长期吸入笑气对大鼠心肌功能的影响

长期吸入笑气对大鼠心肌功能的影响 范文 题目:长期吸入笑气对大鼠心肌功能的影响 编辑:司马小 作者:孙娜～杜剑青～王志勇～刘素蓉～徐燕～朱娟霞～李强 【摘要】 目的 观察长期吸入笑气(N2O)是否会引起大鼠心肌功能的变化。方法 将SD大鼠随机分为4组:空气吸入对照组(A组)～500mL/L N2O-15d吸入组～2h/d(B组)～500mL/L N2O-30d吸入组～2h/d(C组)～500mL/L N2O-50d吸入组～2h/d(D组)。用悬浮玻璃微电极记录离体心肌细胞的动作电位(APs)～观测上述4组大鼠离体左心室肌细胞APs时程(MAPD90、MAPD50、MAPD20)和幅值的变化,用免疫组织化学方法检测心肌细胞的一氧化氮合成酶(eNOS)及血管紧张素-2(Ang-2)表达量的变化。结果 ?与A组相比～B组大鼠心肌细胞的MAPD无明显变化～C、D组MADP显著延长～差异具有统计学意义(P<0.05)～但4组的APs幅值差异无统计学意义,?与A组相比～B组心肌细胞的Ang-2表达量无明显变化～C、D组Ang-2表达量显著增加,?与A组相比～C、D两组心肌细胞的eNOS表达量均明显减少(P<0.05)。结论 长期吸入笑气可引起大鼠心肌电活动明显变化～其很可能与交感神经长时间过度兴奋致使Ang-2的表达增加有关。 【关键词】 氧化亚氮,动作电位,免疫组织化学,血管紧张素-2,一 氧化氮合酶 ChinaABSTRACT: Objective To observe whether or not long-term inhalation of nitrous oxide can affect the cardiac function in rats. Methods Sprague-Dawley rats of either sex were randomly divided into four groups. Group A: inhaled common air for 50 days as control; Group B: inhaled 500mL/L N2O for 15 days, two hours every day; Group C: inhaled 500mL/L N2O for 30 days, two hours every day; Group D: inhaled 500mL/L N2O for 50 days, two hours every day. Float glass intracellular microelectrode recording technique was used for observation of the duration (MAPD90, MAPD50 and MAPD20) and amplitude of action potentials (APs) of left ventricular muscle cells in vitro. Angiotensin-2 (Ang-2) and eNOS were detected by immunohistochemical technique. Results ? Compared with that in Group A, the Aps duration of left ventricular muscle cells (MAPD) in Group B had no significant change while the MAPDs in Group C and Group D were extended significantly. There were no significant differences among the four groups in Aps amplitude. ? The expression of Ang-2 did not differ significantly between Group B and Group A. The expression level was higher in Group C and D than in Group A. ? The expression level of eNOS was significantly lower in Group C and D than in Group A (P<0.05). Conclusion Long-term inhalation of N2O can significantly affect the cardiac function in rats, which may be related to higher expression of Ang?in the heart induced by the long-time excitation of sympathetic nerves. KEY WORDS: nitrous oxide; action potential; immunohistochemistry; angiotensin ?; nitricoxide synthase 氧化亚氮(N2O)以致人发笑而得名为“笑气”。