实时超声造影技术与病理对照评价肝纤维化分期的实验研究

实时超声造影技术与病理对照评价肝纤维化分期的实验研究 学校代码:10114 分 类 号:R445.1 硕 士 学 位 论 文 实时超声造影技术与病理对照评价 肝纤维化分期的实验研究Experiment Study on Real-time Contrast-enhanced Ultrasound and Pathologic Assessment for Hepatic Fibrosis Staging 研 究 生:陈敏 指导教师:贾春梅 专业名称:影像医学与核医学 研究方向:超声造影 学位类型:科学学位 所在学院:医学影像学系 中国山西 二 O 一三年六月六日分类号:R445.1 单位代码:10114密 级: 学 号:201010454 实时超声造影技术与病理对照评价 肝纤维化分期的实验研究 Experiment Study on Real-time Contrast-enhanced Ultrasound and Pathologic Assessment for Hepatic Fibrosis Staging 研 究 生: 陈 敏 指 导 教 师: 贾春梅 申 请 学 位 门 类 级 别: 医学硕士 专 业 名 称: 影像医学与核医学 研 究 方 向: 超声造影 所 在 学 院: 医学影像学系 二 O 一三年六月六日 山西医科大学硕士学位论文 目 录中英文缩略词 表……………………………………………………… 1中文摘 要……………………………………………………………… 2英文摘 要……………………………………………………………………4正 文……………………………………………………………………………6 前 言…………………………………………………………………………6 资料与方 法………………………………………………………………………8 结 果………………………………………………………………………11 讨 论………………………………………………………………………16 结 论………………………………………………………………………21 参考文 献………………………………………………………………………22 附 图………………………………………………………………………25综 述 …………………………………………………………………………29 正 文………………………………………………………………………29 参考文 献………………………………………………………………………34发表论文情 况 …………………………………………………………………37致 谢 …………………………………………………………………………38个人简 介…………………………………………………………………………39 山西医科大学硕士学位论文 英 文 缩 略 词 表英文缩写 英文全称 中文全称HAAT Hepatic artery arriving time 肝动脉到达时间HVAT Hepatic vein arriving time 肝静脉到达时 间PVAT Portal vein arriving time 门静脉到达时间HA-HVTT Hepatic artery - hepatic vein transit time 肝动脉-肝静脉渡越时间PV-HVTT Portal vein - hepatic vein transit time 门静脉-肝静脉渡越时间LPPI Peak intensity of liver parenchyma 肝实质峰值强度LPTP Time to peak of liver parenchyma 肝实质达峰时间LPβ Curve sharpness of liver parenchyma 肝实质曲线尖度LPAUC Area under the curve of liver parenchyma 肝实质曲线下面积PVPI Peak intensity of portal vein 门静脉峰值强度PVTP Time to peak of portal vein 门静脉达峰时间PVβ Curve sharpness of portal vein 门静脉曲线尖度PVAUC Area under the curve of portal vein 门静脉曲线下面积δPI The difference between PVPI and LPPI 门静脉与肝实质峰值强度差δTP The difference between LPTP and PVTP 肝实质与门静脉达峰时间差 1 山西医科大学硕士学位论文 实时 超声造影技术与病理对照评价肝纤维化分期的实验研究 中 文 摘 要 目的:通过实 时超声造影技术定量分析不同病理分期肝纤维化大鼠肝脏血流灌注特征，探讨实时 超声造影技术评价肝纤维化病理分期的价值。 方法:健康雄性Wistar大鼠50只，随 机选取6只作为对照组，余44只经硫代乙酰胺thioacetamide，TAA诱导为肝纤维化模 型。于造模的4W、8W、12W分别从造模组中随机取12只大鼠，从对照组中随机取2 只大鼠行实时超声造影检查。首先在二维声像图上选择能同时较清楚显示腹主动脉、 肝静脉及门静脉等大血管的断面，随后切换到实时超声造影程序观察肝脏血流灌注 情况，并储存造影动态图像，随后将造影动态图像导入电脑，应用QontraXt定量分 析软件，逐帧回放图像，观察并造影剂到达肝动脉时间 、 (HAAT) 门静脉 时间(PVAT)、肝静脉时间(HVAT)，并计算肝动脉-肝静脉渡越时间(HA-HVTT)、 门静脉-肝静脉渡越时间(PV-HVTT)。然后，分别在肝实质和门静脉上选取感兴 趣区获取相应的时间-强度曲线，自动得出肝实质灌注参数:峰值强度(LPPI)、达 峰时间LPTP、曲线尖度(LPβ)、曲线下面积(LPAUC);门静脉灌注参数: 峰值 强度(PVPI)、达峰时间PVTP、曲线尖度(PVβ)、曲线下面积(PVAUC)，并 计算出门静脉-肝实质峰值强度差(δPI)、肝实质-门静脉达峰时间差(δTP)。造 影结束后，处死所有大鼠，取出肝脏进行组织病理学分期。