热应激蛋白70抗体滴度作为二硫化碳接触的生物标记物的研究

热应激蛋白70抗体滴度作为二硫化碳接触的生物标记物的研究 热应激蛋白70抗体滴度作为二硫化碳接触 的生物标记物的研究 第也卷第2期 2舶1年4月 武汉大学学报(医学版) MedicalJournalofWuh,mU vd.22.No2 ApI,2001 热应激蛋白70抗体滴度作为二硫化碳接触 的生物标记物的研究 王红毕勇毅文冠华彭晓霞陶宁王福元 武汉大学基础医学院卫生学教研室,武汉430071 摘要目的:了解二硫化碳接触工人的血清热应激蛋白70(H~70)抗体滴度及探讨其作为c接触的分子生 物标记物的可行性.方法:选择某化纤厂79名工人54名为接触组,25名为对照组.用We-~emblot-?脑A法对工 人血清}IsP70抗体水平进行了检测.采用LouiSe回归技术,分析了}IsP70抗体与cs2接触之间的关系结 果:抗体各漓度接越组工人血清}?,70抗体阳性率明显高于对照组,有非常显着意义(P<0.()1)采用Logistic回 归分析控制了因素的混杂作用后,这种联系仍然存在.结论:血清}IsP70抗体滴度可反映c是的接触状况.以血 清}圈,70抗体滴度作为分子生物学标记物,对c接触者进行健康监护有重要意义. 主题词二硫化碳;生物标记物;热应澈蛋白70;抗体 中圈分类号R135.1;Q51 生物体接触环境中物理,化学等刺激均可通过 改变基因的达模式而导致热应激蛋白(heatstI~SS pmteim,HsPs)的合成增加.HSPs在细胞的增殖,分 化等重要生理过程中发挥作用.,在劳动卫生与职 业病学领域从事HSPs的研究具有实际意义.cs2是 一 种化工原料,由于生产工艺的改进,现在主要引起 以慢性毒效应为主的症状,对c生物标记物的研 究主要集中在接触标记物的研究上,关于效应生物 标记物的研究较少.评价CS接触的主要指标是2_ 硫代噻唑烷4羧酸(TmA),但TI姒经尿排出快,并 不能反映较长期的接触水平.因此,本研究采用 Westernblot-EI2~A法对Cs,暴露工人的HSP70抗体 滴度水平进行分析,探讨将HSP70抗体滴度作为长 期低浓度cs接触的分子生物学标记物的可行性. 1对象和方法 1.1对象选择某粘胶纤维厂纺丝车间,接触cs25 年以上的作业工人54人作为接触组;选择同厂棉浆 车间内未接触C-%的工人25人作为对照组.两组 的年龄差异在5岁以内,性别,身高,体重,体重指 数,饮酒率,吸烟率等差异均无显着性(P>0.05). 1.2WesternMot—ELISA法检测血清HSP70抗体 1.2.1仪器与试剂?主要试剂:纯化的HSP70; caseIn(封闭用蛋白质);辣根过氧化物酶(1?)标记 羊抗人抗体(Sigma产品,武汉博士德生物工程 公司分装);3,3,5,5一四甲基联苯胺(肿目产品).? 主要仪器:恒温水浴箱,96孔酶标板,微量振荡器. 1.2.2血样的采集抽取静脉血2ml,室温静置2h 后取血清.一20?保存备用. 1.2.3血清HSP70抗体滴度测定将纯化的HSP 70通过SDS-PAGE的方法转移到硝酸纤维膜上,制 成小条,分装于96孔酶标板中,用0.25%的Casein 37温育1h后,加入待检血清,用0.25%Casein分 别按1:10,1:20,t:40,1:80滴度稀释.37温育2 — 3h后,用PBS洗液充分洗脱(6次×10rain).再 加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人(1:300)并用 0.25%的Casein封闭,4过夜.吸出封闭液, 0.05%的Twerp-20PBS充分洗脱.加入显色剂显 色,用PBS终止.用肉眼判断膜条中间有棕褐色条 带的为阳性,整个过程采用盲法,各组样品同时测 定,并用管号代替. 1.3统计分析采用Foxpm6.0建立数据库及数据 预处理,用SAS6.t2软件,采用Y检验,Fisher确切 概率法,L0凼dc回归等统计方法分析. 幸课鹿受湖北省卫生厅科研基盒(基金编号W95012)和湖北省教委重点科研基金(基金编号 97L:)资助 2结果 武汉大学学报(医学版) 2.13组间不同滴度的血清HSP70抗体阳性率比 较由表1所见,血清HSP70抗体滴度为1:10,1:20, 第卷 1:40,和1:80时,接触组阳性检出率均较对照组高 具有非常显着意义(P<0.01). 