废次烟叶中茄尼醇的提取工业

首先建立了一种能较准确测定烟叶中游离茄尼醇含量的方法，并以此法测定了各种烟叶中游离茄尼醇的含量，结果表明：废次烟叶中的游离茄尼醇含量仅略低于上等烟叶，烟梗也较具有提取价值。采用正相高效液相色谱法定量茄尼醇含量并建立了茄尼醇的薄层层析快速定性分析方法。 其次研究了超临界CO2流体萃取法和有机溶剂萃取法提取废次烟叶中茄尼醇的工艺。单因素实验考察萃取过程各主要影响因素的基础上，正交实验优化得到了各自的较佳萃取工艺条件，在各自较佳工艺条件下分别进行实验得出：超临界CO2流体萃取法所得茄尼醇的提取率为1.28%，得率为：92.1%；有机溶剂萃取法所得茄尼醇的提取率为1.25%，得率为：90%。结果表明：超临界C02流体萃取法与有机溶剂萃取法相比具有溶剂消耗量少、萃取时间短、对茄尼醇的提取率高等优点，更适合于提取废次烟叶中的茄尼醇。 确立了茄尼醇粗萃物的皂化工艺条件，皂化液经水洗、稀盐酸中和、分层，茄尼醇含量可达52.6%。 最后研究了两种茄尼醇粗品纯化工艺。经100-200目硅胶柱吸附，不同浓度的石油醚-丙酮混合液梯度洗脱，丙酮重结晶，真空干燥，茄尼醇纯度由52.6%提高到了93.5%，达到了制药的纯度要求，该工艺过程简单，纯化效果好；探索了分步重结晶法纯化茄尼醇粗品的新工艺：皂化后茄尼醇粗品经丙酮、甲醇、乙腈分步重结晶，真空干燥，获得了含量为90.5%的茄尼醇精品。该法较现有提纯方法具有所用设备简单、可操作性强、成本低、易于工业化等优点，此项技术对于高纯度茄尼醇的工业化生产具有一定的指导意义。 目录 摘要………………………………………………………………………………………Ⅰ Abstract…………………………………………………………………………………Ⅱ 第一章绪论 1.1茄尼醇的结构和性质…………………………………………………………（1） 1.2茄尼醇的用途及主要来源……………………………………………………（1） 1.3烟叶中茄尼醇的存在形式……………………………………………………（2） 1.4茄尼醇的市场概况……………………………………………………………（2） 1.4.1国际市场现状……………………………………………………………（2） 1.4.2国内市场现状……………………………………………………………（2） 1.5茄尼醇的提取和精制方法……………………………………………………（3） 1.5.1茄尼醇的提取方法………………………………………………………（3） 1.5.2茄尼醇的精制方法………………………………………………………（5） 1.6本课题研究的主要内容与任务………………………………………………（7） 1.7选题的背景及研究意义………………………………………………………（7） 第二章废次烟叶中茄尼醇的分析鉴定 2.1高效液相色谱法………………………………………………………………（9） 2.1.1实验材料及仪器……………………………………………………………（9） 2.1.2实验方法……………………………………………………………………（9） 2.1.3结果与讨论…………………………………………………………………（10） 2.2薄层层析法………………………………………………………………………（11） 2.2.1实验材料及仪器……………………………………………………………（11） 2.2.2实验方法……………………………………………………………………（12） 2.2.3结果与讨论…………………………………………………………………（12） 2.3废次烟叶中游离茄尼醇的含量测定……………………………………………（14） 2.3.1实验材料及仪器……………………………………………………………（14） 2.3.2实验方法……………………………………………………………………（15） 2.3.3结果与讨论…………………………………………………………………（15） 2.4小结………………………………………………………………………………（16） 第三章废次烟叶中茄尼醇的提取工艺研究 3.1超临界CO2流体萃取法………………………………………………………（17） 3.1.1实验材料及仪器……………………………………………………………（17） 3.1.2实验方法……………………………………………………………………（17） 