日本蟳血淋巴细胞的初步研究_cropped

日本蟳血淋巴细胞的初步研究_cropped 日本虫寻血淋巴细胞的初步研究 赵青松 ,陈惠群 ,王春琳 ,陈寅儿 ()宁波大学生命科学与生物工程学院 315211 摘要 :对日本虫寻血淋巴细胞有形成分进行显微观察分析,根据细胞大小 、有无颗粒及颗粒的大小进行分 类 。结果明 :日本虫寻血淋巴细胞可区分为3 种 ,即大颗粒细胞 、小颗粒细胞和无颗粒细胞 。在此基础上比 较了不同性别 、不同发育阶段及饥饿状态下 ,日本虫寻血淋巴细胞的形态 、密度及 3 种类型细胞所占比例等指 标的数据变化 ,并与其他甲壳动物的血细胞进行了比较 。 关键词 :日本虫寻; 血淋巴细胞 ;血细胞密度 ;细胞分类 () 文章编号 :1003 - 1278 200503 - 0013 - 02 中图分类号 : S96611 文献标识码 :A ( ) 及细胞的体积可分为 3 类 : 无颗粒细胞 、小颗粒细胞 、大 日本虫寻 Cha rybdis j aponica隶属甲壳纲 、梭子蟹科 、 虫寻属, 俗称海虫寻 、石蟹等 ,是一种大型经济食用蟹 ,随着 颗粒细胞 ,具体分类结果见表 1 。雌性日本 虫寻血淋巴细 其需求量的不断增加 ,人工养殖迅速发展 。目前国内外 胞密度略高于雄性 。在 3 类血细胞中 ,小颗粒细胞最多 , 有关日本虫寻 的研究资料主要集中在其形态 、生态 、人工 占细胞总数的 78114 % ;大颗粒细胞次之 ,占 14 . 40 % ; 而 1 ,5 养殖及组织学等方面, 而有关血液学方面的研究资 无颗粒细胞最少 ,占 7 . 48 % 。 ?料至今未见 。由于甲壳动物血淋巴细胞的种类 、数量 、组 表 1 日本虫寻血淋巴细胞的计数 成与动物生理状态和免疫功能密切相关 ,为此 ,作者对日 ( )( )雌性 ? 雄性 ? 总值 细胞 显著性 ?SD X 本虫寻血淋巴细胞的形态与数量进行了分析,以期为今 后 X ?SD X ?SD 3大颗粒/ % 16 . 12 ?2 . 78 12 . 72 ?3 . 45 ?2 . 61 14 . 40 0 . 024 日本虫寻的人工养殖及病害防治提供基础资料。 0 . 876 小颗粒/ %77 . 37 ?2 . 12 78 . 84 ?3 . 8878 . 14 ?3 . 071 材料与方法 0 . 087 6 . 51 ?1 . 25 8 . 44 ?0 . 877 . 48 ?1 . 43无颗粒/ % 细胞密度/1 . 1 实验材料 0 . 175 1 . 72 ?0 . 23 1 . 60 ?0 . 47 1 . 66 ?0 . 48 7 - 1 10 mL (健康日本虫寻雌雄各5 0 尾 其中各 30 尾为性未成熟 , ? ( ) X ?SD 为平均数 ?标准差 ;带 3 p ?0 . 05为差异显著 ) 各 20 尾为性成熟,质量 100,200 g ,于 2003 年 3,5 月 2 . 2 日本虫寻血淋巴细胞的形态 取自浙江宁波象山某养殖场 ,活体运回实验室暂养 。 从形态上可看到日本虫寻血淋巴细胞可以分为 明显 1 . 2 实验方法 的 3 类 。 ?无颗粒细胞 : 核几乎占满整个细胞 ,难以区分 1 . 2 . 1 血淋巴细胞取样与计数 用注射器先吸取体积 核膜与质膜 ,核质比最大 ,整个细胞被染成紫色或紫褐色 () 图 1。 ?小颗粒细胞 :胞质中有染成淡紫色或紫红色的 分数 10 %海水甲醛溶液 0 . 2 mL ,再从日本虫寻步足基关 颗粒 ,量小且细小 ,分布较均匀 ,细胞卵圆或长圆形 ,大小 节处抽取等量血淋巴液 ,充分混合至均匀后 ,用 Neubauer 介于大颗粒细胞与无颗粒细胞之间 , 核多为椭圆形或卵 计数板计数 。 ( ) 圆形 ,染成紫色 ,常偏于细胞一侧 图 2。 ?大颗粒细胞 : 1 . 2 . 2 血涂片制作与观察 以海水甲醛与血淋巴的混 胞质中有染成淡紫色或紫红色颗粒 ,折光性强 ,细胞体积 最大呈椭圆或卵圆形 ,核椭圆或圆形 ,被染成紫色或紫褐 合液按常规法涂片 , Giema 液染色 。涂片干燥后在光学显 () 色 ,核质比最小 图 3。 微镜下进行细胞体 、细胞核的测量以及血淋巴细胞的分 2 . 3 日本虫寻3 类血淋巴细胞的大小比较 类计数 。每张涂片选取不同视野下 100 个细胞进行分类 ( ) ( ) 分别测量了 CL CS3 类血细胞的长径 及短径 、细 计数 ; 随机选取不同类型的血细胞各 30 个 ,光镜下测量 ( ) ( ) 胞核的长径 NL 及短径 N S,见表 2 。结果显示 ,雌雄个 细胞及核的长短径 。 ( 体无颗粒细胞的细胞长径存在显著差别 ,雌蟹为 8 . 50 ? μ( μ) ) 1 . 69m ,雄蟹为 11 . 36 ?3 . 10m 。其它指标均无显 2 结果与分析 著的雌雄差异 。 2 . 1 日本虫寻血淋巴细胞的计数 2 . 4 日本虫寻性腺成熟与未成熟个体血淋巴细胞差异6 提出本研究中血淋巴细胞的分类标准参照周玉等 同时对性腺成熟及未成熟的日本虫寻血细胞进行比 的分类方法 ,即依据细胞质中是否有颗粒 ,颗粒的大小以 较研究 ,每组雌雄个体各取 10 尾 ,大小近似 ,以降低雌雄 及个体大小的差异而导致的误差 , 镜检性腺成熟程度后 收稿日期 :2004 - 10 - 08 分组同时进行实验 。结果显示 ,2 种状态下的血细胞密度 收修改稿日期 :2005 - 04 - 05及 3 类血细胞组成比例无显著差异 ,但 3 类血细胞的大小 ( ) 基金项目 :浙江省自然科学基金资助项目 302440 , 宁波市 () 存在显著差异 ,尤其大颗粒细胞的差异极显著 表 3。( )青年基金资助项目 2003A62016 作者简介 :赵青松 , 1963 年生 , 男 , 高级实验师 , 主要从事水 ( ( ( )))图 1 无颗粒细胞 ×1 600 图 2 小颗粒细胞 ×1 600 图 3 大颗粒细胞 ×1 600 7 ? μ目前比较形成共识的是 Martin的分类标准 。其分类依 表 2 日本虫寻3 种血淋巴细胞的测量 m 据是根据血细胞胞质中颗粒的有无 、颗粒的大小及颗粒 ( )( )雌性 ? 雄性 ? 总值 细胞 显著性 ?SD X 的多少而进行 ,共分为 3 类血细胞 : 无颗 粒 细 胞/ 小 颗 粒 X ?SD X ?SD CL 0 . 169 18 . 59 ?2 . 43 ?1 . 67 ?2 . 56 细 胞/ 大 颗 粒 细 胞 , 或 透 明 细 胞/ 半 颗 粒 细 胞/ 颗 粒 细 20 . 90 19 . 74 大 颗 8 CS 0 . 207 9 . 86 ?1 . 429 . 60 ?1 . 939 . 73 ?1 . 78。本研究通过显微观察 ,发现日本虫寻的血淋巴细胞胞 粒 NL 0 . 104 8 . 32 ?0 . 9812 . 08 ?1 . 4610 . 20 ?1 . 52细同样可分为 3 类 ,因此也选用这一分类标准 。 胞NS ?0 . 896 5 . 89 ?2 . 167 . 14 ?1 . 126 . 52 ?2 . 08 表 4 饥饿对日本虫寻血淋巴细胞的影响 CL 0 . 711 15 . 23 ?3 . 67 ?4 . 53 ?4 . 61 16 . 11 15 . 67 小 比较项目 饥饿组 对照组 显著性 颗 CS 0 . 