ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化 ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤 类似物的分化 第28卷第1期 20cr7年1月 中山大学(医学科学版) JOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) Vl0I.28No.1 Jan.21307 ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化 刘爱军?,黄锦桃,李海标 (1.广州中医药大学组胚教研室,广东广州 广东广州 510405:2.中山大学中山医学院组胚教研室, 510080) 摘要:【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能.【方 法】Hoeehst33342标记El4一ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129 胎鼠成纤维细胞与复合凝胶一明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织.术后2周,4周,6 周,8周取材,做HE染色观察,B1整合素,CK15,CK19,CEA,CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察.【结 果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复 层上皮,毛囊样,汗腺样,皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成 的管状或泡状结构呈B1整合素,CK15,CK19,CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE 染色中汗腺样结构呈 CEA,CKI8阳性.【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在 同种小鼠皮下有分为角化复 层上皮,汗腺样,毛囊样,皮脂腺样等结构的潜能. 关键词:ES细胞;表皮干细胞;皮肤附属结构;定向分化;羊膜 中圈分类号:R329.25文献标识码:A文章编号:1672—3554(2007)01一()011一o4 DifferentiationofSkinAnalogsReconstructedthESCell-DerivedEpidermalStem CellsandDermalAnalog LIUAi-jun,HUANGJin-tao2,LIHai-biao2 (1.DepartmentofHistologyandEmbryology,GuangshouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Cuanr~ou510405,China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,SUNYat-senUniversity,Guanr#ou510080,China) Abstract:【OMeefive】 ToexplorethedifferentiationpotencyofskinanalogreconstructedtllEScell—derived epidermalstemcellsanddermalanaloginhypodermis.【Methods]El4一 KScells,labeledwithHoeehst33342,were ceeulturedwithhuman8mnion.Fourdayslater,epidermalstemcellcloneswereformed.Theskinanalogwas reconstructedwithES-derivedepidermalstemcellsanddermalanalog,whichreconstructedwith129micefetus fibroblastsandcompoundgel-gelatinsponge.Theskinanalogsweretransplantedinto129micehypodermis.The differentiationtissuesofskinanalogweresam#edat2w,4w,6w,and8w.SectionswereobservedwithHEstaining, irnmtmohistocheroicalanddi-labeledimmtmofluore~encemethotistotesttheexpressionofB1integrin,CK15, CK19,CEA,andCK18. 