多瘤病毒分离株的研究

多瘤病毒分离株的研究 受荔纛孝窜彰卞魏壤谚 微t物毕朵占1999年9月第l9器第3崩J【?IRNAIOFMICR[~BI()IIJ(;Y1999Vf’19No3 ? 研究简报? 多瘤病毒分离株的研究 塑 (l牛部州牛物制品研究所730046 多瘤病毒注入新生小鼠体内后,町刺激小鼠 组织细胞分裂繁殖,产生多种肿瘤.用肿瘤药物 治疗后,从缩小的肿瘤块组织细胞中分离的多瘤 病毒株有的已经不再能诱发肿瘤.本文研究了这 种不能产生肿瘤的多瘤病毒株和野生型病毒株杠 分子遗传学上的区别. 1材料与方法 5一氟胞嘧啶(5一Fc)购_F美国SIGMA公 ,[H]胸腺嘧啶,[S]甲硫氨酸购F英国 RadiochemicalCentreAmersl~li,兔抗鼠多瘤病毒 AgT免疫荧光试剂购卜法国巴斯德研究所. 11分离多瘤病毒的方法 小鼠为NIH小鼠,新生小鼠皮下接种或腹腔 内接种多瘤病毒悬液.有肿瘤生长的小鼠在18 - 22g后用5一氟胞嘧啶(5一Fc)治疗,300rag/ k晶每天1次,腹腔内注射,共10d.选择瘤体明 硅变小的肿瘤块,匀浆后收集肿瘤细胞及瘤体内 浸润细胞.细胞裂解后收集含有多瘤病毒的悬液 进行细胞感染试验,选择突变株. 1.2细胞培养及病毒感染试验 新生地鼠肾原代细胞培养.野生型多瘤病毒 感染用10pfLl/IIl【病毒悬液0.4rnl加入细胞培养 瓶内,细胞感染剂量lO,5Opfu/.5%, (37?0.5)12条件下用a)2孵育箱培养.病毒吸 收时间2h,之后洗去胞外病毒.培养液用改良 DMEM,加l0%小牛血清. 1.3[H]一胸腺嘧啶标记,按Salomon方法… 在病毒感染后的不同时间内,2ral的细胞培 养液加50vCi的[H]一胸腺嘧啶.标记时间2h. 14免疫荧光试验 按试剂禽说明操作.感染的细胞被免疫血清 IgO荧光标记,计数荧光显示阳性的细胞比例. 1,5[s]甲硫氨酸标记 足;,j 每lml细胞培养液加入100~Ci的[s]一甲 硫氨酸f5oo,100Oci/mmo1),标记2h. 1.6RNA的提取与核酸杂交 胞浆内RNA的提取按Favalora的方法 (1980)[23,核rZNA的提取用热酚法(Scherrer, 1969)【.胞浆RNA杂交的探针来源于质粒 pMr(GrtmmatI,1981).细胞核RNA杂交探针 束源fR内瓦大学(WeiletaI).探针标记采用 nicktranslation的方法标记[32P]dCTP(3000 Ci/rmto1).杂交用的细胞采用醋酸纤维素膜片法 培养. 2结果 2,1[H]胸腺嘧啶渗入试验和免疫荧光试验 [H]试验结果友明野生株多瘤病毒诱导细 胞进行分裂繁殖的能力强,分离株诱导细胞繁殖 的能力低,时问长.免疫荧光试验结果明野生 株感染的细胞数量比分离株感染的细胞数量高得 多.在16h,野生株感染的细胞比例是分离株的 lO倍多. 2.2病毒RNA的合成 病毒RNA合成的数量是通过核酸杂交试验 的结果衡量的.与胞浆R_NA杂交的探针,含有 多瘤病毒45spre—rRNA的外转录间隔子(ex ternaltranscribedspacer).与细胞核RNA杂交的 探针2含有多瘤病毒基因组70--92的片段,与此 杂交的胞核RNA含有病毒期合成的mRNA. 结果发明:野生病毒株在感染细胞后,胞浆内 的45spmrRNA在16h增加r1倍,在24h增 加了2倍,细胞核内的早期ml~NA增加r05 倍.分离株感染细胞后24h,细胞胞浆的45spm rRNA增加10%,胞核内的早期rrlRNA增加 36%.这表明分离株诱导的细胞内早期rrlRA 收稿日期1999—04—23 作者简开:赶官为男.研究员.医学颤研究方足痛晕柏半物制品. *本课题为作者仵瑞日内巨大学进修期到的岍究题日.刚后补兜内容成. 3期趄官为等:多瘤嫡分离株的研究 的合成和45sprerRNA的合成都比野牛株低, 合成的时间要. 