丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的生态毒性效应研究

丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的生态毒性效应研究 丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的生态毒性效应 研究 摘要 本论文以2种海洋经济微藻??亚心形扁藻Platymonas subcordiformis 和杜氏盐藻Dunaliella salina为试验藻种,研究了2种常用农药??高效氯氰菊酯和丁草胺对2种海洋微藻的单一毒性效应和联合毒性效应。 急性毒性试验结果显示,丁草胺对杜氏盐藻24h、48h、72h和96h的半抑制效应浓度(EC50)分别为:0.0117mg/L、0.0187mg/L、0.0236mg/L、0.0241mg/L;丁草胺对亚心形扁藻24h、48h、72h和96h的半抑制效应浓度(EC50)分别为: 1.436mg/L、2.735mg/L、3.271mg/L、3.323mg/L;高效氯氰菊酯对杜氏盐藻24h、48h、72h和96h的半抑制效应浓度(EC50)分别为:7.74mg/L、8.45mg/L、10.35mg/L、13.47mg/L;高效氯氰菊酯对亚心形扁藻24h、48h、72h和96h的半抑制效应浓度(EC50)分别为:1.78mg/L、2.53mg/L、2.9mg/L、3.93mg/L。慢性毒性试验结果显示,杜氏盐藻和亚心形扁藻在2种农药96h EC50长时间作用下,细胞密度、光合色素和蛋白质的含量均发生了不同程度的变化。联合毒性试验结果显示,丁草胺和高效氯氰菊酯对2海洋微藻的毒性24h时表现为协同作用, 48h、72h、和96h均表现为拮抗作用。 研究结果表明,在实验设定的浓度范围内,丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的生长均有不同程度的抑制作用,且抑制程度与农药浓度呈正相关。2种农药对同一种海洋微藻的毒性有显著性差异,2种海洋微藻对同一种农药的敏 感性也有很大差异。按照农药对藻类的毒性分级划分等级:以杜氏盐藻为试 验生物时,丁草胺为高毒性农药,高效氯氰菊酯为低毒性农药;以亚心形扁藻的试 验生物时,高效氯氰菊酯和丁草胺均为低毒性的。急性毒性、慢性毒性及联合毒 性的所有试验结果均表明,2种农药的毒性随着时间的延长逐渐减小。 本论文的研究结果不仅为农药的毒性评价、危险性评价以及农药对藻类 作用机理的进一步研究提供了基础数据,而且在水环境农药污染的生物监测方面 有着重要应用价值,可以为保护海洋生物资源、海洋环境评价以及生态系统的稳 定性评价提供参考。 关键词 高效氯氰菊酯 丁草胺 杜氏盐藻 亚心形扁藻 急性毒性慢性毒性 联合毒性 AbstractThis paper studied single toxicities and joint toxicities of beta-cypermethrin and butachlor on Platymonas subcordiformis and Dunaliella salinamarine economy microalgae The results showed that, the 24h-EC50、48h-EC50、72h-EC50 and 96h-EC50 of butachlor to Dunaliella salina were 0.0117mg/L、0.0187mg/L、0.0236mg/L and 0.0241mg/L, the 24h-EC50、48h-EC50、72h-EC50 and 96h-EC50 of butachlor to Platymonas subcordiformis were 1.436mg/L、2.735mg/L、3.271mg/L and 3.323mg/L,the 24h-EC50、48h-EC50、72h-EC50 and 96h-EC50 of beta-cypermethrin to Dunaliella salina were 7.74mg/L、8.45mg/L、10.35mg/L and13.47mg/L, the 24h-EC50、48h-EC50、72h-EC50 and 96h-EC50 of beta-cypermethrin to Platymonas subcordiformis were 1.78mg/L、2.53mg/L、 2.9mg/L and 3.93mg/L. In the chronic toxicity test, cell density、 concentration of photosynthesis pigments and protein of Platymonas subcordiformis and Dunaliella salina were influenced differently. The results of the joint toxicity test showed that, beta-cypermethrin and butachlor were synergistic