裹1备组工人血{I不同稀释度HSP70抗体阳性奉比较 *与对照组比较,P<001 2.2血清HSP70抗体阳性检出率与cs2接触间的析(sle=0.15,出=0.15),以明确血清HSP70抗 体阳 关系考虑到年龄,工龄,轮班,吸烟,饮酒等多种因性检出率与cs2接触之间的关系(表2). 素的相互影响,本研究采用多元逐步Logistic回归分 裹21:10血清砸70抗体阳性率的Lc回归分析 由表2可见,在控制其它混杂因素的影响后,血 清HSP70抗体阳性检出率与c接触呈正相关关 系,OR值为8.110,95%的可信区间2.773—23.715, 提示接触cs2是血清HSP70抗体阳性检出率升高的 独立危险因素. 3讨论 物理,化学,生物因素及其引发的体内生化,病 理生理反应和产生的代谢产物均可诱导HSPs的合 成增加,HSPs抗原合成增多,是有利于机体对抗不 良环境因素的一种保护性应激反应,HSP70抗体的 出现则可能在一些疾病的病理生理过程中起重要作 用.在职业医学方面,已对接触高温,一氧化碳,苯, 焦炉作业等有害因素的工人进行了HSP70含量和 HSP70抗体滴度研究,HSP70抗体的出现在评价这 些环境不良因素对工人健康的损害方面有比较显着 的意义..本文采用Westernbl0t.?腮A法对接触 cs2的工人HSP70的抗体滴度进行了检测,发现接 触组HSP70抗体各个滴度的抗体阳性率均较对照 组有升高的趋势(P<O.01).控制棍杂因素后,1:10 血清HSP70抗体阳性率的Logistic回归分析显示, cs2暴露与HSP70抗体阳性率之间的联系强度较强 (OR值为8.110).表明HSP70抗体的出现及滴度 的高低与是否接触cs2有一定联系. 本研究提示cs2接触工人HSP70抗体升高原因 有两种可能:c是及其代谢产物诱导HSP70台成增 加和lISP70的变性和释放.cs2进人人体后,与蛋 白质亲核基因发生反应,引起蛋白质的分子内或分 子间的共价交联,交联的主要结构为二硫代氨基甲 酸酯及硫脲类化合物,二者均与cs2的毒作用机制 有关.这种交联结构可能是导致cs2病理及行为改 变的基础.当交联物形成后,大量HSP70产生, 聚积,变异,导致机体免疫功能紊乱,HSP70作为自 身抗原提交给机体免疫系统,发生自身免疫反应,产 生针对HsP70的抗体,是机体对损伤的反应.此 外,自由基可诱导热应激基因的表达,使细胞内HSPs 水平升高.cs2与多种亲核基团反应可使机体对 自由基的清除作用减弱,导致自由基浓度增加.自 由基还可攻击细胞膜脂质双分子层,发生脂质过氧 化,破坏细胞的结构和功能.因此,可能会导致一 些变性的蛋白质不能及时清除,使HSP70大量增加 并进入血液,成为自身抗原.机体发生自身免疫反 应,导致了HSP70抗体的产生. 血清HSP70抗体滴度可反映cs2的接触状况, 且检测方法灵敏,快捷.把血清HSP70抗体滴度作 为反映机体损伤的早期生物标记物,对接触cs2作 业工人进行健康监护有重要意义.但以何种滴度作 为判断正常与否的还有待进一步研究. 参考文献 1GethignMJ,Sambnx~JPro~elninthecel1.Natme, 1992,355:33 (下转第126页) 武汉大学学报(医学版)第篮卷 EffectofAT1Al166CGenePolymorphism ontheEtiopathogenesisofDiabeticNephropathy Liliag,GaoLing,GanPei-zhea,et蚰 Departr,~ofEndocrinology,RenmmHospital,WtJ~uUniversity,Wuhan43(1060,Chitla Objective:Toinvestigatewhethertheangiotensin1IreceptorI(A)Alt66Cgenepolymorphismisassocia tedwith diabeticnepk~pathy(DN)intype? diabetespatients;TostraytheeffectofAAlt06Cgenepolymorphism0nthe pathogenesisofDNint~Ic,e? di&betesp~ents.Methods:WeinvestigatedthealMe~qUellCyandthe1pedistri. butionoftheA丑Att66Cgenepolymorphisminthegroupofnorma~conaol,simplediabetes,diabefic ?eph~p.thybv meaI1sofpolpnerasechainreaction-resmcfiveflagmentlongevityp(dymorpIli跚(PCR—R兀 P).Re~its:C~notypeACis positiveassociatedwithfasti? 