[精品论文]旋毛虫幼虫侵入胃上皮细胞后虫体与细胞.doc

[精品]旋毛虫幼虫侵入胃上皮细胞后虫体与细胞.doc 精品论文 旋毛虫幼虫侵入胃上皮细胞后虫体与细胞 蛋白变化的研究* 王蕾，崔晶，田翔宇，陈梦欢，范思洋，陈雨，刘莉娜，姜鹏，王中全 5 ,郑州大学寄生虫学教研室, 摘要: 目的 为了观察旋毛虫幼虫对胃上皮细胞的侵入及侵入前后虫体与细胞蛋白的变化～ 筛选幼虫侵入相关蛋白。方法 将旋毛虫感染性幼虫接种至胃上皮细胞,SGC-7901,单层～ 37 ? 5%CO2 条件下培养培养不同时间后在倒置显微镜下观察幼虫侵入情况,培养 18h 后 10 分别提取虫体与细胞蛋白～进行 SDS-PAGE 与 Western blot 分析。结果 旋毛虫幼虫培养 6 h 时已侵入细胞单层～18h 在幼虫尾端与头端可见鞘的形成。SDS-PAGD 结果明～幼虫与细 胞培养后比仅在培养基中培养的幼虫增加了 3 条蛋白带～减少了 4 条蛋白带,而细胞与幼虫 培养后细胞蛋白增加了 3 条蛋白带～减少了 2 条蛋白带。Western blot 分析显示～幼虫与细 胞共培养后虫体蛋白被旋毛虫感染鼠血清多识别了 3 条蛋白带,58、21、18kDa,～少识别 15 了 3 条蛋白带,98、86、31 kDa,,而细胞与幼虫培养后细胞蛋白被旋毛虫感染鼠血清多识 别了 6 条蛋白带,96、62、40、34、29、22 kDa,～少识别了 2 条蛋白带,98、15 kDa,。 结论 旋毛虫幼虫可侵入体外培养的胃上皮细胞单层,幼虫与细胞共培养后被感染鼠血清多 识别的虫体与细胞蛋白可能是幼虫分泌的侵入相关蛋白。 关键词: 旋毛虫,侵入相关蛋白,胃上皮细胞,SDS-PAGE,Western blot 20 中图分类号:R383.15 Protein changes of larval and cell proteins after invasion of gastric epithelial cells by Trichinella spiralis infective larvae WANG Lei, CUI Jing, TIAN Xiangyu, CHEN Menghuan, FAN Siyang, CHEN Yu, 25 LIU Lina, JIANG Peng, WANG Zhongquan (Department of Parasitology, Basic Medical College, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan, China)) Abstract: Objective To observe the invasion and protein changes of larval and cell proteins after invasion of gastric epithelial cells by Trichinella spiralis infective larvae, and to screen the 30 invasion-related proteins. Methods T. spiralis infective larvae were inoculated on monolayer of gastric epithelial cell (SGC-7901), the larval invasion was observed under an inverted microscope after culture at 37 ? in 5% CO2 for different time. The larval and cell proteins after culture for18 h were extracted and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. Results When the larvae were cultured for 6 h, the larva’s head invaded cell monolayer. The anterior and posterior sheathe 35 of larva was observed after culture for 18 h. The results of SDS-PAGE showed after the larvae were cultured with cells, three