of their toxicity in 24h, but antagonistic in 48h、72h and 96h respectively. The results indicated ,the growth of Platymonas subcordiformis and Dunaliella salina were restrained in the exposed concentration of beta-cypermethrin and butachlor. The inhibition degree was related to the concentration of the pesticides,the inhibition degree was higher when the concentration of pesticides was higher. The toxicities of the two kind of pesticides to the same kind of algae were significantly different, the tenderness of the two kind of algaes to the same kind of pesticide were different too. Rank the toxicities of butachlor and beta-cypermethrin according to the toxicity classification of pesticide: Butachlor was high toxic to Dunaliella salina,but was low toxic to Platymonas subcordiformis; Beta-cypermethrin was low toxic to Platymonas subcordiformis and Dunaliella salina. This study not only offers basic data for toxicity assessment, risk appraisement of pesticide and the further study of toxicity mechanisms of pesticide, but also it was important in biotest on the water environment pesticide pollutant ,offer basic data for protection of halobios fountain, ocean entironment and stabilization assessment of the ecosystemKey words: beta-cypermethrin butachlor Platymonas subcordiformisDunaliella salinaacute toxicity chronic toxicity joint toxicity 目录 一 前 言 3 1.1 农药对藻类的毒性及其毒性机理研究 4 1.2 农药对藻类群落的毒性效应研究 5 1.3 藻类对农药的富集及降解作用研究 5 1.4丁草胺和高效氯氰菊酯的利用及生态影响 6 二 材料和 8 2.1 实验材料 8 2.1.1 实验藻种 8 2.1.2 实验农药 8 2.1.3 实验所需主要仪器 8 2.2 藻种的培养 8 2.3 生长曲线的测定 9 2.4 农药毒性EC50的计算方法及农药联合毒性的评价方法 9 2.4.1 半抑制效应浓度EC50的计算方法 9 2.4.2 联合毒性的评价方法 10 2.5 光合色素的提取及其含量的测定 10 2.6 可溶性蛋白质的提取及其含量的测定 10 2.7 农药对藻类的毒性试验 11 2.7.1 急性毒性试验 11 2.7.1.1 预备试验 11 2.7.1.2 正式试验 11 2.7.1.3 联合毒性试验 11 2.7.2 慢性毒性试验 11 三 结果与分析 12 3.1 2种海洋微藻的生长曲线 12 3.2 丁草胺对2种海洋微藻的毒性效应 12 3.2.1 急性毒性试验 12 3.2.1.1 半抑制效应浓度(EC50) 12 3.2.1.2 光合色素含量的变化 14 3.2.2 慢性毒性试验 17 3.2.2.1 2种海洋微藻的生长曲线 17 3.2.2.2 光合色素含量的变化 19 3.2.2.3 可溶性蛋白质含量的变化 21 3.3 高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的毒性效应 21 3.3.1急性毒性试验 21 3.3.1.1 半抑制效应浓度(EC50) 21 3.3.1.2 光合色素含量的变化 23 3.3.2 慢性毒性试验 26 3.3.2.1 2种海洋微藻的生长曲线 27 3.3.2.2 光合色素含量的变化 28 3.3.2.3 可溶性蛋白质含量的变化 30 3.4 丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻的联合毒性效应 