以正常组为对照，比较 肝纤维化各期肝内造影剂到达时间及灌注参数的变化情况，并对这些定量参数与肝 纤维化病理分期进行相关性分析。对筛选出的存在组间差异的参数，以肝纤维化严 重程度S?S2、S?S3、S?S4为不同研究终点分组，绘制其受试者工作特征ROC曲线 以评价其诊断价值。 结果:?对照组 6 只大鼠全部存活。造模组大鼠于造模第 10 周死亡 1 只，余 43 只中 36 只纳入分析研究， Scheuer 行病理学分期情况: 0 期 8 只 S1 按 S期 6 只 S2 期 7 只 S3 期 9 只 S4 期 6 只。?肝内血管造 影剂到达时间参数中， 2 山西医科大学硕士学位论文HAAT、PVAT 在对照组及肝 纤维化各期组间两两比较差异无统计学意义;而HVAT、PV-HVTT、HA-HVTT 在 中重度组与轻度及无肝纤维化组组间比较存在统计学差异，与肝纤维化分期存在一 定相关性，即随着肝纤维化程度的加重，HVAT、 PV-HVTT 及 HA-HVTT 均呈现 缩短的趋势。?肝实质及门静脉灌注参数中，LPβ、LPAUC、PVPI、PVTP、PVβ、 PVAUC 各参数在对照组及肝纤维化各期组间两两比较均无统计学差异; 而 LPPI、 LPTP、δPI、δTP 在中重度组与轻度及无肝纤维化组组间比较有统计学差异，与肝 纤维化分期存在一定的相关性，随着肝纤维化程度的加重，呈现 LPPI 降低，LPTP 延长，δPI、δTP 增大的趋势。?根据 ROC 曲线，LPTP、δTP 对纤维化各期的鉴 别能力较好些 S?S2、S?S3、S?S4 时，AUC 分别为 0.812、0.860、0.822 和 0.808、 0.857、0.856。 结论:超声造影定量分析技术可通过肝内血流动力学变化间接反映 肝纤维化程度，对肝纤维化分期诊断有一定价值。 关键词:超声造影;肝纤维化; 分期;病理 3 山西医科大学硕士学位论文 Experiment study on real-time contrast-enhanced ultrasound and pathologic assessment for hepatic fibrosis staging Abstract Objective: To explore the liver perfusion characteristics of rats with hepaticfibrosis in different pathological stages by real-time ultrasound contrast technologyand evaluate the values of real-time ultrasound contrast technology in the assessmentof hepatic fibrosis stages. Method: 6 healthy rats were randomly selected as control group from 50healthy male Wistar rats and the rest 44 rats were dealed with thioacetamide TAAas hepatic fibrosis model group. 12 rats were randomly selected from model group in4W 8W and 12W after being molded and 2 rats were randomly selected from controlgroup to do real-time ultrasound contrast inspection. First the cross section whichcan clearly show aorta abdominalis inferior vena cava and portal vein vascular etc.great vessels were selected from the two-dimensional ultrasonogram next thereal-time ultrasound imaging procedures was switched to observe the liver perfusionstatus then the dynamic imaging was stored and transferred into computer. ByQontraXt quantitative analysis software the images were replayed frame by frame toobserve and record the arrival time of contrast medium to hepatic artery HAATportal vein PVAT and hepatic vein HVAT and calculated the hepaticartery-hepatic vein transit time HA-HVTT portal vein-hepatic vein transit timePV-HVTT.Then the region of interest was selected in the liver parenchyma andportal vein and the relevant time-intensity curve was obtained after that the liverparenchyma perfusion parameters were automatically concluded: peak intensityLPPI time to peakLPTP curve sharpnessLPβ the area under the curveLPAUCPortal vein perfusion parameters: peak intensityPVPI time to peak