自1844年美国年 轻的牙科医生维尔斯首次公开使用笑气作为拔牙的麻醉镇痛剂以来～ 笑气在临床手术麻醉领域已被广泛应用。在我国～虽然缺乏有效的废 气处理系统～但各级医院仍普遍单独或联合使用笑气作为手术局部或全身麻醉的常规用药～尤以妇产科无痛分娩应用最多～特别是一些乡镇基层医院对笑气的使用更是有增无减[1-4]。近年来发现～作为医疗麻醉使用的笑气常常在娱乐场所被用于助兴狂欢～若不加管制的滥用～必将造成严重的不良后果。有人曾经在临床短期手术麻醉过程中对使用笑气患者的脑电图、心率、呼吸、血压以及产妇和胎儿的其他体征进行过一些观察[5-8]～但大多数主要关注的是笑气的镇痛效果及相关麻醉指标～很少有人能够注重长期接触笑气的安全性问题。本研究的目的是基于笑气的兴奋作用～探讨长期吸入笑气是否会造成大鼠心肌功能的损伤及其可能机制～从而对长期接触笑气的工作人员及滥用者进行防护提供重要的基础研究资料。 1 与方法 1.1 实验动物 清洁级成年SD大鼠～雌雄不拘～体重300，350g～随机分为4组～即A组:空气吸入对照组,B组:500mL/L笑气每天吸入1次～每次2h(下同)～连续吸15d,C组:500mL/L笑气连续吸30d,D组:500mL/L笑气连续吸50d。 1.2 试剂及仪器 S P系列免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),Ang-2多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc),eNOS多克隆抗体(北京莱博生物技术有限公司),常用试剂(本室配制)。小动物气体模型箱(自研～专利号:ZL 200620136476.9),BL-420f多导生理记录仪(成都泰盟科技有限公司),双通道记忆示波器(VC-10～日本NIHON KOHDEN公司),微电极放大器(MEZ-8201,日本NIHON KOHDEN公司),电子刺激器(SEN-3301～日本NIHON KOHDEN公司),数码刺激隔离器(SS-202J～日本NIHON KOHDEN公司)。 1.3 方法 1.3.1 笑气吸入实验及动物的行为观察 按分组及批次将大鼠臵于小动物气体实验箱内～每晚7时通入气体2h～通过透明的气体实验箱体观察动物的行为反应。通气后动物在实验箱内的行为表现与在箱外时相同～视为无变化(正常或无效)～如动物的行为动作多于或少于在箱外时的20%～视为有变化或有效。 1.3.2 大鼠离体心肌细胞动作电位的观察 实验采用改良的Krebs-Henseleit(K-H)灌流液(mol/L:NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、MgSO4 7、H2O 1.2、CaCl2 2.5、NaHCO3 25、葡萄糖11.1、EDTA-2Na 0.125)[9]～氧合后pH 7.35，7.45～流出液废弃不再使用。 乌拉坦(1g/kg)腹腔麻醉大鼠～随后腹腔注射肝素500u抗凝～迅速开胸取出心脏～臵于4?氧饱和后的无钙灌注液(含肝素35u/mL)中。在液面下快速进行主动脉插管并且清洗冠脉～剪除心脏其余部分～只保留左心室乳头肌组织～然后将心肌条快速臵于(32〒0.4)?恒温水浴槽中～针灸针固定～用含钙K-H液体持续灌流～整个过程在4min内完成。实验过程中始终通入950mL/L O2和50mL/L CO2的混合气～流量为200mL/min～并保持pH值为7.35，7.45～用电子刺激器以1次/s的频率、1.5倍阈值单极电刺激心肌组织使其复跳(参考电极固定于心肌无关位臵)～稳定30min后开始实验[10]。记录电极为悬浮玻璃微电极(尖端阻抗15，30MΩ)～由微操纵器调节其位臵～实验时使其尖端接触于心肌细胞表面并靠重力进入细胞内。心肌细胞的电信号由BL-420f生物信号系统处理和记录。MAPD90、MAPD50、MAPD20分别为动作电位(action potentials, APs)复极到90%、50%、20%时的时间(ms)。每个细胞连续记录10min～重复实验3次。 1.3.3 免疫组织化学方法测定心肌组织中eNOS、Ang-2的表达 将每次灌流后的心肌条臵于40g/L的多聚甲醛溶液中固定24h～制成蜡块备用。石蜡切片～脱蜡至水～将切片臵于枸橼酸盐缓冲液中～微波辐射修复相应的组织抗原～滴加30mL/L的H2O2～室温孵育30min～以消除内源性过氧化物酶的活性。用0.01mol/L的PBS冲洗3次～每次5，10min～用正常非免疫动物血清覆盖～封闭非特异性抗原～室温下孵育20min。滴加一抗(eNOS多克隆抗体1?500,Ang-2多克隆抗体1?400)～4?孵育48h～PBS冲洗(方法同上),滴加生物素标 记的二抗～室温孵育1h～PBS冲洗后滴加链菌素抗生物素过氧化物酶溶液～室温下孵育2h～PBS冲洗,显微镜下DAB溶液显色～自来水冲洗终止反应～苏木素复染～脱水封片。Cooled CCD采集图片～用Image-Pro-Plus图像分析系统进行图片处理。每张切片随机选取6个视野～测定其阳性染色的积分吸光度值(IA)作为表达量～IA值越高表明组织抗原含量即表达量越高。取6个视野的平均值作为该切片的IA值。 