30 3.4.1 半抑制效应浓度(EC50) 30 3.4.2 光合色素含量的变化 33 3.4.2.1 亚心形扁藻藻液中光合色素含量的变化 33 3.4.2.2 杜氏盐藻藻液中光合色素含量的变化 34 四 讨 论 37 4.1 计算农药对藻类毒性半抑制效应浓度(EC50)指标的选择 37 4.2 丁草胺和高效氯氰菊酯对2种海洋微藻生长的影响 37 4.3 丁草胺和高效氯氰菊酯的毒性等级划分 38 4.4 半抑制效应浓度农药对2种海洋微藻的长期毒性效应 38 4.5 丁草胺和高效氯氰菊酯对藻类的联合毒性效应 38 4.6 农药对海洋微藻的毒理研究展望 39 五 结论 40 六 参考文献 41 七 学习期间发表论文 46 八 致谢 47 一 前 言 生态毒理学(Ecotoxicology)是70年代初期发展起来的一个毒理学分支,是生态学与毒理学之间相互交叉渗透的一门新型边缘学科[1]。它的出现在很大程度上是由于环境污染促使传统的毒理学研究从个体效应扩大到群体效应而产生的。自从1978年国际科联环境问委员会(SCOPE)提出生态毒理学以来,随着环保事业的迅速发展,这一学科也蓬勃发展,取得了长足的进步。生态毒理学主要是研究有毒污染物对生物个体、种群、群落和生态系统的毒性效应,以及从分子、细胞、组织和器官等层次和生理、代谢、发育、遗传等生命现象水平研究其与有毒污染物的相互关系及其作用机理,并揭示生物的适应机制和确定反映环境胁迫的指示特征。藻类作为水生态系统的初级生产者,能通过光合作用为无脊椎动物、鱼类、鸟类等提供氧气、食物,其种类多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能。有毒污染物质对藻类的影响将会直接或间接地危害水生态系统的 健康,开展藻类生态毒理学的研究,不仅对揭示有机污染物在生态系统中的行为及其危害机制具有重要的意义,同时也可以为污染物的生态风险评价、水体污染物排放的管理以及水环境质量标准的制定提供藻类生物学的科学依据。 随着现代农业的发展,农药正越来越广泛地应用于农业、林业和牧业生产,世界范围内使用的农药品种越来越多,用量不断增加。目前世界上生产的农药品种大约有700多种,主要有有机氮、有机磷和氨基甲酸酯类化合物。目前我国农药使用以杀虫剂为主,占农药总产量的77.76%,其中又以甲胺磷、乐果等毒性较高的品种使用量为多[2]。我国农药的使用量最高的为0.3kg/亩,1989年全国农药平均施用水平为0.097kg/ 亩[3]。农用农药实际用量1997年和1998年分别为21.0万t和22.65t[4].施于环境中的农药,不仅作用于靶生物以防治病害、去除杂草,而且对于非耙生物[5]产生影响,导致生态系统结构改变,功能被破坏。农药作为一类有毒化合物,过去大量的报道见于农药对鸟类[6]、无脊椎动物[7]、鱼类[8,9,10]哺乳动物[11]的影响及其毒理学研究。近十余年来,随着对有毒物质的生态效应的研究由单一物种向生态系统整体效应的更大关注,农药对生态系统的初级生产者藻类的毒性及其生态毒理学研究引起了国内外学者的广泛关注[12]。 藻类由于其对毒物敏感、易获取、个体小、繁殖快。在较短的时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价,是一个很好的测试生物。许多国家在化学品风险测试中选用藻类进行生物测试,并建立了许多藻类生物测试标准方法。开展农药对藻类生态毒理学研究,不仅对于了解农药对单种藻类和藻类群落的毒性效应以及对农药的生态风险性评价而言是重要的,而且对于认识农药对生态系统结构和功能的整体效应,揭示农药在生态系统中的迁移和转化规律,以维护生态系统的健康也有重要的理论意义。 1.1农药对藻类的毒性及其毒性机理的研究 农药对藻类的毒性性质和大小主要由农药的化学结构和理化性质决定,不同农药对藻类的毒性不同。农药的化学结构决定农药的生理活性和毒性。有机磷农药以P为中心,其生理活性和毒性可判断如下:1以P为中心的共价结合是O还是S ,如对硫磷中的S被O取代,毒性明显增大,可达1000?10000倍。2与磷酸基上O 结合的R1和R2烷基情况及是否有焦磷酸基,R1和R2烷基结构越复杂毒性越大。3R3烷基情况,为亚烷基时农药浸透性强易于作用于生物体,产生毒性[13]。农药的辛醇/水分配系数、溶解度、分子连接性指数、分子表面积、摩尔体积和有机物相对保留时间是评价农药对环境危害的主要参数。这些参数不仅可表示和预测其毒性,还可以表示和预测如吸附系数、生物富集因子BCF等一系列有机污染物的生态毒理学性质[14]。 农药对藻类的毒性表现为对藻类的杀灭和生长的抑制作用,以其半数生物受影响的EC50表示,常常被用来评价农药对环境安全性。其毒性分级参考标准[15]为在96h EC50的大小:低毒性EC50>3.0mg/l;中毒性EC503.0~0.3mg/l;高毒性EC50<0.3mg/l。 藻类对农药的反应主要表现在生长[16,17,18]、生理生化[19,20,21,22,23]、形态[24,25,26,27]等方面。其中单一农药对藻类的毒性作用研究最多。大量的文献发现,不同的农药对藻类的毒性不同,藻类对农药的反应在很大程度上与农药的浓度相关,大量的实验研究结果表明低剂量的农药对藻类有促生长的作用[28,29,30],而高浓度的农药一般都会对藻类的生长产生严重的抑制作用。