【Results]~cfionsshowedtubularorfollicularlikestructureformedwitllsimpleor stratifiedepithefiumat2and4weeks.Keratinizedstratifiedsquamonsepithelium,sweatglan d-like,sebaceous gland-likeandhairfollicle-likestructureswereobservedat6weekand8weekaftertransplantation.CeUslabeled byHcecbat33342,formedtubularorfollicular-likestructure,expressedB1integrin,CK15,CK19,CEAandCK18 positiverespectivelyat2wand4w.Thesweatglands-likestructureexpressedCEAandCK18positiverespectively at6wand8w.【Conclusion]SkinanalogsreconstructedwithES— derivedepidermalstemcellsanddermalanalogs candifferentiateintokeratinizedstratifiedsquamousepithelium,sweatgland-like,sebaceousglad—likeandhair follicle-likestructuresinhypodermis. Keywords:EScells;epidermalstemcells;skinappendages;eommiReddifferentiation;8mnion 【JSUNYat-senUn~v(MedSci),2007,28(1):11—14] 收稿日期:2{)06-05-25 基金项目:国家重点基础研究(9r73)基金资助项目(G1999054301—2);广东省自然 科学基金资助项目(06301387) 作者筒介:刘爱军(1972一),女,河南新乡人,博士,讲师,E-maihyB@yalloo.咖.ca;李海 标,教授,博士生导师,通讯作者. 12中山大学(医学科学版)第28卷 目前组织工程皮肤的种子细胞多采用角质形 成细胞,它只能形成表皮,不能形成皮肤附属结 构.我们先前的研究表明,胚胎干细胞(embryonic stemce11s.ES)细胞经人羊膜诱导后,分化为ES细 胞源性表皮干细胞,将其植入裸鼠皮下,腹腔及小 鼠肾被囊内均具有分化角化复层上皮,毛囊样,皮 脂腺样和汗腺样结构的潜能,表明ES细胞源性表 皮于细胞具有相当稳定的分化潜能[,因此以ES 细胞源性表皮于细胞作为组织工程皮肤的种子细 胞具有重要的研究和应用价值.在胚胎发育的过 程中,真皮对表皮及其附属物的发生,分化具有重 要作用,真皮中的细胞主要是成纤维细胞,具有分 泌细胞外基质和多种生物活性因子的功能.我们 用成纤维细胞和明胶海绵与复合凝胶组成类真 皮,观察其在皮下对ES细胞源性表皮于细胞分化 的影响,为进一步构建具有皮肤附属结构的组织 工程皮肤打下基础. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1细胞和所用材料129小鼠E14胚胎于细 胞由中山大学附二院黄绍良教授提供.人羊膜采 自中山大学附一院产房足月妊娠剖腹产的胎膜. Hoechst33342(Sigma公司);成纤维细胞培养基 (100mldL新生牛血清一高糖DMEM);ES细胞源 性表皮于细胞维持培养基(专利配方). 1.1.2实验动物孕龄12.5,14.5d昆明小鼠;清洁 级129小鼠,约2O,25g,清洁级SD大鼠,约100g, 均雌雄不拘,购自中山大学北校区实验动物中心. 1.1.3免疫组化试剂I抗:小鼠抗人B1整合素 单抗(迈新试剂公司),小鼠抗人CK19单抗,兔抗 人癌胚抗原(CEA)多抗,小鼠抗人CK18,小鼠抗 人CK15单抗,?抗及Avidin结合的SABC—Cy3 试剂盒均购自博士德试剂公司. 1.1.4真皮材料明胶海绵:由南京金陵制药厂 生产,规格:6cm×2cm×0.5cm,批号:021211. 