α1-酸性糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体

α1-酸性糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体 α1-酸性糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构 体 中圄粟科久挚 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2007,38(3):243—246243 OL1-酸性糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体 杨倩,刘文英 (中国药科大学药物分析教研室,南京210009) 摘要目的:建立西酞普兰对映异构体的拆分方法.方法:采用a1.酸性糖蛋白(AGP)手性柱固定相,考察了流动相 组成,pH值,流速,柱温,有机改性剂对拆分的影响,优化后色谱条件为ChromTechCHIRAL-AGP枉(150nllnx4.0nlln,5), 流动相为50mmol/L醋酸铵缓冲液(乙酸调节pH至4.3),流速0.8mL/min,检测波长240nlTl,柱温25?.结果:西酞普兰对 映异构体保留时间分别为6.8和8.4min,能够达到基线分离.结论:缓冲盐浓度和pH值是影响对映体分离的重要因素,同 时可以在一定范围内调节流速和柱温来提高柱效,改善分离. 关键词西酞普兰;对映体;手性拆分;dI一酸性糖蛋白 中图分类号R917文献标识码A文章编号1000—5048(2007)03—0243—04 EnantiomericseparationofcitaloprambyHPLCusing(X1一acidglycoproteinchiral stationaryphase YANGQian,LIUWen—ying Depanme~ofPharm~euticalAnalysis,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanfing210009, China AbstractAim:TodevelopachiralseparationmethodforenantiomersofcitaloprambyHPICu sing(21一acid glycoprotein(a】一 AGP)chiralstationaryphase.Methods:InfluencesofthepHvalueofthemobilephase,thekindand concentrationofthebuffersolution,organicmodifiers,theflowrateandthecolunmtemperatureontheenantiomeric separationofcitalopramusing(21-AGPchiralstationaryphasewereinvestigated.Results:Citalopramenantiomerswere separated0nan(21一 AGPchiralstationaryphasecolunmusingwaterasthemobilephaseconsistingof50nmaol/L NH4Acbuffer(pH=4.3)ataflowrateof0.8mL/min.Conclusion:IepHvalueofthemobilephaseandthe concentrationofthebuffersolutionareveryimportantparametersintheoptimizationoftheenantiomericseparationof thecationicracemates.Highercolumnefficiencycanbeachievedwithlowerflowrate. KeyWOrdscitalopram;enantiomers;enantiomericseparation;(21一acidglycoprotein 氢溴酸西酞普兰(citalopram,结构式见图1)是 选择性5一羟色胺再摄取抑制剂,对内源性和非内源 性的抑郁症均有较好疗效,已成为抑郁症治疗的一 线药物…1.西酞普兰分子中存在一个手性中心,临 床上现多以消旋体给药.西酞普兰右旋体即S一西 酞普兰(escitalopram)的药理活性至少是R型的100 倍l.2002年,作为单旋体给药的S一西酞普兰在 瑞士上市.我国目前也在积极开发单旋体给药形 式,以达到减少剂量和不良反应及提高疗效的目 的.因此,研究西酞普兰对映异构体拆分方法有助 于药品的质量控制.有文献报道,采用Chiralpak NC F CH, l N \ CH-HBr Fig.1Structureofcitalopram AD—H手性柱[2]和Chiralcel0D—H柱[]配合正相系 统拆分西酞普兰;使用ChirobioticV手性柱以甲醇一 乙酸一三乙胺为流动相,需18min才能完成拆分[; HanptD[53应用AGP手性柱配合更复杂的流动相系 收稿日期2006—12—07通讯作者Teh025—8327d251E-mail:1wcpu@126.tom 244中圊粟科火警JournalofChinaPharmaceuticalUnive第38卷 统达到拆分的目的,而且未对分离因素进行研究. 