农药对藻类的毒性除了与藻的种类和农药的性质有关外,还受到多种环境因子的影响,如pH值[31,32,33]、光照强度[34,35]、营养物[36,37]、农药 助剂[38,39,40,41]和温度[42]等。同一种藻对不同农药的反应也不同。进入环境中的农药并不是单一的,它们经常与其它物质共同作用,表现为联合毒性[43,44,45,46]。农药对藻类的联合毒性一般表现为加和、拮抗、和协同作用。一定浓度的农药也会使藻类细胞内的生化组分(碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等)含量发生变化。 藻类对农药反应的机理一般表现为藻类的光合作用[47,48,49,50,51]、呼吸作用[52,53]、生物膜[54,55,56]、固氮作用[57,58,59]和藻类生化组分等受到农药的影响。大量的研究表明,藻类对农药反应的机理一个重要的方面是藻类光合作用受到农药的影响。 1.2 农药对藻类群落的毒性效应 大量的研究表明,不同藻类对农药的敏感性不同。原先许多人认为农药对藻类种群结构的影响发生在种的水平,后来发现同一种藻的不同品系对农药的敏感性不同,甚至相差十多倍[60]。表明农药对藻类种群的影响发生在种下水平[61]。由于不同藻对农药的敏感性不同,农药的使用导致敏感种逐渐消失,抗性种逐渐占据优势,因而改变藻类种群的组成,藻类的多样性指数也下降,进而影响藻类种群的结构和功能。由于除草剂莠去津使用得较为广泛,莠去津[48]对藻类群落组成、结构得研究较多。 不同农药处理下的藻类组成的变化是不同的。黄玉瑶等[79 ]报道了在低浓度的单甲脒环境中,藻类种类、密度、多样性指数明显下降,浓度越大下降越明显。藻类密度一周后逐渐恢复,甚至可达到或超过对照水平;但种类、多样性指数不能恢复。绿藻比例随单甲脒浓度增加逐渐增加,硅藻、蓝藻、裸藻比例下降,其它隐藻、金藻、黄藻和甲藻等基本消失。Kobraei 和White[50 ]研究了2,4-D 对Kentucky 湖藻类群落的影响,发现2,4-D在高浓度时,鱼腥藻、鱼磷藻 Maallomonas、菱形藻、颤藻、衣藻和裸藻受其影响不大,栅藻、舟形藻、盘星藻Pedias rum、拟小桩藻Characiopsis、直链藻Melosira和脆杆藻Fragilaria即使在浓度最低时也很敏感。杀草快也能改变藻种群结构和功能,在杀草快处理下,蓝藻最为敏感第3天即急剧下降;第14天硅藻明显下降;随后为柱状绿藻;第21天丝状绿藻减少;单细胞绿藻抗性较强,其中又以卵囊藻Oocystis为最强[79 ]。 1.3 藻类对农药的富集及降解作用的研究 农药的生物降解研究主要集中在细菌方面。近年来,发现藻类也能有效地降解农药,因此对于藻类富集、降解农药的研究也不断增多。 农药的生物富集对于了解农药的毒性及其在水生态系统中的迁移以及对其它生物的作用很重要。藻对农药的富集系数从1×105~106,具有很高的富集能力,藻类富集农药有三个生态学意义:1富集程度决定作用位点的农药浓度,而浓度是影响藻毒性的重要指标;2农药的富集可避免或减少农药对其它生物的影响;3藻富集农药是毒物物理转移的一个重要途径,可通过食物链在高浓度水平转移毒物。大量的实验表明藻类富集农药并不受细胞生长、代谢速率变化的影响,最大富集量一般出现在农药低浓度而藻类生长率最高时。 许多研究发现藻不仅能富集农药,还能将农药降解为无毒化合物或以农药为磷源、氮源生长。如藻能将DDT降解为DDD和DDE[48]。藻类还能将艾氏剂转化为狄氏剂,有的进一步降解为反-艾氏二醇[62]。林克氏念珠藻、聚球藻核小席藻能降解久效磷和喹硫磷[63]。 藻类能富集农药主要在于其巨大的总表面积和藻细胞的特殊胞外组分及 细胞形态。农药进入细胞并达到酶活性部位的过程、降解途径中酶系的诱导、毒性物质的形成以及基础酶的缺乏是影响藻类富集、降解农药的四个基本因素。在生态毒理学中,有机物定量结构??活性相关模型QSAR 已应用于预测有机污染物的毒性、吸收、迁移、转化和降解的研究。随着研究的进一步深入,系统地了解有机物结构与生物富集、降解的内在联系和生物富集、降解途径及机制,QSAR 可以更精确地预测包括农药在内的化合物的生物富集和降解性[64,65]。 1.4 丁草胺和高效氯氰菊酯的利用及生态影响 丁草胺(butachlor),化学名称:N-丁氧甲基-a-氯-2',6'-二乙基乙酰替苯胺, 具有轻微芳香气味,挥发性小,熔点:0.5-1.5?,沸点156?,分解温度165?,蒸汽压6.0×10-4Pa(25?),20?在水中溶解度为20mg/L,密度1.07-1.059。可溶于乙醚、丙酮、乙醇和乙酸乙脂中,可被强酸和强碱所水解,对紫外光稳定。丁草胺是我国除草剂中生产量和使用量最大的品种,也是我国在水稻田使用量最大的三种除草剂之一,年使用量超过5×103t[66] ,被广泛地用于水稻田防除一年生禾本科杂草、一些莎草科及阔叶杂草,已有的研究表明丁草胺不仅在土壤中具有明显的持留性[67],且对水生生物有较高的毒性[68],丁草胺的作用机制是在杂草内部抑制蛋白质的合成,而使杂草死亡可以抑制植物的呼吸作用或作为电子传递链的抑制剂抑制光合作用中的希尔反应、解偶联剂而抑制植物的光合作用[69]。 