additional protein bands were observed, and 3 protein bands was disappeared, compared with larvae cultured only in medium. After the cells were cultured with larvae, three new protein bands were observed, and two protein bands were disappeared. Western blot analysis showed after the larvae were cultured with cells, three additional protein bands (58, 40 21, 18 kDa) were recognized by sera from infected mice and three protein bands (98, 86, 13 kDa) were not recognized by infection sera compared with proteins from larvae incubated in medium only. After the cells were cultured with larvae, six additional protein bands (96, 62, 40, 34, 29, 22 kDa) were recognized by infection sera and two protein bands (98, 15 kDa) were not recognized by infection sera. Conclusions T. spiralis infective larvae invade the monolayer of gastric 45 epithelial cells cultured in vitro. After the larvae were cultured with cells, additional proteins of 基金项目:国家自然科学基金项目(No.30972579;81271860);高校博士点专项科研基金项目(No. 20124101110005);国家大学生创新计划项目(No.1210459108) 作者简介:王蕾 (1988-)，女，硕士研究生，旋毛虫侵入机制 通信联系人:王中全(1959-)，男，教 授，旋毛虫侵入机制. E-mail: zqwang@zzu.edu.cn - 1 - 精品论文 larvae and cells may be the invasion-related proteins secreted by the larvae. Key words: Trichinella spiralis; invasion-related proteins; gastric epithelial cells; SDS-PAGE; Western blot 引言 50 旋毛形线虫[Trichinella spiralis (Owen,1835) railliet,1895],简称旋毛虫，其成虫和幼虫分 别寄生在同一宿主的小肠和骨骼肌细胞内。旋毛虫具有十分广阔的易感宿主(哺乳动物、鸟 类和爬行动物)，人体感染旋毛虫是因生食或者半生食含旋毛虫幼虫包囊的猪肉或其他动物 肉类而引起的。在生食或半生食感染旋毛虫的肉类后，幼虫在宿主胃液的作用下脱囊而出， 0.9 h 内进入肠道发育为肠道感染性第 1 期幼虫，然后侵入肠道柱状上皮细胞内，经 30h~48h55 完成 4 次蜕皮后发育为成虫，雌雄交配后产新生幼虫，新生幼虫经淋巴或血液循环移行到肌 [1]肉组织，幼虫在肌肉中可以存活数年而保持其感染性。因此，脱囊幼虫(肠道感染性第 1 期幼虫)侵入肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道排出，是旋毛虫能否导致感染与致病的关 键步骤。由于不能在体外观察旋毛虫幼虫侵入肠粘膜或肠道排虫反应(worm expulsion)的 详细过程，目前关于幼虫对肠上皮细胞的识别、侵入或排出机制均不完全清楚。体外实验证 [2, 3]60 实，旋毛虫幼虫在体外可侵入人与大鼠的大肠、小肠上皮细胞及犬肾脏上皮细胞等，但 是否能侵入胃癌细胞则不清楚。