3.1.3结果与讨论…………………………………………………………………（19） 3.2有机溶剂萃取法…………………………………………………………………（22） 3.2.1实验材料及仪器……………………………………………………………（22） 3.2.2实验方法……………………………………………………………………（23） 3.2.3结果与讨论…………………………………………………………………（23） 3.3两种萃取方法的比较……………………………………………………………（25） 3.4小结………………………………………………………………………………（26） 第4章粗品茄尼醇的提纯工艺研究4.1实验材料及器材…………………………………………………………… 第5章4.1.1实验材料及仪器………………………………………………………… 第6章4.1.2实验装置………………………………………………………………… 第7章4.2茄尼醇粗品的制备………………………………………………………… 第8章4.3皂化………………………………………………………………………… 第9章4.4硅胶柱层析结合重结晶法纯化茄尼醇粗品…………………………… 第10章4.4.1工艺步骤……………………………………………………………… 第11章4.4.2硅胶柱层析条件的研究……………………………………………… 第12章4.4.3纯化结果……………………………………………………………… 第13章4.5分步重结晶法纯化茄尼醇粗品………………………………………… 第14章4.5.1工艺步骤……………………………………………………………… 第15章4.5.2重结晶溶剂的选择及工艺步骤的确定…………………………… 第16章4.5.3纯化结果……………………………………………………………… 第17章4.6小结………………………………………………………………………… 第18章结论与展望……………………………………………………………………… 第19章参考文献………………………………………………………………………… 第20章致谢……………………………………………………………………………… 第21章攻读硕士期间公开发表的论文…………………………………………… 第一章绪论 1.1茄尼醇的结构及性质 茄尼醇(Solanesol)是一种不饱和的聚异戊二烯醇，其结构式为 其中有9个不饱合非共轭双键。纯的茄尼醇为白色或淡黄色蜡状固体，分子式为：C45H74O分子量为631.079、熔点为31-32℃、沸点为526℃(根据经验公式计算)，易溶于正已烷、乙醚、丙酮、汽油等有机溶剂，难溶于水。茄尼醇具有萜烯类化合物的共性:易发生加成反应(特别是在化学试剂的影响下发生反应)；氧化反应；脱氢反应(是一个有价值的化学降解反应)；分子重排(受试剂如酸的作用)。由于茄尼醇含有多个非共轭双键，故具有非常强的吸收自由基的性能。市售茄尼醇产品，主要有茄尼醇浸膏(茄尼醇含量>15％)，茄尼醇精品(茄尼醇含量>75％)，茄尼醇纯品(茄尼醇含量>90％)。茄尼醇浸膏通常情况下较稳定，但在光照、加热条件下会衰变。实验发现:茄尼醇浸膏在极性溶剂中不稳定，在非极性溶剂中较稳定。茄尼醇精品通常情况下更易衰变，一般保存半年左右(也有报道3个月左右)，见光、加热下更易衰变。 1.2茄尼醇的用途及主要来源 茄尼醇在生物化学中有着非常重要的作用。具有抗菌、消炎、治疗心血管疾 病及抗溃疡等作用，而且是一种重要的药用中间体，主要用于合成辅酶QlO、维生 素K、抗癌增效剂SDB等，辅酶QlO是人体内不可缺少的参与代谢的重要活性物质，它的主要功能是作为细胞电子和质子的传递者，参与蛋白质和脂肪代谢，是细胞呼吸和代谢为人体细胞产生能量的激活剂。辅酶QlO最常用于心血管系统疾病治疗与预防，对急性癌症和病毒性肝炎也有一定的疗效，同时具有提高人体免疫力、增强抗氧化、保持青春的功效。茄尼醇(Solanesol)广泛存在于高等植物、哺乳动物和微生物体内，烟叶、马铃薯叶和桑叶中含量较高，尤以烟叶中茄尼醇含量为高，质量分数高达0.3%一3%，提取价值比较大。因此国内外均以烟叶作为获得茄尼醇的主要原料，由于采用黄种烟叶或烤烟为原料提取茄尼醇不仅存在与烟草工业争原料而且生产成本较高，而以废次烟叶为原料却不仅能降低生产成本而且能保护环境，所以近年来以废次烟叶为原料提取茄尼醇引起了人们的极大兴趣。