剪成1cm×1cm×0.2cm大小,孔径大小约为 300-550m. 1.1.5自制复合凝胶将鼠尾胶原,甲壳糖,透明 质酸,硫酸软骨素(质量比7:2:0.5:0.5)紫外灯 照射下,用O.05mol/L的乙酸搅拌融解2,3h,冰 浴条件下加入O.5mL10xDMEM培养基.NaOH 调pH为7.3,终体积为4mL,4cI:储存备用.鼠尾 胶原购自广州红十字会医院,脱已酰甲壳糖,透明 质酸,6一硫酸软骨素均为SIGMA公司产品. 1.2方法 人羊膜的制备及ES细胞源性表皮干细胞的 体外诱导分化见参考文献[5]. 1.2.1ES细胞的核标记选择生长良好的对数 生长期ES细胞,将培养液换成标记培养液(ES完 全培养液加Hoechst33342-10ng/mL),置体积分 数5%CO培养箱中37cI=培养箱1,3h,吸弃标记 培养液,PBS洗3次,换ES细胞完全培养液继续 培养. 1.2.2129胎鼠皮肤成纤维细胞的培养孕龄17 d至出生前的129孕小鼠,处死后,无菌条件下取 出胚胎,去除胚胎头,四肢和内脏,剪碎躯干部分 组织,加入2.5L胰蛋白酶消化1rain,用含血清 的培养基中止消化,离心,弃上清,用培养基重新 悬浮组织,将组织接种人25cm2培养瓶,体积分数 5%CO37cI=静置培养,4,6d原代细胞长满,消化 传代,3,5代细胞用于实验. 1.2.3皮肤类似物的构建将诱导后的ES细胞 源性表皮于细胞和成纤维细胞均按1xl05个/mL 与复合凝胶混匀,滴加入明胶海绵,每块复合物体 积约1cm×1cm×0.1cm 1.2.4皮下移植实验129小鼠用40r:/L水合氯 醛腹腔注射麻醉(按1mL/100g用药),固定于手 术台上,剃去背部毛,消毒后,沿背部正中线两侧 距脊柱1cm切开皮肤,分离皮下组织,暴露肌层, 将构建的皮肤类似物埋人皮下,每只动物埋两块, 缝合皮肤,动物苏醒后饲养,共8只动物. 1.2.5组织学检查术后2,4,6,8周取材,每次 取2只动物,4块组织,用4oL多聚甲醛固定6, 8h,所得标本一半常规石蜡包埋,连续切片6 I.tm,HE染色;另一半标本300g/L蔗糖过夜,冰冻 切片,免疫组化染色,免疫组化染色按SABC—Cy3 法,行B1整合素,CK19,CKI5,CEA和CK18抗 体免疫组织化学显色,B1整合素浓度为1:30,余 I抗浓度均为1:100;lI抗浓度为1:100, SABC—Cy3荧光显色. 2结果 2.1体外培养细胞的观察 I1.:hat33342圻记l圳?乜1,3h.r荧一 制值I,r见圳?牲被,Il出乜的细胞乜 隧{I1人膜j皤甘4,5tj.仍几i虬I_乇 图lHoechs~3342摇标记I!s胞克睦 固2129胎鼠&脏成纤维胞 FigIEScellslabeled?jUIlIoechsI33342I×10{) Fig2Fihrnht~stsof129fe【uInOL~c×llII)l '表而的细J也拒隆.Jl包恢,1培乔旧}_;c 啦快成纤维细胞KIIl1_】}.l?胞饱满(2) 12大体观察 术^2.戍F州恤物帆较^II.J尤 昔变化,【包.仃缔i;!也纯.4?ii增I的 【织鳗f积增尢训,6用增走】-岛峰 23HE染色 2甘凡髓世州判二降斛啦恤.!,4『q 多nE?状上j戍I:l0许状泡状,.. f.复『I]iI戍均符舱佯玷.1啦也 列繁带{=薹也一圯硬陵与心浆帕比删-』常1 胞川,蚪常增16—f块l.际1J生 构纠】土川复J化l应邗mfL蛛汁J麒"E 栏佯作(I3^l{.ClI)等蜘.止常小 阻组织们结1,』叫!州4) 目3皮肤类似物皮下丹 Fig.3SkinAnalogsdifferentiationinh,podersIIElaili…{x!【?" ^KI,Irarift'Ill…,.[~illI_li…Ih,tII?lh…r…l_}la,r?}【-Ilk…1hill1. l…cIlk,…… 目4常I2H下组织liE,染 Fig4Ilypode~isofno~lalI29miceIII.1…』J…… 24免疫组化和免疫萤光双标 27爿纽织1町艇悄?或池状 蜘讣刷呈慷证圯(5A)B1整合素【KI5 (:Kl9疆…(5B)6J性萤矗跳ff HE啦色"}FH5}伴杵恂c6A)【EAc刊613) 圈52月茜腔样结构棱黄和【KI9免癌费光目 Fig5]'tJhular-like~lftlt'hlrPlal~eledHoecbsl33342 andCKI9pllsiti,einbypodermisjl【2weekc×fm} 】h一一.i{33342.II-f…?l_ir hI8I I I 『翌目66周&下汗腺样结构CEA免疫黄光阳性 Fi2^Nwe~l~land—likeSlnl~[ureexpre~dCEApositive inhypodermisal6weekq~2[1Ob ^…|c…Jll_II.