为了研究旋毛虫能否侵入胃癌细胞及其侵入机制，本文对旋 毛虫感染性幼虫与人胃癌细胞株(human gastric cancer SGC-7901 cells，SGC-7901)在体外 共培养后，应用 SDS-PAGE 和 Western blot 分析了幼虫侵入细胞前后虫体蛋白和细胞蛋白的 变化，为寻找旋毛虫侵入相关因子奠定基础。 65 1 与方法 1.1 旋毛虫、实验动物和细胞株 (Trichinella spiralis)为河南省南阳猪源旋毛虫，由本室昆明小鼠 本实验所用的旋毛虫 传代保种。20 只雄性 6 周龄昆明小鼠(清洁级)，体重 20g~25g，均购自郑州大学医学院实 验动物中心。人胃癌细胞株 SGC-7901 购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。 70 SGC-7901 细胞接种于 1640 完全培养基中[含 10%胎人血清(FBS，上海尚宝公司)、100 U/ml 青霉素，100 µg/ml 链霉素]中，37? 5% CO培养箱中培养。当细胞贴壁生长至 80%~90%2 汇 合时，用 0.25% 胰蛋白酶(Trypsin，北京索来宝公司)-0.02%乙二胺四乙酸钠 (EDTA)消 [4] 化后传代培养。 1.2 主要仪器和试剂 75 搅拌器(珠海飞利浦家庭电器有限公司)，6孔培养板(美国Costar公司产品)，倒置显 微镜(Olympus IX71，日本)，人工消化液(含1%胃蛋白酶、0.7%盐酸和0.85%氯化钠)，人 血清白蛋白([BSA)宝信生物科技有限公司进口分装],1640完全培养基[含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，上海尚宝公司)、100 U/ml青霉素，100 µg/ml链霉素]，硝酸纤维素膜([ NC 膜)Amersham公司] ，HRP标记的羊抗小鼠IgG (北京购自鼎国生物技术产品), DAB(二氨80 基联苯胺，Sigma公司)，Synthesis 超纯水系统(美国MILLIPORE公司)，TotalLab TL100分 析软件(美国Syngene公司产品)。 1.3 旋毛虫肌幼虫的收集与激活 将300条旋毛虫肌幼虫经口感染昆明小鼠，感染后42 d 拉颈处死。膈肌压片镜检证实感 染成功后，剥皮、除内脏和脂肪，用搅拌器搅碎数次，5s/次，至肌肉完全搅碎。将肌肉与85 人工消化液按1 g?10 ml混合后置于42 ?震荡消化4 h，按贝氏法收集肌幼虫，生理盐水反复 [5]洗涤后镜下计数。将肌幼虫用含5%牛胆汁的PBS在37? 5% CO2条件下孵育2-3 h，用PBS [6]洗涤3次后，加入含抗生素的PBS(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中37?孵育1 h备用。 1.4 细胞培养 将 SGC-7901 细胞接种在 RPMI-1640 完全培养基[均含 10% FBS(上海尚宝公司)、90 100U/ml 青霉素，100μg/ml ]中，在 37? 5% CO培养箱培养，2~3 d 即可形成致密的单细胞 2 层，用于幼虫接种。 1.5 虫体与细胞蛋白的制备 将激活的幼虫与 SGC-7901 细胞在 RPMI-1640 培养基培养 18 h 后，分别收集虫体与 - 2 - 精品论文 [6][7]，BCA 法测得幼虫与细胞培养前后的虫体蛋白浓 SGC-7901 细胞，制备虫体与细胞蛋白 度分别为 1.21 mg/ml 与 2.24 mg/ml;细胞与幼虫培养前后的细胞蛋白浓度分别为 3.52 mg/ml 95 与 2.69 mg/ml，,80?冻存备用。 1.6 SDS-PAGE 与 Western blot 分析 采用 Bio-Rad 公司电泳系统进行 SDS-PAGE，积层胶浓度为 5%，分离胶浓度为 12%。 将虫体蛋白和细胞蛋白分别加入 5×SDS 上样缓冲液，100?水浴煮沸 10min 后离心，上样浓 度为 15 μg/孔。 电泳时积层胶电压为 80V，分离胶电压为 120V，电泳时间 2.5 h。电泳结束 100 后将凝胶用 0.25%考马斯亮蓝 R-250 染色 4 ~6h，用洗脱液(100ml 醋酸、50ml 乙酸、850ml dH2O)脱色，用蛋白图谱扫描仪(分辨率为 300 bpi，像素为 8 bits)扫描后用 Gene Genius 凝胶图像分析软件分析。 将凝胶用半干式电转仪转印至硝酸纤维素膜(NC 膜)上，电压 20V，转印 25 min。