695 9 . 31 ?0 . 789 . 58 ?0 . 439 . 44 ?0 . 71粒 0 . 051 ×8 . 00 13 . 40 ×8 . 53 16 . 13 CL ×CS NL 0 . 322 8 . 96 ?1 . 178 . 13 ?0 . 968 . 54 ?1 . 08细 大颗粒细胞 3 310 . 14 14 . 16 比例/ %0 . 004 胞 0 . 517 NS 6 . 54 ?2 . 416 . 22 ?1 . 126 . 38 ?1 . 9030 . 704 CL ×CS ×8 . 27 9 . 20 ×8 . 61 15 . 20 CL 8 . 50 ?1 . 69 ?3 . 10 0 . 021 ?2 . 78 11 . 36 9 . 93 无 小颗粒细胞 颗 81 . 41 78 . 92 0 . 14 比例/ % CS 0 . 063 6 . 99 ?0 . 959 . 10 ?1 . 128 . 05 ?1 . 03粒 0 . 591 CL ×CS ×5 . 67 7 . 01 ×6 . 80 7 . 33 NL 0 . 154 5 . 64 ?1 . 478 . 76 ?1 . 187 . 20 ?1 . 62细 无颗粒细胞 3 3 8 . 45 6 . 92 比例/ %0 . 0047 NS 0 . 078 胞 4 . 32 ?0 . 965 . 43 ?0 . 874 . 87 ?0 . 893 3 4- 3? 3 0 . 95 1 . 64 ( ) 0 细胞密度/ 10mm X ?SD 为平均数 ?标准差 ;带 p ?0 . 05为差异显著 ??( μμCL ×CS 为细胞长径 ×短径 ,单位为m ×m ,带 3 3 p ? 表 3 日本虫寻不同发育阶段血淋巴细胞差异 ) 0 . 01为差异极显著 细 胞 性成熟 性未成熟 显著性 3 . 2 各类血细胞所占比例及雌雄差异3 3×10 . 87 14 . 20 ×9 . 73 16 . 93 ×CS CL 0 . 001 在光镜下随机选取血涂片视野 , 对各血细胞 类 型 进 大颗粒细胞 12 . 12 12 . 27 0 . 415 比例/ %行粗略统计 。结果显示 : 大颗粒细胞 、小颗粒细胞及无颗 3 3×CS ×8 . 07 8 . 53 ×6 . 07 0 . 01 CL 111 . 93 小颗粒细胞 粒细胞等 3 类 血 细 胞 分 别 约 占 血 细 胞 总 量 的 14 . 40 % 0 . 541 比例/ %76 . 22 75 . 78 378 . 14 %、7 . 48 % 。这 一 结 果 与 同 属 甲 壳 动 物 爬 行 亚 目 ×CS ×6 . 80 7 . 20 ×6 . 09 CL 8 . 53 0 . 041 无颗粒细胞 6 梭子蟹科的三疣梭子蟹血淋巴细胞组成比例 近似 , 而 0 . 758 11 . 64 12 . 95 比例/ %8 ,11 4- 3 1 . 17 1 . 26 0 . 495 与游泳亚目中虾类的血淋巴细胞组成比例存在显著 细胞密度/ 10 mm ?的差异 ,说 明 分 类 地 位 越 近 , 血 液 组 成 成 分 差 异 相 对 越 ( μμCL ×CS 为细胞长径 ×短径 ,单位为m ×m ,带 3 p ? ) ( ) 小 ,反之 ,差异越大 。在性别差异方面 , 雌性 个 体 的 大 颗 0 . 05为差异显著 , 带 3 3 p ?0 . 01为差异极显著 () () 粒细胞组成比 16 . 12 %明显高于雄性个体 12 . 72 %,而 2 . 5 饥饿对日本虫寻血淋巴细胞的影响 其他 2 种血细胞无显著的雌雄差异 。