…i1~11inoi【…I…' 3讨论 我…往的训究.,fl】I凡幢与 胞培罪.可将定同诱表皮『胞.丧 噍千细胞在排鼠虚下腔硬种129小艉盱破囊 l有ll州的仆化时即4i前弭讣化匀啦 层芷或'II皮构幢的管状和泡结构4 行化埕青为化复层l_戊伴,毛馒样和虚 脂腺洋等柑丝些结果强烈摧外州,境的政变J Es细源忡表出【II咆的舒化发育过程影f 不太}:到胞源靠应1缃胞作,纽绑T心肚 种子纠胞具柏五婴的研究应,rtJft-『i|c皮儿太m虚 和鱼皮蜘儿览.表J米源丁【丰挂卅,】J,lii】真应闩]巾 吒屋川充质讣化J肛丁H发育1I=王收应肤 轼结构.汗?l】:屯惟币?l,脂腺等郁足的|_ 发层向深层虚K分化lnJ彤城】皮肤 段其附属结构的发育形心』程__,真战川宽喷艘 {的成纤维胞首重婴怍川觑应竹f物r】_引 』止卦维细胞对于组织I程皮肤晌}q进具有重葛 意卫-.在奠应芰叶1加八成纤维胞使直应 细胞活性.加接近生状忐jr能活f水形 ,刘移愤辩,境件…反应:位真皮莲质结构成纤维 细胞的作用下序化:过成纤维钏胞晌舒泌朴党 庄替代物,缺儿L々卸f胞『_丁卡兀埘真皮替代物作 表向修饰,提高觅应特代物诱导创嗣血管内皮甜?胞 川内移』的能力,加逮向管化速度,提高其促J 表戊细咆的长仆化I麻麒成的能 我们所构成的世啵类似物tfi包腔原硫酸 辆目索睦明匝?,甲壳采埤+其中腔硫酸轼 求和透雁随垃】I俺圳胞外丛质n勺成讣.纯?奁尢 佧被脯解劬时姗illIl凡?牿降解速度F 降过足周为仆十l拄蹙联怍川甲壳特和原 复合后】以限:l歧原酶刘脞怕圳以及少峨 酶的甫接接触i遣叫质瞎打利1细眦的哦附 中K增擅硫酸精胺多特仃]/Jj丁肤附恂 的髓叫乳们,桃-I,…凡』成tTtip'Ill H包.将巫物槭I29小止1,,可E憎溯 矗应『【II啮打比他豇层l啦汗腺t鞋 脂腺样曲有研究叫成纤维细胞-叶一的盐质 辑种fill于Ej:K?子.包括1?脏啄硅 }『_桔连蚩II制1连监Iq'cF,,}等.刈粪止的 螳.利缃I_?(19K发育讣化,IIIL~K^殪 哺的J成等而邯一J能产HIm芟怍?{水研究句悔 米构让有1L理功能的几T应肤照定J'砸簦的寓 端础 参考女甜 lI帐#啡h膪圳眦太皮圳腿舒化擀 }目U.』研j#,2(104351ll:65—6R 2l搬茁j车悔h.凡川J帆去世忏 l】舒化擀I'l~lll___IIIk芋学K利#200425 fI1-I5I 3I秆{{EfIlI【【J『I表0f【I胆 】fm幢-计化泔能?川1?-…^学学 报:学学K20t~!.25131:21)42(19 4l蛙.贽锦桃康,并r细毗崔庄 0胞忖破蜒Jff廿化能『r:Jli]J…巾州R 化学0胞化芋志211(15I4i31Z~4-257 5lIICf扎m衍地球并kr惟l导幔【叫 -I』成忤胤啪,t"J竹化『J1IIf{t}}锅 2(X)l12{5l:325—328 6HL^I,I.^【lW【Jsr1Hl【i.【i1J klenil{…?it.il||_ItlInTII1lLl,)iJlJlI…?I{(IuIIP—ac1 IafM,1withhi—mli~lITiIlIbm,hii1l?1Bl?n1II1 I?t……!f)0339:(J(5[15 l7IM【IlAll,?l,}{K__JTIIIFK【JTrH《,e11J l_v…i…ll1ba^In(iiiii1I"mbnlill?lrldJl…lllv k'…1…yle…fll?l'lH^}illhIin…llIJ'?kin ckll…,elJIl1?.1u989121:3uq4… lIT^I1^vFIM1)I)"vl^III)^III?Il11l-…IWl?1lh vl?1...Jlq'haral"n"…1I【……lIb [1l[~rlll【l?t'wifi~'?川,?L{I州I1993.141I!l: 930—938 I91f:I^JH1)II:kEIISI)NkI?rECKI,:ItK【ul_ L_I[er[zaLif~llrlIJilts;thor…?i:l^(,l,^" pelllM,1.11?【hm.m…u…xl_】Bl?11.…?1I9nI7 ll?:1j0lI108 lI(11l一:s1.^1(.EMESSE《,l{^CAlI】N1J-t 'IJ?II.…IlJdvIal1Ilurim;??|l"gr,~llqh '??kinhu~nanskiJiiJJl?tI1T??il川l…6c2|= 【II95 ft}