日本首先成功地从废烟叶中提取茄尼醇，进而以工业化的半合成法制造辅酶QlO产品，目前全世界数十亿美元的市场被日本垄断，我国有30余家制药厂生产辅酶QlO胶囊，其辅酶QlO原料药也全部依赖日本进口。据报道，从废弃烟叶中提取茄尼醇粗品、精品、纯品，进而合成辅酶QlO的技术己由云南陆良云大通产业有限公司研制成功，并建成工业化生产线，该生产线已具备连续稳定年生产3吨辅酶QlO的规模，填补了国内空白。 1.3烟叶中茄尼醇的存在形式 茄尼醇是烟叶中存在的萜类化合物之一，色谱法测定烟草中的茄尼醇含量大致在0.3—3%之间，在烟叶中以游离态和化合态两种形式存在。据报道：烟叶采收一段时间后，游离态的茄尼醇的量逐渐增多，而化合态的茄尼醇的量逐渐减少。 1.4茄尼醇的市场概况 1.4.1国际市场现状 由于茄尼醇是合成辅酶Q10的重要原料，因此辅酶Q10的市场直接决定于茄尼醇的市场情况。辅酶Q10在医药、保健和化妆品领域中应用十分广泛，如在医药领域中用于治疗心脑血管疾病、病毒性肝炎、十二指肠溃疡和癌症病人减轻化疗副作用等;在保健品领域，辅酶Q10用于预防多种疾病和减缓衰老等，是欧洲、美国、日本等国非常流行的一种保健品，大多数发达国家的保健品商店中均可看到辅酶Q10的胶囊或片剂;在化妆品领域，辅酶Q10用于祛斑除皱、防止肌肤老化等，是高档化妆品的原料，如欧莱雅(L'OREAL)、妮维雅(NIVEA)等品牌的化妆品中有很多品种都含有辅酶Q10。此外，辅酶Q10近来还被发现有更多的用途，如治疗老年痴呆、先天障碍性贫血等。更重要的是，美国FDA(Food and Drug Administration)于2004年3月将辅酶Q10的建议用量提高了4倍，使得本来就供不应求的辅酶Q10市场更加紧俏，目前国际市场价格已从2000美元/kg上涨到3000美元/kg.一般来说，每生产Ikg辅酶Q10，至少需要2 kg质量分数为90%以上的茄尼醇。2004年国际辅酶Q1O总产量约为900 t，其中半合成法生产的约为720 t，直接需要消耗高纯度茄尼醇近2 000 t。纯度为90%的茄尼醇的国际市场价格从2004年初的32C美元/kg上涨到目前的480美元/kg。日本、美国、德国、韩国分别为采购高纯度茄尼醇量最大的4个国家。 1.4.2国内市场现状 我国从20世纪90年代初才开始茄尼醇的工业化开发，云南、贵州、山东、河南等省曾先后建立了若干茄尼醇粗品厂(质量分数在17%以下)。这些粗品加工厂在建厂之初由于工艺相对落后，因此消耗烟叶和有机溶剂的量十分惊人，一般每50一60t烟叶仅可生产1t茄尼醇粗品。近年来随着工艺技术的改进和完善，个别茄尼醇粗品生产企业已经能够将烟叶耗量和有机溶剂的使用量控制在较低水平。近10年来，国内茄尼醇粗品生产企业大多数将产品销售至日本(目前市场价格每吨7万一9万元人民币不等)，由日本企业精制高纯度茄尼醇用于辅酶Q10的合成。预计在今后的几年中，国内高纯度茄尼醇的需求量将以每年15%一20%的速度显著上升，经济效益显著，市场规模巨大。 1.5茄尼醇的提取和精制方法 1.5.1茄尼醇的提取方法 1.5.1.1常规溶剂萃取法 常规溶剂萃取法是一种很传统的提取方法,它的最大的特点就是设备投资少,易于工业化，但三废排放大，溶剂消耗量大。目前,采用常规溶剂萃取法提取茄尼醇的工艺已经比较成熟,由于原料可以是:烟叶,碎烟末霉烟、烟梗等废次烟叶,提取过烟碱的烟渣等,有机溶剂萃取工艺流程也有所不同。国外早期生产茄尼醇的技术是以黄种烟叶为原料，用高纯度的正己烷或甲醇为抽提溶剂，加热搅拌抽提2-3次，此法提取率虽高但存在一些问题：用黄种烟叶为原料制备茄尼醇用量大，有效产出率低，投入产出比达到30：1，这不仅和烟草工业争原料，而且由于消耗量大，使得原料来源困难；采用98%以上高纯度正己烷作浸取剂，其生产成本也较高。针对上述缺点，张德玉提出了如下工艺：用霉烟叶或碎烟末为原料，以60%-80%含量的工业正己烷或6号溶剂油为抽提溶剂，搅拌抽提2次，过滤后，滤液经浓缩后可得到茄尼醇，纯度在20%左右，其残渣可用作农药原料或烟片。该工艺的原料选用含茄尼醇1%上的霉烟叶或碎烟末（不含烟梗），抽提温度为55℃-60℃。