本文建立了a一酸性糖蛋白(AGP)手性柱固定相分 离西酞普兰对映异构体的方法,简化了流动相组 成,分析时问缩短为10min,并从流动相组成,pH 值,流速,柱温,有机改性剂等多个方面优化了对映 体分离的条件,并对保留进行了初步探讨. 1材料 1.1仪器与试药 Agilent1100series高效液相色谱仪,1100UVD 紫外检测器,1100自动进样器,Agilent化学工作站 (美国安捷伦公司). 氢溴酸西酞普兰对照品(浙江黄岩东升医药化 工有限公司,纯度99.7%);草酸艾司西酞普兰对 照品(合肥合源医药科技有限公司,纯度大于 99.0%);乙腈(色谱纯,美国默克公司);异丙醇(色 谱纯,山东禹王化学试剂厂);其他试剂均为市售分 析纯. 1.2对照品溶液的配制 精密称取氢溴酸西酞普兰对照品约12mg,甲 醇溶解,再用去离子水稀释成50t~g/mL西酞普兰 溶液. 2方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱:Chiral—AGP柱(1501Tlln×4.01Tlln,5 btm,ChmmTechSweden);流动相:以醋酸铵缓冲液 (pH4,6,浓度为20,60mmol/L)为主体,选择异 丙醇和乙腈为有机改性剂;流速:0.8mL/min;检测 波长:240nm;进样量20. 2.2醋酸铵缓冲液pH值对对映体分离的影响 在室温条件下,以20mmol/L醋酸铵缓冲液作 为流动相主体,流动相流速0.8mL/min,用冰醋酸 调节pH分别为4.0,4.3,4.5,5.0,6.0,考察pH变 化对拆分对映体的影响.结果明随着pH的升 高,容量因子增大,保留增强而分离度(Rs)下降. DH为6.0时30min内未见出峰(结果见表1). 2.3缓冲盐种类及浓度对分离的影响 在室温和流动相流速为0.8mL/min条件下, 分别考察了磷酸二氢钠缓冲液(磷酸调节pH至 4.3)和醋酸铵缓冲液,结果表明磷酸二氢钠缓冲液 对对映异构体的拆分能力明显弱于醋酸铵缓冲液. 实验中分别尝试了5,25和45mmol/L的磷酸二氢 钠缓冲液,虽然随着缓冲盐浓度的增加分离度逐渐 改善,但始终没有达到基线分离(见图2),且因为 磷酸盐难以挥发,使其在某些仪器上的使用受到限 制,因此我们选用醋酸铵缓冲液并考察缓冲盐浓度 变化对容量因子,分离因子及分离度的影响. Tab.1EffectofpHvalueontheseperationofcitalopram 1,k2:capacityfactorofthefirstandthesecondpeak;a:relative retention;Rs:resolution Fig.2Chromatogramofcitalopramenantiomerswith45mmol/LNaH2P04 buffer(pH4.3)asmobilephaseat25.C Tab.2Effectofan~nonimnacetateconcentrationoiltheseperationof citalopram 由表2可见,改善分离度可以通过增加缓冲盐 浓度实现,随着缓冲盐浓度增加,容量因子,分离因 子及分离度逐渐变大,当缓冲盐浓度大于等于4JD mmol/L时,可以达到基线分离.当浓度大于50 mmol/L时,分离度变化不显着.这个结果提示,在 一 定范围内离子强度对西酞普兰对映异构体的分 离和保留有一定影响.一般情况下,AGP柱所使用 的缓冲盐浓度是0,100mmol/L,达到分离要求的 情况下尽量选择低浓度缓冲盐,故本实验最终选择 了50mmol/L的醋酸铵缓冲液作为流动相. 2.4柱温变化对分离的影响 以50mmol/L醋酸铵缓冲液(pH4.3)为流动 相,流速0.8mL/min,考察柱温变化对分离的影响. 第3期杨倩等:n一酸性糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体 Tab.3EffectofcolumntemperatureORtheseperationofcitalopram 由表3可知,柱温升高使容量因子变小,对分 离因子和分离度影响不明显.这是因为当柱温升 高时,溶质在固定相和流动相之间传质速度变快, 保留时间变短,同时半峰宽变小,峰形改善.两者 综合作用对分离度影响较小.因此,在手性柱拆分 西酞普兰的实验中,改善柱温不能明显改善分离, 且AGP柱在满足分离要求的情况下,尽量采用较 低柱温.综合考虑本实验选用25?柱温. 2.5流动相流速对分离的影响 在室温下以50mmol/L醋酸铵缓冲液(pH 4.3)为流动相,考察在0.6,0.7和0.8mL/min流速 条件下西酞普兰分离情况.结果发现当流速由 0.6mL/min升至0.8mL/min时,分离度由1.82下 降至1.77,a值基本保持不变(约1.30).由此看 出,降低流速可以改善分离度,这是因为溶质和蛋 白质类固定相结合是一个相对较慢的动力学过 程E6j,在低流速时,溶质与固定相作用更充分,而使 柱效增加,分离改善.