PVTP curvesharpnessPVβ the area under the curvePVAUC calculated the difference of thepeak intensityδPIand the peak timeδTP between the liver parenchyma and theportal vein. After examination all rats were killed and removed the liver forpathological staging. Compared the intrahepatic contrast medium arrival time and 4 山西医科大学硕士学位论文 perfusion parameters change status in different hepatic fibrosis periods between testgroup and control group and these quantitative parameters and pathological stagingof hepatic fibrosis was analyzed. For the parameters with differences between groupsthe groups were divided based on the severities of hepatic fibrosis S?S2 S?S3 S?S4 as different study endpoints after that the receiver operating characteristic curveROC was drawn to evaluate the diagnostic value. Results: 1 All of the 6 rats survived in the control group 1 rat in model groupdied in the the 10th week after molding and the rest 36 of 43 rats were only used foranalysis. According to Scheuer scheme the pathological stages were: 8 rats in S0stage 6 rats in S1 stage 7 rats in S2 stage 9 rats in S3 stage and 6 rats in S4 stage. 2Among the intrahepatic contrast arrival time parameters there was no statisticalsignificance of HAAT and PVAT between control group and test group in hepaticfibrosis periods. While HVAT PV-HVTT HA-HVTT exsited a certain correlationwith hepatic fibrosis stage and the parameters among mild and moderate to severeliver fibrosis groups had statistically difference. With the aggravation of liver fibrosisdegree the HVAT PV-HVTT and HA-HVTT showed the tendency of shortening. 3Among the liver parenchyma and portal vein perfusion parameters there was nostatistical significance of LPβ LPAUC PVPI PVTP PVβ and PVAUC between controlgroup and test group in hepatic fibrosis periods. While there was certain relevancebetween LPPI LPTP δPI δTP and hepatic fibrosis stage the parameters between mildand moderate to severe liver fibrosis groups were statistically different and with theaggravation of liver fibrosis degree the LPPI showed the tendency of decreasing. 4According to the ROC curve LPTP and δTP were with better identification ability indifferent fibrosis periods if S?S2 S?S3 S?S4 the AUC were respectively 0.8120.812 0.860 and 0.808 0.857 0.856. Conclusion: ultrasonic contrast quantitative analysis technology can indirectlyreflect the degrees of hepatic fibrosis by the intrahepatic hemodynamic changeswhich has certain value for diagnosis of hepatic fibrosis. Keywords: Ultrasound contrast;Hepatic fibrosis;Stageing;Pathology 5 山西医科大 学硕士学位论文 前 言 慢性肝病是一个世界性重要健康问题，病毒性肝炎是其最常 见病因。