拟除虫菊酯类杀虫剂是八十年代崛起的一类杀虫剂,目前仅次于有机磷类、氨基甲酸酯类,约占世界杀虫剂的20%。其中氯氰菊酯为我国仅次于氰戊菊酯的第二大拟除虫菊酯类杀虫剂。高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)是一种含 有苯氧烷基的环丙烷酯农药,化学名称为:2, 2-二甲基-3-2,2-二氯乙烯基环丙烷羧酸-α-氰基-3-苯氧基-苄酯,是氯氰菊酯的高效异构体,其杀虫活性比氯氰菊酯高1倍左右,自20 世纪70 年代中期以来,因其具有高效低毒的优点,得到了广泛的应用.随着应用范围的扩大,高效氯氰菊酯在水环境中存在的剂量日渐增加,由此对水体造成的负面影响受到广泛的关注。目前,有关高效氯氰菊酯对鱼、蚤等水生生物毒性及生理生化的影响已有不少报道[70],对海洋微藻的研究还尚未见报道。 随着农药毒理学的研究和发展,国内对新农药对陆地生物和淡水生物的毒性进行了大量的研究工作,但是很少涉及海洋生物。事实上,近些年来,由于某些沿海农药厂的排污和农药的大量使用,使部分农药通过各种途径流入海洋,成为威胁海水水质的主要污染物质之一,对海洋生态系统产生影响,因此研究农药对海洋生态系统的影响势在必行。 海洋单细胞藻类大多对农药比较敏感,作为海洋初级生产力,它们在海洋食物链中占有重要的地位。评价农药对海洋环境污染时,研究农药对藻类的毒性影响有着十分重要的意义,可以为保护海洋生物资源,海洋环境评价提供基础数据,还可以选择比较敏感的藻或指标作为海洋环境的评价指标。 二 材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验藻种:亚心形扁藻Platymonas subcordiformis 和杜氏盐藻 Dunaliella salina由暨南大学水生所藻种室提供。 2.1.2 实验农药:50%丁草胺乳油和4.5%高效氯氰菊酯乳油,购于广州市农 业生产资料公司。 2.1.3 实验所需主要仪器表1 实验所需的主要设备 Table 1 Main equipment for experiment 仪器名称 Name 型号 Model 厂家 Producer 紫外可见分光光度计 TU-1900 北京 冰箱 BCD-268WB 广州 超净工作台 SW-CJ-1F 苏州 光照培养箱 CC275TL2H 杭州 双目显微镜 Olympus CX41 日本 自动蒸汽高压灭菌锅 D-1 北京 超声波细胞破碎仪 JY96-II 宁波 高速离心机 TDL-5 北京 恒温水浴锅 DK-S26 上海 电热恒温干燥箱 ZBY149-83 上海 2.2 藻种的培养 培养条件:f/2培养基(见表2),光照强度100-130μphotons/m2.s, 光:暗12h:12h,pH值7.0?8.0,温度24?,盐度为30左右。 表2 f/2(Guillard,1992)改良配方 Table 2 Reformed f/2 culture media Number Nutrient Work liquormg/l Mother liquorg/l 1 NaNO3 75 75 2 NaH2PO4.H2O 5 5 3 Na2EDTA 4.36 4.36 4 FeCl3.6H2O 3.16 3.16 5 CuSO4.5H2O 0.01 0.01 6 ZnSO4.7H2O 0.023 0.023 7 CoCl2.6H2O 0.012 0.012 8 MnCl2.4H2O 0.018 0.018 9 Na2MoO4.2H2O 0.07 0.07 10 维生素B1 0.0001 0.0001 11 维生素B12 0.0005 0.0005 12 生物素 0.0005 0.0005 13 人工海水 1000ml 藻类培养母液:按表2中用量将前2种,3-9种,10-12种分别配制成母液称A,B,C溶液。A,B均为1000mL,常温黑暗处保存;C溶液中维生素均用医用针剂,生物素经0.45μm微孔滤膜过滤除菌,用灭菌蒸馏水定容至1000mL,置于4?保存。 藻类培养工作液:分别加A,B,C溶液1mL于1000mL人工海水(见表3) 中,120?高压灭菌20min,放置于培养箱中备用。将杜氏盐藻和亚心形扁藻在无菌条件下转至已灭菌的f/2培养基中,培养至对数生长期用于实验。 表3 人工海水 Table 3 Artificial seawater 溶液类型 试剂种类 分子量 MW g/Kga 溶液? NaCl 58.44 20.758 Na2SO4 142.04 3.477 KCl 74.56 0.587 NaHCO3 84 0.17 KBr 119.01 0.0845 H3BO3 61.83 0.0225 NaF 41.99 0.0027 溶液? MgCl2.6H2O 203.33 9.395 CaCl2.2H2O 147.33 1.316 SrCl2.6H2O 266.64 0.0214 2.3 生长曲线的测定 将杜氏盐藻和亚心形扁藻分别以一定的细胞密度接种于f/2培养基中,按照2.2中培养条件进行培养。每天取样,采用血球计数板在双筒显微镜下进行细胞计数,以2种海洋微藻的细胞密度为纵坐标,培养时间为横坐标,作出2种海洋微藻的生长曲线。 