考虑到分析所用时间且在 0.8mL/min时对映体已可以达到基线分离,因此 最终选用该流速. 2.6有机改性剂种类及比例对分离的影响 在室温下以50mmol/L醋酸铵缓冲液(pH 4.3)为流动相主体,分别以乙腈和异丙醇为改性 剂,流速在0.8mL/min的条件下进行考察.结果 显示:当乙腈.醋酸铵缓冲液比例为(2:98)时保留 减弱,分离度降至0.78.流动相中加入2%异丙醇 时,对映体完全不能分离. 综上所述,分离西酞普兰对映体的最佳色谱条 件是:流动相:50mmol/L醋酸铵缓冲液(乙酸调pH 至4.3),流速:0.8mL/min,柱温:25?.色谱图见 图3 3讨论 3.1Gt1-AGP柱性质 AGP柱是一种键合蛋白类手性柱,因其具有稳 定性好,柱效较高,采用反相色谱系统,拆分范围广 等优点而广泛使用.西酞普兰在AGP柱的峰形略 有拖尾,但该色谱条件下西酞普兰对映异构体出峰 顺序为型在前,S型在后,这对于检测痕量型 异构体有利,因此本实验建立的方法可用于测定西 酞普兰对映异构体的纯度检查及立体选择性药代 动力学研究. 05100510 tzrain,/min .3Chromatogramofcitaloprameflantiomers(A)andescitalopram(B) with50mmol/LammoniumacetatefpH:4.3)bufferasmobilephaseat 25? 3.2pH对分离和保留的影响 使用AGP柱时pH值的范围是4.0,7.0,而 AGP的等电点为2.7,即当pH大于等电点时,AGP 带负电荷.西酞普兰是弱碱性药物,在pH小于 7.0时带正电,其保留机制是正负电荷的静电作用 而产生l.随着pH的升高,AGP所带负电荷增 加,与西酞普兰作用加大,导致保留时间延长,峰形 变宽,但选择性下降,分离度变小,因此仅依靠调节 pH值无法完成对西酞普兰对映异构体的拆分. 3.3AGP手性柱分离机理探讨 目前普遍认同的手性分离机制是由Dalgliesh 首次提出的三点相互作用识别模型理论_8j,即手性 识别至少需要手性固定相和对映体之间存在三点 相互作用,而且至少有一点作用与其它两点不在同 一 平面上.对于AGP手性柱,这种相互作用主要 包括氢键效应,疏水效应和静电作用.流动相中改 性剂能够和溶质竞争在固定相上的氢键结合位点, 同时可以减弱固定相和溶质问的疏水作用使保留 时间缩短,从而影响溶质在固定相上的手性选择 性_6_6.氢键作用和疏水作用减弱也是使手性柱对 西酞普兰对映体分离度明显降低的主要原因. 参考文献 [1]杜瑜(DuY),李焕德(LiHD).抗抑郁新药西酞普兰的药代 动力学[J].中国临床药理学杂志(ChinJClinPharmaco1), 20o5,21(4):307—310. 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[8]DalglieshCE.Theopticalresolutionofaromaticaminoacidsonpaper chmmatogramslJj.JChemSoc,1952,137:3940—3942. 新型复方制剂Atripla将占市场主导地位 巨大的市场潜力加速了新药研发进程,虽然该市场已较为成熟,但据预测在未来10年中,HIV 市场将经历重大改变,几种已上市或即将上市的新药将改变目前状况,展现出良好的前景. Atripla是全球第一个将分别来自两个不同类别的3种艾滋病治疗药物合为一体的药物,含有依 发韦仑(efavirenz,Sustiva),恩曲他滨(emtricitabine,Emtriva)和替诺福韦酯(tenofovirdisoproxilfumarate, Viread)3种活性成分,2006年7月首次获得FDA批准上市.Atripla是复方制剂,每日只需服用1次, 因此,它的上市对于艾滋病的治疗具有极其重要的意义. 新生代治疗药物各具特色 1.核苷类逆转录酶抑制剂是最主要的一类,对市场的推进作用举足轻重; 2.CCR5抑制剂,整合酶抑制剂等新类别药物的作用亦不可小觑. 辉瑞公司的CCR5抑制剂mamviroc(Celsentri)和默克公司的整合酶抑制剂rahegravir(Isentmss)就 属于新类别药物,预计这两种产品分别于2007年和2008年进入市场. mamviroe和rahegravir等均是可生物利用的El服药物,且价格亦相对低廉,因此,这些药物一旦 上市,将会对老药恩夫韦地构成竞争. 其他类药物 由美国Tibotec公司研究开发的rilpivirine(TMC一278)和danmavir(Prezista)在未来抗HIV市场中被 看好. rilpivirine作为继恩夫韦地之后的第2个非核苷逆转录酶抑制剂,对于常见的NNRTI耐受HIV病 毒株显示出了较强的活性,目前rilpivirine尚处于?期临床.而danmavir已于2006年7月15日首次 在美国上市.该产品为蛋白酶抑制剂,通过检测患者血液中的HIV病毒水平,darunavir与低剂量的 利托那韦(Ritonavir)联合使用可显着提高HIV患者的生存率. (摘自中国药网,本刊有删节)