转 印后将 NC 膜置于丽春红染液中染色 5s，观察到蛋白带后用蒸馏水洗涤 3 次，再用 TBST 洗 105 涤以除去丽春红，加封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)4?过夜，将 NC 膜用 TBST 洗涤 3 次后 加入 1:100 稀释的一抗(旋毛虫感染小鼠血清)培养 1 h;洗涤 3 次后加 1:5000 稀释的二 抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG 抗体)，培养 1h 后加入 DAB 显色 3~5min 后，置 蒸馏水中终止反应。 2 结 果 2.1 旋毛虫幼虫对 SGC-7901 细胞侵入情况的观察 将旋毛虫幼虫加入培养细胞的单层后，110 发现经胆汁激活的幼虫在细胞单层上作蛇形移 动，并能侵入细胞单层;而未经胆汁激活的幼虫在细胞单层上仍呈盘旋状，不能侵入细胞单 层，仍留在培养基中(图 1)。激活幼虫培养 6 h 时幼虫头部已侵入细胞单层;12h 绝大部分 虫体全部伸展开并侵入细胞，头尾端未见脱鞘;18 h 可见虫体两端带鞘，但虫体不能从鞘中 脱出，细胞损伤较为严重(图 2)。 115 图 1 胆汁激活后旋毛虫幼虫在 SGC-7901 细胞单层上形态的变化 A:经胆汁激活后旋毛虫在细胞单层呈蛇样移行(200×)，B:未经胆汁激活的幼虫在细胞单层上呈盘旋状 (200×) Fig.1 Morphological change of activated T. spiralis larvae with bile on SGC-7901 cell monolayer. A:The activated serpentine larva by bile migrated on the SGC-7901 cell monolayer(200×). B:The non-activated spiral larva without bile migrated on the SGC-7901 cell monolayer(200×)120 - 3 - 精品论文 . 125 图 2 旋毛虫幼虫对 SGC-7901 细胞单层的侵入情况 A:培养 6 h 的幼虫头部侵入细胞单层(200×，箭头所示)，B:培养 12h 的幼虫侵入细胞单层(200×)，C: 培养 18 h 的幼虫头尾两端可见鞘的形成(200×)，D:培养 18 h 后细胞损伤较严重 Fig. 2 Invasion of SGC-7901 cell monolayer by T. spiralis larvae 130 A: The larva’s head invade cell monolayer cultured for 6 h(200×)， B:Invasion of cell monolayer by larva cultured for 12 h(200)，C: The anterior and posterior sheathe of larva cultured for 18 h(200)， D:Serious ×× cell damage cultured for 18 h(200×) 2.2 幼虫与 SGC-7901 细胞孵育后虫体蛋白的 SDS-PAGE 与 Western blot 结果 在无 SGC-7901 细胞的培养基中孵育 18h 后，幼虫蛋白有 36 条蛋白带，分子量为135 30kDa~12 kDa。幼虫与细胞共培养后，虫体蛋白增加了 3 条蛋白带(83、42、39 kDa)，减 1 少了 4 条蛋白带(127、60、32、31 kDa)(图 3)。Western blot 结果显示，幼虫仅在培养基 中孵育 18h 后，能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有 21 条带，分子量为 131 kDa ~12 kDa(图 4);幼虫与细胞孵育后虫体蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的也有 21 条带，分子量为 131 kDa ~12 kDa。旋毛虫幼虫和细胞培养后与仅在培养基中培养的幼虫相比，被感染鼠血清多 140 识别了 3 条蛋白带(58、21、18 kDa)，少识别了 3 条蛋白带(98、86、31 kDa)。 