2.4 农药毒性EC50的计算和农药联合毒性的评价方法 2.4.1 半抑制效应浓度EC50的计算方法:(概率单位-浓度对数法)[77] 比生长率(μ)的计算方法:μ=(LnNt-LnN0)/t-t0 Nt,N0:分别为t时刻(t)和开始期(t0)的细胞数 抑制率(%)(μ对照组-μ处理组)/μ对照组×100% 根据抑制率的概率单位与相应的浓度对数,用直线回归法得到浓度效应方程: 概率单位(Y)b×浓度对数(X)+a,并将回归方程进行F检验,p<0.05表示结果可靠。抑制率的概率单位为5时,得到的浓度对数取反对数即为所求半抑制效应浓度EC50。 2.4.2 联合毒性的评价方法[43] 实验得到单一毒性和联合毒性EC50后,用水生生物毒性联合效应相加指数法[71]进行联合毒性的评价。Sam/ an+ bm/ bn+ cm/ cn+…… 式中,S为对水生生物毒性相加之和;an 、bn 、cn分别为a、b、c等农药的毒性EC50;am 、bm 、cm分别为混合农药的EC50。 当S?1时:AI1/S-1.0 当S>1时:AI1.0-S 用相加指数AI评价农药的联合效应: AI>0为协同作用Synergism;AI<0为拮抗作用Antagonism;AI0为相加作用Addition。 2.5 光合色素的提取及其含量的测定??分光光度法[77] 取2ml藻液,离心15min,亚心形扁藻离心速率为10000r/min,杜氏盐藻离心速率为5000r/min,倒去上清液,加入5ml90%的丙酮溶液,黑暗低温处静止抽提24h,然后离心15min,离心转速同上,取上清液置于1cm的石英比色皿中,以90%的丙酮溶液作参比,用紫外-可见分光光度计测定提取液663nm、645nm和440nm波长处的吸光值。根据下列计算各种光合色素的浓度(mg/L): 叶绿素a12.7OD663-2.69OD645 叶绿素b22.9OD645-4.68OD663 叶绿素总量叶绿素a+叶绿素b20.2OD645+8.02OD663 类胡萝卜素4.70OD440-0.27(叶绿素a+叶绿素b) 2.6 可溶性蛋白质的提取及其含量的测定??紫外吸收法[72] 取10ml藻液,离心15min,亚心形扁藻离心速率为10000r/min,杜氏盐藻离心速率为5000r/min,去上清后加入10ml蒸馏水,再用超声细胞波破碎仪进行冰浴细胞破碎,然后再离心15min,亚心形扁藻的离心转速为10000r/min,杜氏盐藻的离心转速为6000r/min,取上清液置于1cm的石英比色皿中,用蒸馏水作参比,于紫外分光光度计上测定280nm和260nm波长处上清液的吸光值,并依据下列公式计算藻体内可溶性蛋白质的含量: 蛋白质含量mg/ml1.55A280-0.76A260 2.7 农药对藻类的毒性试验[73] 2.7.1 急性毒性试验单一毒性和联合毒性 2.7.1.1 预备试验 将培养至对数期的藻种接种于7个装有100mLf/2培养基的250mL三角烧瓶中,配制一系列浓度的高效氯氰菊酯和丁草胺,分别加入培养藻的三角烧瓶中,一个设为对照组(不加任何农药),一次性培养至96h,分别取样计算每个三角烧瓶中的细胞密度,计算出农药对各种藻的不可见效应浓度(NOEC)和全致死效应浓度。不可见效应浓度可以用下述方法确定[81]:通过方差分析,与空白对照组没有显著性差异的最高浓度,可以认为是NOEC值;根据实验得到的良好的浓度-效应关系,与空白对照组相比,影响程度低于5%的也可以当作NOEC值。 2.7.1.2 正式试验 根据预备试验结果,在确定的浓度范围内设置8个浓度处理组和1个空白对照组,每个浓度组设3个平行,将培养至对数生长期的藻种接种于装有100mLf/2培养基的250mL三角烧瓶中,按照设置的8个浓度分别加入不同量的农药,培养96h.每天测定细胞密度和光合色素的含量,并根据藻细胞密度求出各个时段的半抑制效应浓度EC50。 2.7.1.3 联合毒性试验 根据单一农药的急性毒性试验结果,按毒性单位1:1将丁草胺和高效氯氰菊酯混合,其余步骤同1和2中所述。 2.7.2 慢性毒性试验 根据急性毒性的试验结果,选择96hEC50为杜氏盐藻和亚心形扁藻的胁迫浓度,每个浓度设置3个平行,将培养至对数生长期的藻种接种于装有300mL培养基的500mL的三角烧瓶中,同时加入不同量的2种农药,培养19d。隔天取适量的藻液,分别测定藻的细胞密度、藻体内可溶性蛋白质和光合色素的含量。 三 结果与分析 3.1 2种海洋微藻的生长曲线 2种海洋微藻大约在第8d处于对数生长后期,此时海洋微藻的生命力较强,在后续实验中均接种培养8d的藻种。亚心形扁藻和杜氏盐藻的最大细胞密度分别为478×104cells.mL-1和 630×104cells.mL-1。 3.2 丁草胺对2种海洋微藻的毒性效应 3.2.1 急性毒性试验 3.2.1.1 半抑制效应浓度(EC50) 急性毒性试验结果显示,加入丁草胺的各组处理中杜氏盐藻和亚心形扁藻的生长均受到不同程度的抑制,且抑制程度与农药的浓度呈正相关,显示出明显的浓度-剂量效应相关性:随着农药浓度的增大,藻细胞的生长率逐渐下降。镜检过程中还发现,农药浓度比较高时,亚心形扁藻细胞个体明显变小,杜氏盐藻的细胞明显变圆,说明丁草胺可以使2种海洋微藻的细胞形态发生改变,可能是由于2种海洋微藻的细胞壁或细胞膜受到了破坏。 