1.4 统计学处理 计量资料以〒s表示～用单因素方差分析和LSD-t检验对各组大鼠离体心肌电生理参数及免疫组化IA值进行统计学分析比较～P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 大鼠吸入笑气后的行为变化 A组～向实验箱内通入空气50d～动物行为表现正常,B组～通入500mL/L的笑气和500mL/L氧气15d～动物较对照组活跃～立身动作有所增加,C组～通入500mL/L笑气和500mL/L的氧气30d～实验当天动物的行为无明显变化～但4，5d后～动物表现异常活跃～打闹现象增多～立身动作也相继增加～即呈明显的兴奋状态,D组～通入500mL/L的笑气和500mL/L的氧气50d～动物的行为表现与C组相似～但在30d后～动物开始出现适应现象～除在箱内开始半小时内表现活跃外～之后其行为与日常活动无明显差别。 2.2 各组大鼠心肌细胞APs的变化 对4组大鼠心肌细胞的APs时程(MAPD)和幅值(APA)进行了组间比较～结果显示～与对照组A组相比～B组的MAPD50、MAPD20无明显变化～MAPD90出现了统计学差异(P<0.05),C组与D组的MAPD90、MAPD50、MAPD20均较对照组明显延长～并且笑气吸入时间越长～MAPD延长越明显～差异具有统计学意义(P<0.05)。各组APs的幅值差异无统计学意义(表1)。MAPD的变化说明～长期吸入笑气对大鼠心肌功能有一定的损伤性影响。表1 各组大鼠左心室心肌细胞MAPD、APA的比较,略, 2.3 各组间心肌细胞eNOS和Ang-2阳性表达量的比较 B、C、D组分别与A组相比～B组eNOS和Ang-2的表达量无明显变化,C、D组eNOS的表达量明显减少～而Ang-2表达量显著增加,C、D两组相比～eNOS表达量无差异～但D组Ang-2表达量较C组明显减少～差异有统计学意义(P<0.05～图1、图2、表2)。表2 各组大鼠心肌细胞eNOS和Ang-2表达量(IA)的比较,略, 3 讨 论 现今虽然在临床大手术中很少采用笑气作为吸入性麻醉剂～但在儿科拔牙、妇产科分娩镇痛中却应用的越来越多。尽管临床上将笑气作为镇痛而非麻醉剂使用～但在如此大的浓度下(500mL/L N2O～本实验所用浓度与临床应用相同)[11-12,19-20]～的确存在笑气残留及对局部环境的影响～所以医护人员和患者都会成为笑气的长期接触者和受害者。 长期以来～一直认为笑气是一种惰性气体～并无重要的生理效应～在氧充足的情况下～对机体心血管的影响甚微。麻醉学研究也认为笑气的代谢很快～一旦停止吸入～作用就会很快消失[13]。但是本实验结果显示～笑气吸入组大鼠心肌细胞的APs时程较正常组明显延长～这种现象一般在心肌梗死和心肌肥厚状态下才会出现。虽然本研究中的大鼠并没有出现明显的心肌肥厚现象～但由实验结果可知其电生理机制却已经发生了改变。有研究报道～笑气可以引起脑内多巴胺类物质增多～这种儿茶酚胺类物质可以造成短时间的高度兴奋。因而～长期吸入笑气～必然造成动物的交感神经系统总是处于兴奋状态～从而极大地增加了机体、尤其是心脏的能量消耗和氧债。实验所见心肌细胞APs的时程延长与吸入笑气的时间呈正相关～说明这种结果很可能与交感神经系统长期兴奋造成的心肌功能损伤有关。 本研究结果显示～长时间吸入笑气可以导致心肌组织Ang-2含量明显增加～eNOS含量明显减少。已有研究表明～血管紧张素可促进儿茶酚胺类物质释放～其中包括Ang-2[19]。Ang-2对心脏有生长因子样作用～可诱导心肌细胞蛋白质含量增加～同时可通过Ang2-1型(AT1)受体使细胞内钙离子浓度升高～并通过刺激非心肌细胞的组织生长～引起心肌肥厚[14-15]～而NO却可以阻断Ang-2的这种作用[16]。心肌 的eNOS表达减少～说明NO的合成量减少。长期吸入笑气导致的Ang-2 含量增加和eNOS含量减少～很可能间接引起心肌功能损伤。另有研究 发现～笑气可以激活脑内阿片类受体[17]。何萍等人[18]认为～吗啡 等阿片类物质长期应用会使交感神经节兴奋性突触传递形成耐受。从 本研究的表2中可以发现～尽管D组大鼠笑气的吸入时间最长～但其 Ang-2含量却较C组明显减少～这是否与长时间吸入笑气产生了耐受有 关～需要进一步观察。 综上所述～本研究结果提示～长期接触笑气对心肌组织有损伤作用。 尽管本实验中大鼠心肌组织没有出现明显的病理学变化～但是其电生 理学和分子生物学方面的早期改变已经说明心肌组织正在向病变期发 展。 【参考文献】 FUJINAGA M, MAZE M. Neurobiology of nitrous oxide-induced antinociceptive effects [J]. Mol Neurobiol, 2002, 25(2):167-189. NAIDU S, LOUGHLIN P, COLDWELL SE, et al. A randomized controlled trial comparing mandibular local anesthesia techniques in children receiving nitrous oxide-oxygen sedation [J]. Anesth Prog, 2004, 51(1):19-23. 袁新枝. 3种镇痛方法在人工流产术中的应用比较 [J]. 