蚕研究中发现,DH 可以诱 导家蚕进入卵滞育。海藻糖酶是 DH 调控代谢过程中的关键酶,DH 在卵巢发育的重 要时期,通过 与滤泡细 胞膜上的受体 结合,提 高了海藻糖酶 的活性, 使血液中的海藻 [17] 糖转化成葡萄糖, 葡萄糖进入卵母细胞进一步合成糖原从而诱导卵滞育的发生 。此 外,DH 还可 通过 调节 卵巢和 滞育卵 内蜕 皮激 素的生 成量来 控制 滞育 卵与非 滞育卵的 形成。 5 江苏科技大学理硕士学位论文 1.1.4 基因差异表达研究进展 在某一类型 的细胞中 的 特定发育阶 段 ,只有 部分 基因被选 择性表达 , 这种选择 性 表达是在发育 过程中细 胞分化的结果 。差异表 达不仅受生物 体内在机 制的调控 ,也受 外界环境因素的影响。 它将最终控制生物的形状和生理过程 , 是调控细胞生命活动过 程的核心机制 。所以研 究不同细胞或 同类细胞 在不同发育阶 段、不同 生理状态下差异 基因的表达状 况 ,对调 控生物的 生长 发育各阶 段及代谢途径 具有重大 的理论和实践意 [18] 义 。 随着分子生物学 技术的深入发展 , 基因组研究重点已经由基因组测序转向基因 功能鉴定 , 即 由结构基 因组学向功能 基因组学 转变。 差异表 达基因筛 选方法按照其技 术特点分为三类: 1、 利用 PCR 技术为主要技 术的 有 mRNA 差异显示 PCR (DD-RTPCR 和代表性差异分析RDA 技术;2、 利用杂交 技术 的主要有 Northern blotting 、 抑制性消 减杂交SSH 和 DNA 微 阵列DNA microarray 技术;3、利用测序技术的主要有 表达序 [19] 列标签(EST 、基因表达连续性分析SAGE 、 数字化基因表达谱DGE 技术等 。 1.1.4.1 mRNA 差异显示 PCR [20] 1992 年 Liang 等 创建 了差异显示 PCR differential display RT-PCR ,DDRT-PCR 方法此技术是以 PCR 技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础 , 结合银染或放射性自显影等 [21] 显色技术 , 能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因 。因为在 真核基因的 mRNA 3' 端具有一个特征 是: 多聚腺苷酸 polyA 尾结构。反 转录 不同来源的总 mRNA 以合成 cDNA ,该 cDNA 的合成采用 oligo dT 12MN 为引 物, 其中 M 为 C ,G ,A 的任何一种,而 N 为 C ,G ,A 或 T 中的 任 何 一 种,一共有 12 种 该引物,其中 M 的作用是锚定碱基增大引物的 退火温度,N 为分类碱基 ,对反 转录进行分类 。 利用该 12 种的引物分别对相同 总 mRNA 样品进行反转录 , 得到 12 种 类型的 cDNA ,即将总 mRNA 归为了 12 个 不同的实验组。 在此基础上 ,对每一组的 cDNA 进行随机引物的 扩增以及 相应的反转录引物 进行的 PCR 扩增, 扩增的 cDNA 片 段都有 放射性 同位素 的 标记,因而通过利用放 射自显影技术 对 其扩增 的产物进行凝胶 [22] 电泳分析 , 从而可以对 不同样品间的基因选择性表达情况进行研究 。 mRNA 差异显示技术能同时进行两组或两组以上样品的分析比较 , 检测基因的上 下调表达 ,具有短时间 、高灵敏性 、 简便操作 等优点 ;不过 它也有明 显 不足 之处,例 如较 高的假阳性、 重复性 问题、 扩增片段长度限制 、 低拷贝数 mRNA 不容易得到 分离、 [23] 3'端的 差 异基因 容易检测 ,但 5' 端 的差 异 基因 很难检测 等 ,这也是由该方法 本身的 原理所决定的 。 1.1.4.2 代表性差异分析RDA 技术 [24] 1993 年 Lisitsyn 等 建 立 了 第 一 种 以 PCR 技 术 为 基 础 的 消 减 杂 交 技 术 , 随后 6第 1 章 绪论 [25] Hubank 等 又将其改 进为 cDNA-RDA。将 实验组的 mRNA 逆转录为 cDNA ,利用识 别 4 或 6 个碱基的限制性酶酶切 消化。 在 5’ 末端接上寡核苷酸接头进行 PCP 扩增, 换 接头后与过量对照组 cDNA 混合, 经变性、复性去除两者的共同部分, 将双链两端都 含有的差异分 子作指数 放大,最后通 过电泳分 析将占优势的 差异分子 克隆到载体等方 [26] 法获得新分子基因 。 