杜氏盐藻对丁草胺的反应比较敏感。丁草胺的浓度为0.0005mg/L处理组中杜氏盐藻各时段的细胞密度已明显低于对照组,培养至96h的抑制率为12%,细胞数仅为对照组的79%,但此时杜氏盐藻能够稳定的生长;丁草胺的浓度?0.01mg/L时,杜氏盐藻的生长明显受到抑制,藻细胞大量死亡;丁草胺的浓度?0.06mg/L时,杜氏盐藻呈现负增长,培养基中杜氏盐藻藻细胞逐渐减少。 丁草胺对亚心形扁藻的毒性远低于对杜氏盐藻的毒性。丁草胺的浓度为0.1mg/L时,培养96h后亚心形扁藻的细胞数与对照组无显著性差异(p?0.05);丁草胺的浓度?1mg/L时,各时段亚心形扁藻的细胞密度均明显低于对照;浓度为4mg/l的处理组96h后亚心形扁藻的抑制率为59%,培养基中藻体大量死亡;丁草胺的浓度?6mg/L时,培养基中藻细胞的数量基本上没有增加。 根据2种海洋微藻的生长曲线,得出丁草胺对2种海洋微藻不同时间抑制率的概率单位-浓度对数的曲线方程(见表4和表5)。根据抑制率的概率单位和浓度对数,用直线回归的方法分别求出24h、48h、72h和96h的EC50值及96hEC5095%置信区间(见表6)。将图中2个回归方程进行F检验,结果p<0.05, 表明结果可靠。统计分析用SPSS数据分析软件中STATISTICS 进行。 表4 丁草胺对杜氏盐藻概率单位-浓度对数的曲线方程 Table4 The regression curve of probit-concentration logarithm of butachlor to Dunaliella salina 时间h time 浓度效应曲线方程 Concentration effect curve equation 相关系数 r Correlation coefficient 24h y 1.7637x + 1.3548 0.9975 48h y 1.8176x + 0.8729 0.9917 72h y 1.4476x + 1.5648 0.9773 96h y 1.5249x + 1.368 0.9479 表5 丁草胺对亚心形扁藻概率单位-浓度对数的曲线方程 Table5 The regression curve of probit-concentration logarithm of butachlor to Platymonas subcordiformis 时间h time 浓度效应曲线方程 Concentration effect curve equation 相关系数 r Correlation coefficient 24h y 2.5404x + 2.0604 0.965 48h y 3.016x + 0.6661 0.897 72h y 4.7444x-2.2161 0.932 96h y 3.6784x-0.5967 0.958 表6 丁草胺对海洋微藻不同时段的EC50及96hEC5095% 置信限(浓度:mg/L) Table6 EC50 and 96h 95% confidence limits of butachlor to marine microalgae 藻种 24hEC50 48hEC50 72hEC50 96hEC50 96hEC5095% 置信限 杜氏盐藻 0.0117 0.0187 0.0236 0.0241 0.0123-0.0443 亚心形扁藻 1.436 2.735 3.271 3.323 2.776-3.954 试验结果显示,丁草胺对2种海洋微藻24h、48h、72h、96h的半抑制效应浓度依次逐渐减小,说明丁草胺对杜氏盐藻和亚心形扁藻的毒性均是随着时间的延长逐渐减小;丁草胺对杜氏盐藻的毒性远大于对亚心形扁藻的毒性,说明丁草胺对2种海洋微藻的毒性效应具有不同的藻种倾向性,可能是由于不同藻种的结构不同,导致对丁草胺的耐受力不同。按照农药对藻类的毒性分级标准进行划分等级:以杜氏盐藻为试验生物时,丁草胺为高毒性农药;以亚心形扁藻为试验生物时,丁草胺为低毒性的。 3.2.1.2 光合色素含量的变化 结果显示,丁草胺对杜氏盐藻藻液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量有显著影响,丁草胺的浓度越高,藻液中各种光合色素含量越低。丁草胺浓度为0.0005mg/L时,叶绿素a的含量24h后一直明显低于对照(p<0.05),叶绿素b的含量72h时与对照组无显著性差异(p>0.05),其余时间段明显低于对照,叶绿素总含量则一直明显低于对照组,类胡萝卜素的含量培养至96h时与对照无明显差异;0.001mg/L浓度组藻液中叶绿素a和叶绿素b的含量均一直明显低于对照,类胡萝卜素在96h时与对照组无明显差异;0.005mg/L浓度组中各种光合色素的含量24h后一直明显低于对照;丁草胺的浓度?0.01mg/L时,杜氏盐藻中的各种光合色素含量一直明显低于对照, 0.06mg/L和0.08mg/L处理组中光合色素的含量随着时间的延长一直是逐渐降低的趋势。 