中国妇幼 保健, 2005, 20(8):943-944. 岳峰～孟庆荣～王晓娟. 笑气吸入联合药物局部注射行分娩镇痛 490例临床研究 [J]. 现代妇产科进展, 2005, 14(4):333-334. 曾玉华～周昌菊～欧阳文. 腰麻复合硬膜外阻滞和笑气吸入用于 无痛分娩的效果评估(英文) [J]. 中国医学, 2004, 12(3):13-17. 胡晓～吴新民～孟美金. 通过脑电功率谱观察笑气的麻醉作用 [J]. 临床脑电学杂志, 1995, 4(3):151-153. ASHKENAZI M, BLUMER S, ELI I. Effectiveness of computerized delivery of intrasulcular anesthetic in primary molars [J]. J Am Dent Assoc, 2005, 136(10):1418-1425. [8]王璐～刘惠莉～常彩虹. 导乐式分娩配合吸入笑气分娩镇痛50 例效果观察 [J]. 郑州大学学报:医学版, 2005, 40(5):944. [9]钱丽～朱姗姗～增因明. 异氟烷预处理对大鼠离体心脏缺血再 灌注损伤的保护作用 [J]. 中国麻醉学杂志, 2006, 26(1):49-52. Electrophysiological changes in rat ventricular and atrial myocardium at different stages of experimental diabetes [J]. Acta Physiol Scand, 1999, 166:7-13. [11]WALKER DJ, ZACNY JP. Analysis of the reinforcing and subjective effects of different doses of nitrous oxide using a free-choice procedure [J]. Drug Alcohol Depend, 2002, 66:93-103. [12]RAMSAY DS, WATSON CH, LEROUX BG, et al. Conditioned place aversion and self-administration of nitrous oxide in rats [J]. Pharmacol Biochem Behav, 2003, 74:623-633. [13]孙大金～杭燕南. 实用临床麻醉学 [M]. 北京:中国医药科 技出版社, 2001:52-55. [14]BRILLA CG, SCHEER C, RUPP H. Angiotensin ? and intracellular calcium of adult cardiac fibroblasts [J]. Mol Cell Cardiol, 1998, 30(6):1237-1246. [15]DOSTAL DE, BOOZ GW, BAKER KM. Angiotensin II signalling pathways in cardiac fibroblasts: Conventional versus novel mechanisms in mediating cardiac growth and function [J]. Mol Cell Biochem, 1996, 157:15-21. [16]吴扬～胡亚娥. NOS和PTEN在血管紧张素?诱导心肌细胞肥 大中的作用 [J]. 中国应用生理学杂志, 2005, 21(1):41-45. [17]FANG F, GUO TZ, DAVIES MF, et al. Opiate receptors in the periaqueductal gray mediate analgesic effect of nitrous oxide in rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997, 336:137-141. [18]何萍～莫宁～于洪波. 吗啡耐受与依赖对大鼠交感神经节兴 奋性突触传递的影响 [J]. 中国药理学通报, 2006, 22(10):1206- 1211. [19]GUO TZ, POREE L, GOLDEN W, et al. Antinociceptive response to nitrous oxide is mediated by supraspinal opiate and spinal alpha 2 adrenergic receptors in the rat [J]. Anesthesiology, 1996, 85(4):846-852. [20]DORRIS RL, TRUONG V. Locomotor effects of nitrous oxide in mice: requirement of newly-synthesized and main intraneuronal storage pools of dopamine [J]. J Pharm Pharmacol, 1993, 45(4):315-316.