这种方法 mRNA 用量少 , 特异性高, 但有缺点 : 实验组低丰度的分子自身杂交的 几率很低 , 所以被扩增和克隆的几率仍很低 ; 酶切连接步骤太多 ,cDNA 会损失很多, [22] 所以可能漏掉关键基因; 得到的不是 cDNA 全 长而是其酶切片断 。 1.1.4.3 抑制性消减杂交 [27] 抑制消减杂交技术是 1996 年由 Diatehenko 等 建立的以抑制性 PCR 为基础的 cDNA 消减杂交方法。SSH 是利用抑制性 PCR 能选择性指数扩增不同丰度差异基因和 cDNA 消减杂交建立起 来的方法 ,运用了杂交二 级动力学原理即高丰度序列退火时产 生同源杂交的速度大于低丰度序列 ,使原本在丰度上有差异的 DNA 序列的相对含量 趋于一致。 因为抑制性 PCR 链内的退火优于链 间 的退火, 使两端接上同一接头的非目 的基因片段 , 后者具有反向重复序列 , 因而在退火时易形成发卡状互补结构 , 在 PCR 中, 模板与引 物 不能配 对扩增 ,从而 可以对扩 增目的基因进行选择而 抑制 了非目的基 因片段扩增 。 实验组和对照组之间的同源序列 被 去除, 同时结合抑制性 PCR 的动力学 [28] 富集 ,丰度较低的特异性非同源片段 而得以高效地分离 。 SSH 技术是一种快速有效分离差异表达基因的方法 ,与其它消减杂交技术 相比 , SSH 技术具有假阳性率低、高度敏感性、操作简单、筛选周期短和具有通用性重复性 等优点。但仍不可避免地存在一些不足:1、对于某些特殊材料 ,大数量的 mRNA 可 能不易获得。 2、 消减杂交需要对样本进行限制酶消化 , 消化后样本不再是全长 cDNA , 可能影响结果 的准确性 。3、无法筛 选完全无 酶切位点或酶 切位点比 较少的基因。4、 对材料要求较高 , 材料的背景差异不能太大 , 最好是只有细微差别。5、 一次只能对 2 个样品进行杂交 , 不能 同时研究多个材料或多个样品。 6、 接头连接等 过程中会有 cDNA 的损失。7 、该技术尚不能实现较长 cDNA 序列 如 600bp 的有效均 等化。8、仍然存 在一定的假阳性率。 1.1.4.4 DNA 微阵列DNA microarray 技术 上世纪 末, 半导体芯 片 制作技术 已 经普及, 人们 可以在芯 片上集成 晶 体管, 科学 [29] 家们据此 提出 在芯片上集成寡核苷酸分子的设想 。1996 年美国的 Stephen Fodor 等 利用一种光敏 材料,将 其涂布在 硅芯 片表面, 在光 的引导下 ,原位合 成多肽链,合成 [30] 了 DNA 阵列,第一块 DNA 芯片就这样诞生 了 。 2 基因芯片是 在某种固相载体 通常为 1cm 左右的硅片、 尼龙膜 片、 玻 片 上通过微 7 江苏科技大学理硕士学位论文 阵列方式高密 度 且有序 地排列大量 的 基因或寡 核昔酸片段, 是一种可 以用来 检测某种 特定基因表达 的技术。 基因芯片的 基 本原理 是 碱基互补 和分 子杂交。 首先 在固相支持 物上固定大量的探针 DNA 分子,然后将芯片上的探针样品与不同荧光标记的序列进 行杂交,洗去 固相支持 物上 没有发生 互补结合 反应的片段, 借助计算 机系统对激光共 聚焦显微镜扫描 后的荧光信号强弱进行分析处理, 从而 分析出样品中基因的定量信息。 基因芯片具 有芯片点 样 密度远远高 于膜的点 样 密度,样品 用量少, 信 息量大 、 芯片可用双色 荧光标记 两种探针,这 样大大提 高了数据准确 性、芯片 杂交体积小,灵 敏度高、芯片 具有表面 平整性好、硬 度大、透 明等特点,更 容易自动 化。但是也存在 一些缺点:1、 探针杂交的适合条件 并不通用, 含有多种探针的同一芯片最适条件难以 控制 。2、在某些特定 碱基序列条件 下,容 易 产生假阴性 的 结果。3 、当靶序列中 具有 一些重复序列时, 探针 不容易将其区分。4、 在寡核昔酸存在 某些复杂的高级结构 或存 [31] 在自身配对 的情况下, 分析结果会受到很大的影响 。 1.1.4.5 表达序列标签(EST ESTs 是对一个 cDNA 克隆测序获得的部分片段, 它为发现新基因, 揭示基因表达 [32] 以及调节信息提供了一种快速、 有效的途径 。 一个全长基因转录本的 cDNA 序列可 能包含多个重叠的 EST ,一般长 300-500bp,通常作为基因的标志。由于 cDNA 文库 的复杂性和测序的随机 性,有时多个 EST 代 表同一基因或基因组, 通过对所有 EST 分析,形成 EST 簇, 每一个 EST 簇独立代 表特定的基因。随着大规模、高通量 ESTs [26] 测序的进行,ES