据 WHO 1统计 ，世界范围内已有约 20 亿人感染乙肝病毒，其中 3.5 亿 以上的人患有慢性感染，每年约有 50-70 万人死于乙肝病毒感染。乙型肝炎病毒慢性感染后，大部分患者将经历肝纤维化，最终发展为肝硬化。肝硬化作为慢性肝病发展的终末阶段，严重影响患者生活质量，而肝纤维化是慢性肝病发展成肝硬化的必经环节。研究表明若肝纤维化阶段给予适当治疗，可以发生逆转 2。因此，及早发现肝纤维化并采取有效治疗措施具有十分重要的临床意义。 肝组织病理学检查是目前临床诊断和判定肝纤维化分期的金标准3，但它属于有创检查，存在一定危险性，限制了其临床常规使用4。另外，有时会因穿刺活检样本量偏小造成误差5-6。因此，需要一种安全、无创、可靠的方法评估肝纤维化的严重程度。应用影像学检查方法无创评价肝纤维化严重程度一直是近年来研究的热点问题，但肝纤维化各期(乃至早期肝硬化)缺乏特异影像学表现。Bonekamp 等7的荟萃分析显示目前影像学手段可鉴别肝硬化(或严重肝纤维化)与正常肝，但对于轻度纤维化的准确分级与诊断还不能完全做到。超声检查作为一种常规评价弥漫性肝脏疾病的影像学手段，具有廉价、无创、可重复等优点。在临床工作中，常规超声虽对肝硬化的检出率较高，但对发展为肝硬化之前的肝纤维化严重程度的评估能力十分有限。 自超声造影CEUS技术提出以来，其临床应用为评估正常组织器官及病灶内血流动力学变化提供了一种新方法。超声造影属于功能性成像，可从微血管水平反映组织血流灌注情况，对组织血流动力学进行分析研究。近年来，它的临床应用已在很大程度上提高了超声对脏器局灶性良恶性病变诊断的准确率，但将其应用于脏器弥漫性病变的研究较少。肝脏是一个双血供器官，研究表明随着肝纤维化程度的加重，肝内血流阻力增加，门静脉血流量和肝实质灌注量均将减少，而肝动脉血流量代偿性增加8。因此，理论上这些血流动力学改变可能会反映肝纤维化的严重程度。行超声造影检查时，当一定量的造影剂团注进 6 山西医科大学硕士学位论文入血液后依据肝内不同感兴趣区声学强度随时间变化的规律可建立感兴趣区时间-强度曲线，它结合了造影的动态过程和声学强度的变化规律含有丰富的定量信息，因此有利于定量评估不同程度肝纤维化时肝脏的血流灌注情况。 本研究以大鼠肝纤维化模型为研究对象，采用实时造影匹配成像量化技术(CnTI)，配以第二代声学造影剂声诺维(SonoVue)，实时动态观察不同程度肝纤维化大鼠肝脏血流灌注情况。应用QontraXt定量分析软件，对不同程度肝纤维化大鼠模型肝内血流灌注情况进行定量分析，通过相关定量参数评价实时超声造影技术对肝纤维化分期的诊断价值。 7 山西医科大学硕士学位论文 资料与方法1. 材料1.1 研究对象 健康雄性Wistar大鼠50只，体重230,300g，由山西医科大学实验动物中心提供并喂养。自由饮水，统一标准饲料喂食。1.2 药品及试剂 造影剂SonoVue 意大利Bracco公司 硫代乙酰胺分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 0.9,氯化钠注射液 石家庄四药有限公司 水合氯醛 青岛龙宇海藻有限公司 HE染色液 山西医科大学第一医院病理科提供 Masson三色染色试剂盒 北京中山金桥生物技术有限公司 网状纤维染色试剂盒 北京中山金桥生物技术有限公司1.3 仪器 百胜Maylab90型彩色超声诊断仪，选用LA523、LA522宽频探头，具有实时超声造影匹配成像CnTI功能和QontraXt定量分析软件。2(方法2.1 大鼠肝纤维化模型的制作 将50只健康雄性Wistar大鼠随机分为造模组(44只)和对照组(6只)。将硫代乙酰胺(thioaeetamide，TAA)分析纯经生理盐水溶解成6溶液，每次给药前均新鲜配制。模型组:按0.15g/kg的剂量经腹腔注射TAA溶液，每周3次。对照组:每次按同等量经腹腔注射0.9,生理盐水。2.2 实验方法 于造模的4W、8W、 12W分别从造模组中随机取12只大鼠，从对照组中取2 8 山西医科大学硕士学位论文只大鼠行实时超声造影检查。实验前所有大鼠禁食禁水8h 10水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，剔去肝区体毛，仰卧位固定。造影前将超声造影剂SonoVue内注入5 ml生理盐水，充分摇匀配制成混悬液，配制好的混悬液在6小时之内使用，且每次使用前都再次摇匀。选择腹主动脉、下腔静脉及门静脉等大血管能同时较清楚显示的切面(图1)，切换至CnTI造影模式，用1mL注射器经尾静脉按0.1ml团注SonoVue混悬液，尾随快速注射1.0 ml生理盐水冲洗，注射即刻开始计时，持续记录5min造影动态过程，造影动态图像贮存于机器内置硬盘 造影结束后将其导入电脑，应用QontraXt定量分析软件对其进行分析。若造影过程失败，至少间隔10 min或应用闪烁显像(flash)技术清除肝内残留造影剂微泡，重复进行，直至造影成功。所有大鼠造影过程中仪器机械指数固定为0.07，增益、深度、TGC等均保持不变。2.3 病理观察 每次造影结束后将大鼠处死，开腹手术取出肝中叶，固定于10,福尔马林液中24 h以上，用石蜡包埋、切片，切片厚度为4,6 μm，之后分别行HE染色、Masson染色及网状纤维染色。在光镜下观察病理变化并对各只大鼠肝纤维化程度进行病理学分期。肝纤维化病理分期采用Scheuer方案9:S0:无纤维化;S1:汇管区扩大纤维化，局限窦周及小叶内纤维化;S2:汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留;S3:大量纤维间隔形成伴小叶结构紊乱，无肝硬化;S4:早期肝硬化。其中，无肝纤维化:S0期;轻度肝纤维化:S1期、S2期;中度肝纤维化:S3期;重度肝纤维化:S4期。2.4 图像分析(1)肝内造影剂到达时间及渡越时间等参数的测定 结合QontraXt定量分析软件，并动态回放造影的全过程，目测法记录造影剂到达时间。计时标准:将观察到造影剂在各血管腔内显影的时间记录为到达时间，分别有肝动脉到达时间(he.