该工艺解决了上一工艺中存在的缺点，但是仍存在如下不足：①茄尼醇在原料干燥过程中受热损失严重；②在机械输送过程中和搅拌抽提过程中产生较多微细烟粉尘，影响产品纯度；③间歇抽提溶剂用量大，抽提的效果差；④生产过程中存在乳化现象，排渣困难等。有专利把间歇抽提改为溶剂喷淋循环浸提，然后粗滤并经5%-20%的盐水水洗除去无机盐、胶粘物质、水溶性杂质。经改进后，溶剂可节省三分之一以上，水洗消除了乳化现象。张伟和等人提出了在连续抽提、过滤后增加两次沉降过程和尾气吸收处理的工艺，提高了产品的质量，提高了生产的机械化程度，同时减少了环境污染及安全危害，使得工艺过程更符合工业化的生产要求。由于上述工艺流程中无论是浸提、分离还是回收溶剂各工序均在加热状态下进行，而正己烷、6号油的沸点偏低、易挥发，因此使得该工艺溶剂消耗大，生产成本高，针对这一问题,近年岑波、姚文等人相继提出了替代溶剂PE溶剂和SOT溶剂体系。PE溶剂价廉易得，并且在优化的工艺条件下与正己烷相比有较高的茄尼醇提取率和溶剂回收率；目前公认较好的替代溶剂是SOT溶剂体系，由于其具有一定的极性，对弱极性和极性物质有很好的萃取能力，可较好的回收类脂类物质（如茄尼醇），其沸点高于正己烷和6号油，降低了溶剂损耗。而且对茄尼醇的萃取能力比正己烷和6号油都高，比较发现其回收率比6号油高18%比正己烷高22%。祖元刚等人对萃取装置进行了改进，设计了一套能强化传质的匀浆萃取装置，其原理是将鲜物料—烟草鲜叶与萃取溶剂在匀浆萃取装置中混合匀浆通过机械及液力剪切作用将物料撕裂和粉碎使物料破碎和有效成分的萃取同步进行，以达到对植物有效成分快速强化提取的目的，其实质是一种强化提取工艺。与前述提取方法相比，鲜法匀浆萃取的原料为新鲜烟叶，这不但减少干燥的工序，降低了成本，而且避免了茄尼醇在烘干过程中的降解，尤其适合热敏性物质茄尼醇的提取。尤其突出的是鲜法匀浆萃取具有提取率高，提取时间短，提取溶剂用量少，成本低的优点。 1.5.1.2微波辅助萃取法 微波辅助萃取(Microwave assisted Extraction,MAE)主要是利用微波能提高萃取效率的一种新的样品预处理技术。微波辅助萃取是在分析化学中派生出来的新型萃取技术，和传统的索氏萃取技术相比，微波辅助萃取具有设备简单，应用范围广泛，萃取效率较高，可预处理批量样品，省时，省试剂，成本低以及污染小等优点。国内外将微波辅助萃取用于天然产物的提取，取得了一系列的研究成果。张征等人研究了微波辅助萃取废次烟叶中茄尼醇的工艺，探讨了微波萃取效率以及溶剂、水分、时间、功率等因素对萃取过程的影响，并作正交实验 对整个工艺进行了优化，得出运用微波辅助萃取废烟叶中的茄尼醇，具有萃取速度快，溶剂用量少，萃取效率高的优点，有较好的开发应用前景的结论，同时发现，只要对微波萃取条件略加改变，就可提高烟叶中可提物的提取率。 1.5.1.3超临界CO2流体萃取法 超临界流体萃取过程是利用处于临界压力和临界温度以上的流体具有特异的增溶能力而发展出来的化工分离新技术。该萃取过程具有如下特点：①具有广泛的适应性。由于超临界状态流体普遍具有溶解度特异增高的现象，因而理论上超临界流体萃取技术可作为一种通用、高效的分离技术而应用。②萃取效率高，过程易于调节。超临界流体兼具气体和液体特性，因而超临界流体既有液体的溶解能力，又有气体的流动和传递性能。并且在临界点附近，压力和温度的少量变化，有可能显著改变流体溶解能力，控制分离过程。③分离工艺流程简单。超临界萃取只由萃取器和分离器二部分组成，不需要溶剂回收设备，与传统分离工艺流程相比不但流程简化，而且节省能耗。④分离过程有可能在接近室温下完成，特别适用于热敏性天然产物。⑤其不足之处是：必须在高压下操作，设备及工艺技术要求高，投资比较大 。其突出优点在于无三废排放，流体溶剂可循环利用，消耗量极少。随着人们对绿色产品的呼唤，超临界流体萃取技术日显重要。因为C02价廉、易得、无毒，并且萃取温度接近室温，萃取压力容易达到所以以超临界二氧化碳萃取应用最为广泛。人们利用超临界二氧化碳萃取其它植物已有广泛研究，但是关于萃取烟叶中茄尼醇的文献报道较少,而且许多研究均在初步阶段。一些学者通过考察萃取温度、萃取压力、夹带剂、萃取时间、CO2流量、解析压力对产率的影响，发现在提取烟草中茄尼醇过程中：在无夹带剂的条件下，萃取量很少，效果不明显，但加入适量的95%乙醇作夹带剂后能大大增加萃取量及对茄尼醇的提取率。