表7 96h后丁草胺处理组杜氏盐藻藻液中光合色素含量与对照组的比值(%) Table7 concentration of photosynthesis pigments ratio of butachlor -Dunaliella salina to the comparison in 96h 农药浓度(mg/L) 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总量 类胡萝卜素 0.0005 97 96 97 100 0.001 93 85 90 101 0.005 80 78 79 86 0.01 52 41 48 60 0.02 22 25 23 22 0.04 12 14 13 9 0.06 6 6 6 3 0.08 3 5 3 0.5 试验结果显示,培养96h后各浓度组藻液中叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量与对照组中对应组分的百分比随着丁草胺浓度的升高基本上逐渐降低。0.0005mg/L和0.001mg/L处理组中类胡萝卜素含量与对照组无显著性差异,叶绿素a和叶绿素b的含量明显低于对照;浓度?0.01mg/L时,同一浓度组中类胡萝卜素含量的百分比明显高于叶绿素a和叶绿素b,浓度?0.04mg/L时,类胡萝卜素含量的百分比明显低于叶绿素a和叶绿素b。说明丁草胺对类胡萝卜素含量的影响比较大,低浓度的丁草胺可以促进它的产生,高浓度则抑制它的产生。 不同浓度的丁草胺对亚心形扁藻各种光合色素含量的抑制程度不同,其变化趋势与藻细胞密度相似:丁草胺的浓度越高,藻液中各种光合色素的含量越低。丁草胺处理96h后,0.1mg/L处理组中叶绿素和类胡萝卜素的含量均明显低于对照(p<0.05);1mg/L处理组中叶绿素a和叶绿素b的含量明显低于对照(p<0.05),类胡萝卜素的含量与对照相比差异极显著(p<0.01);浓度?2mg/L时,处理组中各种光合色素含量均显著低于对照。总体上讲,处理组亚心形扁藻藻液中各种光合色素的含量一直低于对照组;丁草胺对藻液中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的影响程度相差不大。 表8 96h后丁草胺处理亚心形扁藻藻液中光合色素含量与对照组的比值(%) Table8 concentration of photosynthesis pigments ratio of butachlor ? Platymonassubcordiformis to the comparison in 96h 农药浓度(mg/L) 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总量 类胡萝卜素 0.1 97 97 97 97 1 96 96 96 94 2 88 87 88 88 3 76 71 74 80 4 51 53 52 57 5 42 40 41 46 6 36 42 38 38 7 33 35 33 38 试验结果显示,培养96h后各处理组亚心形扁藻藻液中各种光合色素含量占对照组中对应色素含量的百分比不同,随着农药浓度的升高,百分比逐渐降低。将培养96h后各处理组藻的细胞密度与对照组相比,得到百分比:99%、96%、85%、73%、55%、47%、41%、36%。由2种百分比可以得出:丁草胺处理组藻液中光合色素含量的降低是由细胞密度的减少和单个藻细胞中光合色素含量的变化两个因素引起的。 3.2.2 慢性毒性试验 根据丁草胺对2种海洋微藻的急性毒性试验结果,选择丁草胺对2种藻的96hEC50进行慢性毒性试验:丁草胺对杜氏盐藻和亚心形扁藻的实验浓度分别为0.0241mg.L-1和3.323mg.L-1。培养19d,隔天取样,进行细胞计数,胞内可溶性 蛋白质含量和光合色素含量的测定。 3.2.2.1 2种海洋微藻的生长曲线 加入丁草胺的杜氏盐藻的生长曲线与对照组有明显差别:对照组中杜氏盐藻的细胞密度在第13d时长至最大值413×104cells.mL-1,而丁草胺处理组中杜氏盐藻的细胞密度在第15d时到达最大值447×104cells.mL-1;培养开始的7d内,处理组中杜氏盐藻的细胞密度明显低于对照组,培养15d后处理组中杜氏盐藻的细胞密度一直明显高于对照组。由此可见,丁草胺对杜氏盐藻的毒性随着时间的延长逐渐减小,且造成的伤害能够在10d后恢复,生长速率明显高于对照组。 半抑制浓度的丁草胺对亚心形扁藻的生长有明显的抑制作用:丁草胺处理组中亚心形扁藻的细胞密度在整个实验过程中一直明显低于对照,对照组和处理组中亚心形扁藻的细胞密度均在第15d达到最大值,分别为387×104cells.mL-1和362×104cells.mL-1。由此可见,丁草胺对亚心形扁藻的毒性作用持续的时间比较长,培养19d时毒性作用仍然很强,有可能还要持续一段时间。 3.2.2.2 光合色素含量的变化 半抑制浓度的丁草胺长时间作用下,杜氏盐藻藻液中叶绿素a和叶绿素b含量的变化曲线与对照有明显差别,类胡萝卜素含量的差别相对小。叶绿素a和叶绿素总含量一直明显低于对照;叶绿素b的含量,13d前明显低于对照,13d后明显高于对照。类胡萝卜素的含量变化不大。总的来讲,丁草胺对叶绿素a含量的抑制程度比较大,而且持续的时间比较长;丁草胺对叶绿素b含量造成的影响恢复的比较快。 半抑制浓度的丁草胺作用下,亚心形扁藻藻液中叶绿素a、叶绿素b和类 胡萝卜素含量的变化趋势极其相似。实验开始的前7d,处理