这种雌雄差异是因 对饥饿状态及正常喂食状态下的 2 组日本虫寻 血细 胞进行比较研究 。选择材料时考虑了雌雄比 、个体大小 、 研究方法 差 异 造 成 还 是 由 雌 雄 个 体 不 同 的 生 理 状 态 造 性腺发育程度等因素 , 以降低这些因素可能会造成的误 成 ,还更待进一步研究 。 差 ,饥饿 6 d 后开始进行实验 。 3 . 3 性腺成熟度与血淋巴细胞的关系 2 种状态下血细胞密度差异极显著 ,颗粒细胞组成比 本研究中发现性腺的成熟度对血细胞密度及 3 种血 ( ) 细胞组成比例无显著影响 , 但对 3 种血细胞的大小有显 例差异显著 表 4 , 饥 饿 组 血 细 胞 密 度 较 正 常 组 下 降 了 著影响 ,且大颗粒细胞的差异极显著 。据此推测大颗粒 42 . 07 % ,大颗粒细胞组成比下降了 28 . 39 % ,而无颗粒细 细胞可能与个体的生长发育有关 。大颗粒细胞可能具有 胞组成比却相对有所上升 。3 种血细胞的大小无显著差 12 运动 、吞噬及杀菌免疫等功能,从而使个体较大 、性已 异 ,其原因还有待于进一步研究分析 。 2 网箱中 ,放养密度为 1 000, 1 500 尾/ m , 养至 6 , 8 cm 养殖技术2 2 转放到成鱼网箱 ,放养密度为 400,500 尾/ m,直到养成211 总体方针 100 g 以上的成鱼 。一般夏花到当年底可长成 15 cm 左右 在三峡库区网箱养殖瓦氏黄颡鱼 ,应采取健康有序 、 规格的大鱼种 ,第二年 7 月份可平均长至 100 g 左右的成 稳妥发展的方针 ,先小面积试养 ,总结积累经验 ,再通过 鱼 ,年底平均长到 200 g 左右的成鱼 。根据实际情况 ,养 示范点 ,逐步普及推广 。根据市场需求 ,将养殖规模和产 殖户也可在年初直接购买大鱼种 , 当年养成合适规格的 量控制在适度范围内 ,避免盲目过度发展 。 商品鱼上市 。 212 设置水域 215 喂养管理 网箱应架设在远离航道 、避风 向 阳 、水 面 开 阔 、水 位 网箱养殖瓦氏黄颡鱼的饲料以人工配合饲 料 为 主 。 平稳 、水 质 良 好 的 库 湾 、库 汊 中 。网 箱 总 面 积 不 超 过 库 在一级鱼种网箱中 ,可用绞碎的鱼浆投喂 ,也可以用拌成 湾 、库汊水面的 015 % 。 小湿块状的鳗料投喂 。喂鳗料要特别注意洗箱 ,防止淀 213 网箱规格 粉糊住了网目 ,也可以根据饲料来源 ,投喂鱼浆 、细鱼块 、 根据苗种规格 ,一般配套 2,3 种规格的鱼种和成鱼 鱼浆与饼粉类植物性饲料拌合成的混合饲料 、以及小沼 网箱 。一级鱼种网箱 : 用 25 目的聚乙烯 网 布 制 成 , 规 格 虾等 。在二 、三级网箱底部应铺设用密网布制作的饵料 为 2 m ×1 m ×1 m ;二级鱼种网箱 : 用 8 目双绞的聚乙烯 台 ,饲料投在饵料台上 。一般日投喂 3 , 4 次 ,每次投食 网布制成 ,规格为 3 m ×3 m ×115 m ;三级成鱼网箱 :网目 以吃八成饱为原则 ,不宜过饱 ,过饱会胀死鱼 ,也易生病 , 1,2 cm ,规格为 3 m ×4 m ×2 m 或 4 m ×4 m ×2 m 或 4 造成饵料系数增高 。日常管理主要做好洗箱 、查箱和防 m ×5 m ×3 m ,双层聚乙烯结节敞开式网箱 。用楠竹作框 逃工作 。瓦氏黄颡鱼的背 、胸鳍刺容易挂网 ,在操作中要 架 ,以旧汽油桶作浮子 ,按常规网箱架设方法固定 。一般 小心避免 。注意防病 , 发现死鱼应及时捞 出 , 查 明 死 因 , 一级鱼种网箱架设在池塘中 , 二级鱼种网箱和三级成鱼 找出对策加以解决 。