由此可见，夹带剂对超临界二氧化碳萃取烟叶中茄尼醇过程起着重要的作用，要提高茄尼醇的提取率，关键在于选用合适的夹带剂。夹带剂是在纯超临界气体中加入的一种少量的、可以与之混溶的、挥发性介于被分离物质与超临界组分之间的物质，有关夹带剂应用于超临界萃取中的作用机理、选择原则、加入方式等，许多文献均有详细报道。 1.5.2茄尼醇的精制方法 由于茄尼醇的良好市场前景及高利润空间，国内外对茄尼醇的精制方法进行了较多的研究，提出了多种精制工艺，概括起来主要有如下几种方法： 1.5.2.1重结晶法 重结晶法是从含复杂组分的天然物质中获取有效成分的很好的方法，也是天 然植物提纯中最常用的方法之一。其关键是选择好合适的溶剂，其次需要确定好 溶剂用量，以及结晶温度和时间就可获得纯度很高的产品，而且还易于工业化， 设备投资成本低，缺点是得率较低。孙心齐等采用重结晶法提取废次烟叶中的茄 尼醇，其工艺如下： 但是该工艺提纯的茄尼醇含量太低，只有75%，达不到制药的要求，还需进一步的研究和处理。 1.5.2.2柱色谱法 柱色谱法是天然植物分离提纯中从复杂混合物中获取高纯物质的最常用手段。最早报道采用柱色谱分离提纯烟叶中茄尼醇是日本的一项专利，公开特许公报（A）昭63-190840 1988.8.8，方法是：以粗茄尼醇为原料，经皂化后用离心式液-液分配色谱法，采用正己烷为固定相，10%的乙醇为移动相，反向流动得到初步提纯的茄尼醇，再将该初步提纯的茄尼醇，经高效液相色谱法，以正己烷与乙酸乙酯的混配液为流动相进一步提纯，得到茄尼醇精品，该茄尼醇的精制方法存在有以下的不足：①高效液相色谱法所使用的色谱仪产量少，需在高压下进行设备投资高，产品的成本高；②用正己烷与乙酸乙酯的混配液为移动相，由于乙酸乙酯不够稳定，回收时容易分解，因而不能循环使用；③离心式液-液分配色谱法中使用的 离心机，转速很高，易引起有机溶剂的燃烧、爆炸，不便于安全生产。针对上述问题，我国学者胥克亮发明了一种新工艺，并申请了专利，茄尼醇初提物经皂化结晶析出后所得纯度不低于70％的茄尼醇提取物，用正己烷溶解后，以正己烷、1，2－二氯乙烷和丙酮的混配液为洗脱剂，以丙酮为返洗剂，采用吸附色谱法，去掉与茄尼醇极性不同的杂质，再以正己烷为溶剂和洗脱剂，采用凝胶渗透色谱法，去掉与茄尼醇分子量不同的杂质，浓缩、冷却后即得纯度为95％以上的茄尼醇精品，用此方法提纯的茄尼醇，纯度高，成本相对较低。但是考虑到以上工艺均用到了两种以上色谱柱进行纯化，因此不论怎样改进工艺，成本均比较高，我国学者对采用单一色谱柱纯化技术进行了研究，从已有的文献来看，均选用硅胶柱色谱法，通常跟重结晶相结样能得到高纯度的茄尼醇。如：姚文等提出，粗茄尼醇先经甲醇:丙酮（22:3）混合溶剂于-15℃条件下重结晶,再滴加到初分层析硅胶柱上,采用蠕动泵自动加液,正己烷、四氯化碳、苯梯度洗脱，进行初步分离，蒸干再加到精分层析柱上，以苯:1,2-二氯乙烷:丙酮=9:9:0.7(体积比)洗脱的得到高纯度的纯白色蜡状固体产物。夏薇等将废次烟叶浸膏皂化后经乙醚和水溶剂分配提纯，再将粗品加入硅胶柱中，依序用石油醚、石油醚-乙酸乙酯（9:1）洗脱,收集相同组分浓缩,溶于丙酮中于-15℃下重结晶,得到纯度为93%的茄尼醇 精品。 1.5.2.3微孔滤膜法 祖元刚等发明了一种采用微孔滤膜过滤的新工艺，其工艺流程为：将烟叶与溶剂按比例混合，并用打浆机打浆，过滤打浆液，滤饼再用乙醇空化萃取，过滤，滤液与前述打浆液的滤液合并浓缩、皂化，皂化液用正己烷萃取，正己烷萃取液用水洗至中性，加入吸附剂吸附一定时间后过滤，滤液用乙醇萃取，浓缩正己烷相并冷冻析晶，过滤晶体，晶体用热的乙腈溶解、低温析晶两次，可得到95％以上的茄尼醇精品。上述过滤其特征是采用0.2-0.4μm的微孔滤膜或中空纤维超滤膜进行过滤。该工艺具有茄尼醇损失少、工艺成本低、茄尼醇得率和纯度高的特点。 1.5.2.4聚合态共沉淀法 该方法针对茄尼醇分子独特的理化性质，采用具有靶向性的高分子基团与茄尼醇分子形成聚合态，在适宜的条件下形成共沉淀后洗脱，得到高纯度茄尼醇。该技术具有生产成本低廉、不需要层析柱、茄尼醇含量高、操作简便等特点。经过生产运行实践(年产30 t茄尼醇精品)表明：工业化生产中茄尼醇终产品含量(HPLC外标法，SIGMA标准品)可稳定在95%以上。但是该技术的有关详细信息尚未见公开报道 [6]。 