图 3 旋毛虫幼虫与 SGC-7901 细胞孵育后 18h 虫体蛋白的 SDS-PAGE 分析 M:蛋白 Marker，1:幼虫与细胞孵育后的虫体蛋白 2:仅在培养基中孵育后的虫体蛋白 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of proteins of T. spiralis larvae incubated with SGC-7901 cells for 18 h 145 M:Protein marker，1:Proteins of larvae incubated with cells, 2:Proteins of larvae incubated only in medium - 4 - 精品论文 图 4 旋毛虫幼虫与 SGC-7901 细胞培养后虫体蛋白的 Western blot 结果 150 M:蛋白 Marker，1:与细胞孵育后的虫体蛋白+感染鼠血清，2:培养基中孵育后的虫体蛋白+感染鼠血清， 3:与细胞孵育后的虫体蛋白+正常鼠血清，4:培养基中孵育后的虫体蛋白+正常鼠血清 Fig. 4 Western blot analysis of proteins of T. spiralis larvae incubated with SGC-7901 M:Protein markers，1:Proteins of the larvae incubated with cells + sera of the infected mice，2:Proteins of the larvae incubated only in medium + sera of the infected mice，3:Proteins of the larvae incubated with cells + sera of 155normal mice，4:Proteins of larvae incubated only in medium + sera of normal mice 2(3 SGC-7901 细胞与幼虫孵育后细胞蛋白的 SDS-PAGE 与 Western blot 结果 SDS-PAGE 结果表明，在不含幼虫的培养基将 SGC-7901 细胞的培养孵育 18h 后， SGC-7901 细胞有 32 条蛋白带，分子量为 134 kDa ~11 kDa。细胞与幼虫共培养后的细胞蛋 白增加了 3 条蛋白带(96、35、25 kDa)，减少了 2 条蛋白带(84、15 kDa)(图 5)。Western 160 blot 结果显示，仅在培养基中孵育的 SGC-7901 细胞蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有 13 条带(98 kDa ~11 kDa);与幼虫孵育后的细胞蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有 17 条带(96 kDa ~11 kDa)(图 6)。与幼虫孵育后的细胞蛋白与仅在培养基孵育的细胞相比， 被旋毛虫感染鼠血清多识别了 6 条蛋白带(96、62、40、34、29、22 kDa)，少识别了 2 条 蛋白带(98、15 kDa)。此外，与幼虫孵育后的细胞蛋白能被正常鼠血清识别 1 条 46 kDa 条 165 蛋白带，而仅在培养基孵育的细胞则有 2 条蛋白带(89、46 kDa)被正常鼠血清识别。 图 5 SGC-7901 细胞与旋毛虫幼虫孵育后细胞蛋白的 SDS-PAGE 结果 M 蛋白 Marker， 1:与幼虫孵育后的细胞蛋白，2:仅在培养基中孵育后的细胞蛋白 Fig. 5 SDS-PAGE analysis of proteins of SGC-7901 cells incubated with T. spiralis muscle larvae 170 M:Protein marker， 1:Proteins of cells incubated with larvae，2:Proteins of cells incubated only in medium 图 6 SGC-7901 细胞与旋毛虫幼虫孵育后细胞蛋白的 Western blot 结果 M:蛋白 Marker，1:与幼虫孵育后的细胞蛋白+感染鼠血清，2:仅在培养基中孵育后的细胞蛋白+感染鼠 血清，3:与幼虫孵育后的细胞蛋白+正常鼠血清，4:仅在培养基中孵育后的细胞蛋白+正常鼠血清 175 Fig. 6 Western blot analysis of proteins of SGC-7901 cells incubated with T. spiralis larvae M: Protein