2.3多瘤病毒早期蛋白电泳结果 结果点明:野生株多瘤病毒能产牛3种期 特有抗原,即AgW,r和,而分离株虽能产,k Ag1抗原,但不能产生sT抗原,因此失去r诱导 宿上细胞分裂繁殖的能力. 3讨论 多癌病毒的3个早期蛋白AgW,mT和sT同 时作用能诱导静止期地鼠肾细胞分裂繁殖.细胞 感染病毒24h后,细胞内DNA的合成增加2.4 倍,繁殖的细胞内有AgW抗原的迅速增加到50% -- 60%,胞核内的早期mRNA增加50%,而胞浆 内的45sprerRNA增加了2倍,造一切都说明 r多瘤病毒诱导细胞分裂繁殖的生物功能非常 [1】mlorr~*aC [2]avak)r.J 749 [3]Sc~rrerK 强,致肿瘤作用也非常强.这种刺激肿瘤细胞生 的作用和诱变作用上要是期蛋白AgW的作 用,但也需要mT和sT的参加.分离株的诱导作 用弱,上要是mT和sT的缺乏或产生的数量少. AgW的这种诱导作用类似某些生长因子的作 用,在转录水平活化R.NA聚合酶而促进R.NA的 合成,通过信号传递系统和蛋白激酶,促进细胞骨 架的生成,从而刺激宿上细胞增殖,其机制可能与 jun蛋白,蛋白以及亮氨酸拉链结构有关5. 活化RNA聚合酶的过程中需要有mT和sT参 加,这一点已被试验所证实.分离株在5氟胞嘧 啶的作用下发生了遗传结构上的变化,不能产生 sT,也就失去了促进RNA合成的作用.本研究也 提示r应用某些生长因子治疗疾病的同时.应注 意这些生因_F也有诱发健康组织恶变的可 能性. 参考文献 Nuc~cAddsRe-s19974:1483,1503 HMethodsinEnz”m198065:718,[4 et.FundamentalTechrdcalinVirolgyAm[5 demicPmmpage19694l3,174 J?萨姆弁鲁克等菩,盎年雁等蹲.分F克隆北京:科学出版 }十,1993:269 魏捕医学牛物化学人民出版社1998,505 ? 论文摘要? HIV一1env基因在鸡痘病毒中表达的研究 方厚华盆宁一郭志懦罗坤古长庆范洪学殷震 (解放军农牧上学长春130062) HIV是,adD8的卡要病原.其日-v荩因编码的病毒牡外膜蛋白gpl60口』被宿t细胞蛋白分解酶修饰加T成膜表面 蛋白(gp120)和穿膜蛋白(gp41).~.160卜含有多个HIV感染的中和部他,已?vgp160和gp120能诱导机体产堆 中和抗体和CTL反应,成为基因T程疫苗研究的蕈点. 我室已完成鸡痘病毒(FPV)282FA株基因组’BamHI片段的克隆和分析.本实验即是利用浚病的TK和B片段.插 人癌苗病毒P7.5多个串联的启动F和牛痘病毒A包涵体(ATI)的晚期启动F的复合启动以Lacz傲基因,构 缱r2个命名为puTA2f16L和puBA716L的裁体质粗,将e/1v基因分别插入选2个载体的复合启动产F游的 SnaaI化点,通过脂质体转垫与野生FPV进{r同潭忭蕈组,感染鸡胚成纤维细胞,以Xgal傲为L越z蛋白分解的底 物,挑选色的阳性霞组病毒蚀斑,获得f2株莺组FPV,命名为vUTA2f16LE和vUBA7—16I~E.经Dot— ELISA,免疫荧光实验和Westemblot.4盘删明:(1)以TK蔗因为侧翼构建的首组病毒重组牢为02%,与所见报道相 近,筛选出的晕组莓经Xg班挑选,传代,纯他,4,5代后达到95ok以}:蘑组产;以B片段为侧构建的重组病毒 尚束见报道,本实验B片段的晕组丰为01%传代后的前组产与TK片段的相近.说明霞组FPV基本是稳定的.利用 FPV载体表选HIV一1env基因的町{忭旨次得剑hE明.(2)2株含env蔗因的晕组FPV均能表达相麻蛋白,在分质 160×1和120×10处出现2条特异的蛋白带;DotELIS&和免疫捷光试验亦明这种蛋白能被gpl20特异性抗 体阻别.(3)利用FPVRNA聚合酶能识别它痛病毒的启动构的特件,旨淡使.}Il痛苗病毒和十A包拍体的启动 鸡疳病毒中在逃,获得理想结果.