1.6本课题研究的主要内容与任务 本课题研究的主要任务是：开发一条以废次烟叶为原料制备高纯度茄尼醇的新工艺路线，以降低成本、简化工艺步骤、易于工业化为目标，使茄尼醇的纯度能达到制药要求，为高纯茄尼醇的工业化生产提供一些依据。围绕上述任务主要开展了以下一些研究工作：1.建立茄尼醇的分析方法，并测定各种烟叶中游离茄尼醇的含量，对各种烟叶中茄尼醇含量进行比较，确定以废次烟叶为原料进行提取的可行性。2.研究超临界二氧化碳萃取法和有机溶剂萃取法提取废次烟叶中茄尼醇的工艺，考察各主要影响因素并对其进行优化得出了各自适宜的工艺条件，并对该条件下的萃取综合效果进行对比，确定较优的提取工艺。3.对皂化、纯化工艺进行探索性研究。 1.7选题的背景及研究意义 我国是世界第二大烟草大国，烟草每年产量500万t以上，其中废次烟草高达150万t左右。我国的云南、贵州、山东、河南、湖南、广东、福建、四川、安徽等省都有大面积的烟田，众多的卷烟厂、烤烟厂，每年都有大量的废烟叶、烟杆、烟灰废弃。据报道，每年贵州省烧掉或以其他方式处理的烟叶价值近2亿元，而云南省每年的废弃烟叶也高达40万t，以玉溪烟厂为例，该厂每年为此交纳的环境保护费就5千万元之多。而且随着卷烟市场向高、中档发展，废次烟草还将会大量增加。由于这些废次烟叶中含有重要的化工、医药原料茄尼醇、烟碱、有机酸和氨基酸等，因此直接焚烧或堆置处理既造成资源浪费又严重污染环境，如何将这些烟草废弃物加以合理的综合利用，提高废次烟叶的商业使用价值及其产品附加值，是目前的一个重要课题。同时近年来，国内外高纯度茄尼醇的需求量以每年15%一20%的速度显著上升，国外客户求购高纯度茄尼醇的信息随处可见，经济效益显著，市场规模巨大。开发一条以废次烟叶为原料、生产工艺操作简单、产品得率高且易于工业化生产的经济合理的高纯度茄尼醇生产路线对于实现资源的综合利用具有重要的社会经济意义。 第二章废次烟叶中茄尼醇的分析鉴定 在对废次烟叶中茄尼醇进行提取纯化的过程中，需要知道如何对茄尼醇进行分析鉴定茄尼醇的分析方法有多种，据文献报道有：高效液相色谱法、库仑滴定法、薄层层析法等。库仑滴定法虽具有不必使用标准茄尼醇与样品进行比较，仪器简单，方法易行，分析快速等优点但由于准确度较低不适宜于实验研究测定，只适合于中小型工厂使用，而高效液相色谱法和薄层层析法为天然物提取和分离过程中常用的有效检测方法，因此采用高效液相色谱法和薄层层析法两种方法对废次烟叶中的茄尼醇进行分析鉴定具有较好的可靠性和准确性。 2.1高效液相色谱法 高效液相色谱能高效准确地分析各组分的含量。试验了正相硅胶柱废次烟叶中茄尼醇进行定性及定量分析。 2.1.1实验材料及仪器 茄尼醇标样，含量90.21%，山东潍坊三强有限公司正己烷、无水乙醚，分析纯AR，广东汕头市西陇化工厂美国PE高效液相色谱仪色谱柱：Aigelent Zorbax SILΦ4.6×250mm 2.1.2实验方法 2.1.2.1定量分析方法 1. 分析条件为：流速2ml/min；紫外检测器检测波长210nm；流动和无水乙醚（体积比93：7）；色谱柱Aigelent Zorbax SILΦ4.6×250mm 2. 标准溶液的配制准确称取0.0500g的茄尼醇标准品，用正己烷溶定容，再取10ml此溶于50ml容量瓶中，用正己烷稀释定容，配制成的系列标准溶液。每份标准样品平行测定三次，求其峰面积的平均值。 3.样品溶液的配制准确称取萃取样品(要求样品中印糠素A的浓度作曲线范围内)，用正己烷溶解、定容，置于超声波水浴中振荡混匀，用过滤器过滤，在上述色谱条件下，注入10μl，进行试样测定，每份试样三次，求其峰面积的平均值。 4. 用20μl微量注射器从已定容过的各号样品瓶中准确取出样品液量为10μl，按标样、样品、标样的顺序进样，根据不同浓度标准溶液的积值，用最小二乘法求出线性回归方程，将样品溶液的平均峰面积值代求得其茄尼醇的量，再换算成各样品中茄尼醇的量。 2.1.2.2定性分析方法 在上述色谱条件下，待基线稳定后，开始重复进标样，直到标样的保留时间很稳定后，再进样品，重复两次。 2.1.3结果与讨论 2.1.3.1检测方法的线性关系 每一注射体积平行测定三次，计算峰面积的平均值(见表2.1)，经过线性回归，得到回归方程为:Y=A+BxX，其中A=﹣0.0556;B=9×10-7,Y–茄尼醇质量（μg），x-峰面积，相关系数为0.9999。