markers，1:Proteins of cells incubated with larvae + sera of the infected mice，2:Proteins of cells incubated only in medium + sera of the infected mice，3:Proteins of cells incubated with larvae + sera of normal mice，4:Proteins of cells incubated only in medium + sera from normal mice 3 讨 论 [8]人胃癌细胞株 SGC-7901 来自胃腺癌，具有胃粘膜上皮细胞的形态且能分泌粘液，国 180 内外主要用于抗肿瘤药效、胃癌耐药机制等研究。旋毛虫幼虫囊包经口食入后，在胃内消化 - 5 - 精品论文 液的作用下，幼虫自囊包内逸出，钻入十二指肠及空肠上段的肠粘膜。但对于幼虫是否能侵 入胃粘膜则尚未见报道。本文结果表明，旋毛虫幼虫可侵入体外培养的胃腺癌 SGC-7901 细 185 胞单层，该细胞株可作为体外研究旋毛虫侵入机制的细胞模型。对于幼虫是否能侵入宿主胃 粘膜，有待动物实验证实。 [9] ，推测幼虫对肠上 由于旋毛虫缺乏侵入性的解剖结构(如口孔无齿状和矛状结构等) 皮细胞的侵入不是简单的机械性损伤。我们的前期研究发现，幼虫侵入肠上皮细胞时将幼虫 [3,6]分泌的蛋白沉积在细胞内，故推测幼虫对肠上皮细胞的侵入可能是通过幼虫分泌的某种 [10，11]190 蛋白或宿主细胞释放的某些化学信号介导的。 旋毛虫穿透细胞膜和诱导的细胞膜的损 伤并不一定能导致幼虫的侵入，表明幼虫的成功侵入还需要一些宿主和寄生虫之间的信号传 导。胆汁对肌幼虫的激活对幼虫侵入肠粘膜不必可少的，可能与胆汁激活了宿主-寄生的信 [12，13] 号通路有关。本文应用 SDS-PAGE 对 SGC-7901 细胞与激活幼虫培养 18h 后的虫体蛋 白和细胞蛋白组分进行了分析，发现幼虫与细胞共培养后，虫体蛋白增加了 3 条蛋白带(83、 42、39 kDa)，减少了 4 条蛋白带(127、60、32、31 kDa)。Western blot 结果显示，旋毛虫 195 幼虫和细胞共培养后的虫体蛋白与仅在培养基中培养的幼虫相比，被感染鼠血清多识别了 3 条蛋白带(58、21、18 kDa)，少识别了 3 条蛋白带(98、86、31 kDa)。SGC-7901 细胞与 幼虫孵育后的细胞蛋白与仅在培养基孵育的细胞相比，被旋毛虫感染鼠血清多识别了 6 条蛋 白带(96、62、40、34、29、22 kDa)，少识别了 2 条蛋白带(98、15 kDa)。上述结果提示， 幼虫与细胞培养后被感染鼠血清多识别的虫体蛋白可能是细胞激活了虫体某些基因表达的 侵入相关蛋白;减少的蛋白可能是幼虫与细胞接触后表达这些蛋白的基因下调，也可能与虫 200 [10]体或细胞分泌的酶类水解有关。细胞与幼虫培养后被旋毛虫感染鼠血清多识别的细胞， 可能是细胞与幼虫接触过程中幼虫的 ES 抗原进入细胞内所致，而减少的蛋白可能是细胞与 幼虫接触后细胞释放出了特异性的化学介质有关。但目前关于细胞特异性化学介质及旋毛虫 对化学介质的识别过程了解甚少。 旋毛虫幼虫并不能侵入所有的细胞，如幼虫可侵入旋毛虫易感的人小肠与结肠上皮细 205 胞、鼠小肠上皮细胞及犬肾上皮细胞等，但不能侵入人肺成纤维细胞、小鼠横纹肌成肌细胞 [2] 及大鼠空肠隐窝细胞 IEC-6 等。将幼虫与旋毛虫易感或不易感的细胞共培养后，均可引起 非致死性的细胞膜损伤，虽然这些损伤不一定能导致幼虫的侵入，但均可使幼虫的 ES 抗原 [10]进入细胞内。Butcher 等将旋毛虫幼虫与不敏感的 IEC-6 细胞培养后，虽然幼虫不能侵入 细胞内，但可在细胞浆与胞核内发现 ES 抗原;若将 ES 抗原加入含细胞的培养基中，则细 210 胞不能摄入 ES 抗原，提示 ES 抗原可能不是通过胞饮进入细胞内的，而可能是通过细胞膜 的损伤幼虫直接将 ES 抗原注入细胞内的。对于旋毛虫不易感的细胞，幼虫引起的单独的细 胞膜损伤或单独的 ES 抗原进入细胞内均不足以导致幼虫侵入细胞，提示幼虫对细胞的侵入 还需要来自细胞的特异性信号。 215 [参考文献] (References) [1] 吴观陵. 人体寄生虫学第 3 版[M]. 北京:人民卫生出版社，2005:603-618. 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