8uh(nHs)andtrigtycerides(TG)inc~a.betesgroup(,I=0.429,1-2=0.255)曲dt}1h. popwtein(a)inDNgroup(r=0.318).C~dusical:3hereisnoassociationbetweentheAt166Cnepolymor. phismandDN,hnthediabetesandDNp~ientswhoaCalhhofATIgenearcpronetodeveloplipiddisordeIs. MeSHdiabetes,nephropathy;argiotensin?;receptor;pobw,orphism (上接第1t6页) 2Wu3’C.Yua=Y,WuY stre~inw,~kers6edtobenzeneandinpa缸with bemenep0唱.CellStlessa1ar哪鹧,1998,3:161 3邬堂春,贺涵贞,屈仲,等.高温和一氧化碳联合作用对应 撤反应的影响.同崭医科太学学报,1997,26(4):289 4高艳华,梁友信二硫化碳毒作用蛋白共价变联学说进 展劳动医学,1998,15(1):51 5Jacquier-SarlinMR,FullerK,Dir~XuanAT,etalProtective effects0f}璇70inl咖硼p曰,:,1994,50:1031 6毕勇毅,汪春红,谭晓东,等二硫化酸对粘胶纤维作业工 人血浆脂质过氧化系统的影响.工业卫生与职业病,1999, 2s(2,:79 (200D—03_18收稿) StudyontheTiterofSerumAntibodiestoHeatStressProtein 70asABiomarkerforCarbonDisulfideEXl~are wangHong,BiY~g-yl,WmCman-hua,etal DepartmentofHygiene,BasicMedicalCol~e,WuhanUnivemi~,Wuhan430071,China AbsI Objective:Toinvestigatethefiterof8erlllllantikxtiesail1stheatstres$protein70(HSP70)inv~orkers国 0sed andtheprobabilityofantibodytoHSP70in咖ofworkt~asabicanarker.M:T叫.79W0IkI弧inavis. coserayonfactorywiNreselectedanddividedinto2groups,including25workersinc~tmlgroup,54in目 l?egroup. Serumanti—HSP70wasdetectedu吕 iDgwestemhl0t.mlinkedimmunombentassay(Westernblot-ELISA). IDs regemsienmodelw船 usedtoanalyzetherelationshipbetweenanti—HSP70and(CXtK~LLre.Re8ulb:Itissl】ow.dtl1日t thepositiveoo~un-elNserateof跚bodytoHSP70exposuregnmp惴higherthanthatinconn’ol鲫 p(P<001). Condusion:Itisconcludedthatthefiterofsen? nanfihobytoHSP70havedoserelationshipt}lthe~])osLii’e0f . AI1ti-HSP70maypotentiallyserveasa8erul~biomarkertoa.. %ge88畦esl:posul~. MeSHcarbondisulfide;bido6~markers;heat-shockprotein70;antilx~es