由此可见，茄尼醇的质量与峰面积呈现良好的线形关系（在0.1-1mg/ml范围内）。 表2.1茄尼醇进样质量与峰面积的关系 2.1.3.2废次烟叶中茄尼醇的鉴定 在上述色谱条件下，样品中的大部分峰均得到有效分离，测定迅速，重现性好。茄尼醇的标准对照品及萃取样品的色谱图如下： 图2.1茄尼醇标准品的HLPC图 图2.2超临界萃取样品的HPLC图 图2.3有机溶剂浸取样品的HPLC图 从上述图可以看出，标样中茄尼醇的保留时间为：17.970min，超临界萃取样品和有机溶剂浸取样品中最大峰的保留时间分别为：17.867min和17.390min，可知两样品最大峰的保留时间与标样保留时间非常接近，因此可以初步确定，该峰即为茄尼醇峰。 2.2薄层层析法 薄层层析以其简单、廉价、快速、适用范围广的优点而成为天然药物提取、分离过程中常用的检测、分析手段。本试验采用该法快速定性判断萃取样品，硅胶柱流份和纯化过程中茄尼醇的存在及去向情况。 2.2.1实验材料及仪器 薄层层析用硅胶G，200-300目，化学纯，青岛海洋化工有限公司； 无水乙醚，1，2-二氯乙烷，广东汕头市西陇化工厂； 丙酮，长沙市湘科精细化工厂； 甲醇、无水乙醇，湖南师大化学试剂厂； 乙酸乙酯，衡阳有机试剂厂； 石油醚（沸程30-60℃），天津市精细化工研究所； 以上未作说明试剂均为AR。 200mm×200mm玻璃板（自制）；层析缸，200mm×230mm； 玻璃毛细点样管，显色室（自制）； 2.2.2实验方法 2.2.2.1薄层板的制备 玻璃板洗净，于烘箱中烘干备用，取薄层层析用硅胶3g，加约10ml去离子水，调匀，全部倾倒于水平放置的玻璃板的一端，迅速用两端粘有0.2-0.3mm厚小环胶布的洁净玻璃棒从此端以较快速度将硅胶均匀推向另一端，于室内阴干一段时间后，移入110℃烘箱中活化1h，备用。 2.2.2.2展开剂的选择 采用微型圆心法对溶剂进行预试验，具体操作如下：将茄尼醇样品溶液点于已准备好的薄层上，点成同样大小的圆点，用毛细管吸取各种展开剂，加到茄尼醇样品点中心，让展开剂自毛细管中慢慢地流出进行展开，待溶剂挥发后，用碘蒸汽进行显色，观察样品的展开情况，据此选择合适的洗脱剂。 2.2.2.3薄层层析（TLC）定性分析方法 用石油醚溶解茄尼醇萃取样品，配制成浓度约为1-5mg/mL的试液，备用。用石油醚溶解茄尼醇标样，配制成5mg/ml的标准溶液，备用。取上述薄层板在距底部2cm处画一很细小的平行线作为点样的基线，用微量注射器分别吸取上述样品2-7μl和标准溶液2μl，按标样、样品、标样依序在基线上每隔2cm进行点样，以点成2-5mm直径的小圆点为宜，待溶剂挥发后，薄层板放入装有石油醚：丙酮=4：1（体积比）的展开溶剂的层析缸中，盖上盖子进行展开，待溶剂前沿达到薄层板的四分之三左右时取出，用铅笔或小针画出展开剂前沿的位置，放入40℃的烘箱中让展开剂挥发，待溶剂挥干后用碘蒸汽室温显色5分钟即可取出，根据Rf值法对茄尼醇进行定性分析。 2.2.3结果与讨论 2.2.3.1展开剂的确定 流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动相分子占据吸附中心的能力强，因而具有强的洗脱作用。非极性流动相竞争占据活性中心的能力弱，洗脱作用就要弱得多。因而为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，就必须根据试样的性质，吸附剂的活性，选据适当极性的流动相。常用的流动相按其极性增强顺序排列如后：石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜乙酸甲酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜酸。据此本实验选择了石油醚，二氯乙烷，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇，甲醇，采用微型圆心法对这些溶剂进行了预试验，展开情况如下图： 图2.4展开剂的微量圆型展开 从上图可以看出：当用石油醚做展开剂时，试样基本都在原点，对样品基本不展开，说明极性太弱；甲醇，无水乙醇，乙醚展开太快，试样大部分都到了溶剂的前沿，说明极性太强；用丙酮，乙酸乙酯和1,2-二氯乙烷展开效果相对较好,尤以丙酮为展开剂时获得了较好的分离效果。