定期用强氯精或石灰浆对网箱及周 网箱架设在库湾 、库汊内 。二级鱼种网箱可套放在成鱼 边水域消毒 ,鱼病季节可在饲料中加入适量的抗菌杀虫 网箱里面 。 药物 ,预防各种疾病 。只要精心喂养 ,单位面积网箱可产 2 214 鱼种放养 体重 100 g 以上的瓦氏黄颡鱼商品鱼 40,50 kg/ m,产值 2 2 一级鱼种网箱放养 115,210 cm 夏花 ,放养密度一般 960,1 500 元/ m,利润 440,850 元/ m。 2 为 2 000,3 000 尾/ m,养至 4 cm 左右 ,转放到二级鱼种 () 责任编辑 万月华 4 刘洪军 ,戴玉蓉 ,张富君 ,等 . 日本虫寻人工育苗及养 ()上接第 14 页 () 殖技术研究 J . 海洋科学 ,2000 ,24 8:23,27 . 崔3 . 4 饥饿对日本虫寻血淋巴细胞的影响分析 5 龙波 ,刘萍 ,王延波 ,等 . 日本虫寻消化系统的组织 连续饥饿 6 d 的日本虫寻血细胞密度较对照组显著减 () ( ) 学研究 J . 烟台师范学院学报 自,2000 ,16 1: 51 小 ,作者认为这与营养供应不足导致造血机能下降有关 。 ,54 . 由于甲壳 动 物 血 细 胞 在 其 免 疫 机 制 中 扮 演 着 重 要 的 角 86 周玉 ,穆占昆 ,杨振国. 三疣梭子蟹血淋巴细胞的形 色 ,因此 ,这一结果也显示了饥饿使得日本虫寻抗病 能 态 、分 类 及 计 数 J . 上 海 水 产 大 学 学 报 , 2001 , 10 力减弱 。实验结果表明饥饿组血细胞密度较正常组下降 () 3:279,281 . 了 42 . 07 % ,大颗粒细胞组成比同时下降了 28 . 39 % ,而无 Martin G G , Graves B L . Fine st ruct ure and classifica2 7 颗粒细胞的组成比却有所上升 。作者推断大颗粒细胞中 ( ) tio n of shrimp hemocytes J . J Mar p h , 1985 , 185: 的这些颗粒可能是营养物质及能源的储存物 ,当日本虫寻 339,348 .饥饿时 ,这些物质被用来维持机体生命活动而被消耗了 , 8 李光友 ,王青 . 中国对虾血细胞及其免疫研究 J . 海 从而使大颗粒细胞转变为无颗粒细胞 , 这一点有待于今 () 洋与湖沼 ,1995 ,26 6:591,596 . 后进一步探讨 。 9 蔡雪峰 , 罗琳 , 李淑珍 , 等 . 日本沼虾血细胞的初步 参考文献 : () 研究 J . 水生生物学报 ,2000 ,24 3:289,292 . 1 王春琳 ,薛良义 ,刘凤燕 ,等 . 日本虫寻几个形态参数 廖永岩 ,周友广 . 斑口虾蛄血细胞的显微观察及与 10 () 的关系 J . 淡水渔业 ,1996 ,26 增刊:39,42 . 王春 斑节对虾血细胞的比较 J . 海洋与科学 , 2000 , 24 琳 ,薛良义 ,刘凤燕 ,等 . 日本虫寻实验生态及摄 食2 () 10:14,17 .( ) 习性的初步研究 J . 齐鲁渔业 ,1998 ,15 3: 18, 于建平 . 日本对虾血细胞分类 、密度及组成 J . 青 11 20 . () 岛海洋大学学报 ,1993 ,21 1:107,114 . 王春琳 ,薛良义 ,刘凤燕 ,等 . 日本虫寻繁殖生物学的 3 陆宏达 . 中华绒螯蟹血细胞的显微 、亚显微结构及 12 初步研究 ———雌性繁殖习性 J . 浙江水产学院学 () 其分类 J . 水生生物学报 ,2002 , 9:494,500 . () 报 ,1996 ,15 4:261,266 . () 责任编辑 张俊友