从价格上考虑丙酮较乙酸乙酯和1,2-二氯乙烷便宜，可以初步选取丙酮作展开剂。但是由于丙酮的极性较强，展开速度过快，不利于将与茄尼醇极性相近的杂质分开，因此选择用石油醚与其组成混合溶剂以降低其极性到适当值，以获取更好的展开效果，经多次实验发现，采用石油醚：丙酮=4：1（体积比）为展开剂时，分离效果很好。 2.2.3.2茄尼醇的定性分析 茄尼醇标准样品、超临界二氧化碳萃取样品薄层层析分析结果如图2-5所示： 图2.5茄尼醇各样品的TLC点样分析 展开剂：石油醚:丙酮（4:1） 从图2.5可以看出： 茄尼醇标准品的比移值为： 各样品均有比移值为0.726的点，可以基本断定，样品和流份中含有茄尼醇。 2.3废次烟叶中游离茄尼醇的含量测定 在对废次烟叶中的茄尼醇进行提取前，需要知道废次烟叶中茄尼醇的确切含量，才能便于考察提取的效果及对效果作出评价，烟叶中茄尼醇的存在形式有两种，一种是游离态，一种是化合态，色谱法测定烟叶中茄尼醇的含量大致在0.3—3%之间，为明确了解实验所用原料烟叶中游离茄尼醇的确切含量，本节采用高效液相色谱法对其含量进行了测定。实验测定基于一个基本的假设：采用较多量的提取效果较好的正己烷，对一定量废次烟叶在较佳的萃取条件下进行足够多次的萃取，基本可以将废次烟叶中的游离茄尼醇完全萃取出来，通过对混合后的萃取液进行茄尼醇含量分析，即可获得废次烟草中游离茄尼醇的百分含量。 2.3.1实验材料及仪器 湘潭市本地产烟叶 茄尼醇标样，含量90.21%，山东潍坊三强有限公司； 正己烷、无水乙醚，分析纯AR，广东汕头市西陇化工厂 美国PE高效液相色谱仪 HZ-300多用途水浴恒温振荡器 2.3.2实验方法 2.3.2.1实验步骤 将废次烟叶烘干粉碎，取若干于80℃下干燥1小时，准确称取5g烟叶放入三口烧瓶中，加入50ml正己烷，置于多用途水浴恒温振荡器中，恒温30℃，振荡3h，取出，过滤，在滤渣中再加入50ml正己烷，在相同条件下再重复萃取3次，对每次过滤所得的滤液分别进行液相分析以测定其茄尼醇含量，最后滤液合并，用高效液相色谱法测定废次烟叶中游离茄尼醇的总含量。 2.3.3结果与讨论 2.3.3.1茄尼醇浸出率与浸取次数的关系 在相同萃取条件下，对同一样品进行四次浸取操作，并对每一次的茄尼醇浸出率进行分别测定，结果如下表2.2。 表2.2茄尼醇浸出率与浸取次数的关系： 从上表可以看出：经过四次重复浸取，废次烟叶中的游离茄尼醇已基本被全部浸出，因而可以认为，四次浸出的茄尼醇量之和即为废次烟叶中游离茄尼醇的总量。 2.3.3.2废次烟叶中游离茄尼醇的含量 采用相同方法测定了上等烟叶、废次烟叶和烟梗中游离茄尼醇的含量，结果如下： 表2.3各种烟叶中游离茄尼醇的含量比较 由上表可知：废次烟叶中游离茄尼醇的含量仅比上等烟叶略微低一些，因而以废次烟叶为原料提取茄尼醇是可行的，这样不仅可以避免与烟草工业争原料，同时还能大大节约生产原料加以利用的成本，保护环境。烟梗中仍含有较多的茄尼醇，也具有提取利用价值。 2.4小结 1.采用正相高效液相色谱法进行定量分析，该法准确度高，重现性好，利用保留时间定性，可以初步鉴别提取和分离过程中的茄尼醇。 2.建立了薄层层析法，分析条件为：薄层层析用硅胶G，200-300目；展开剂：石油醚：丙酮=4：1（体积比）；碘蒸汽显色。该法能快速定性地判断溶液和硅胶柱层析流份中茄尼醇的存在情况。 3.建立了一种能较准确测定烟叶中游离茄尼醇含量的方法。 4.废次烟叶中游离茄尼醇含量仅略低于上等烟叶，烟梗中茄尼醇的含量亦不低，采用废次烟叶为原料提取茄尼醇不仅可以降低生产成本而且能变废为宝，不论是从经济效益还是从环境效益上均是很有意义的工作。 第三章废次烟叶中茄尼醇的提取工艺研究 3.1超临界CO2 流体萃取法 3.1.1实验材料及仪器 试剂：CO2，食品级，湘潭市气体公司；茄尼醇标样，含量90.21%，山东潍坊三强有限公司；正己烷、无水乙醚，广东汕头市西陇化工厂；丙酮，长沙市湘科精细化工厂；甲醇、无水乙醇、95%乙醇，湖南师大化学试剂厂；乙酸乙酯，衡阳有机试剂厂；以上未作说明试剂均为AR。仪器：HA211-50-06超临界流体萃取装置（江苏华安超临界萃取设备有限公 司），美国PE200高效液相色谱仪。