通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用

通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用 DOC,方便您的复制修改删减 通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺 氧缺糖损伤模型的保护作用 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,程锦 狄留庆 赵晓莉 毕肖林 单进军 【摘要】 ,目的 探讨通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用。方法 以肾上腺嗜铬瘤克隆化细胞株PC12细胞为材料,制备缺氧、缺糖损伤模型,MTT法测定PCl2细胞存活数及乳酸脱清酶法测定细胞损伤程度。结果 形态学检查发现,通塞脉微丸和丁基苯酞对两种损伤模型中的PC12细胞具有明显保护作用,MTT染色和乳酸脱氢酶活性测定显示,通塞脉微丸和丁基苯酞可显著提高损伤模型中PC12细胞的存活数,降低细胞损伤程度,其中以对缺氧损伤保护作用尤为显著。结论 通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧和缺糖损伤模型均有显著保护作用。 【关键词】 通塞脉微丸 丁基苯酞 PC12细胞 缺氧损伤模型 缺糖损伤模型 Abstract,Objective To discuss the protective effect of Tongsaimai pellets (TSMP) and butylphthalide (NBP) on PC12 cell DOC格式论文,方便您的复制修改删减 in the hypoxia/hypoglycemia model. Methods Two ischemia models including hypoxia, hypoglycemia models were used to assay the anti-ischemic roles of TSMP and NBP in cultured PC12. Results TSMP and NBP possessed obvious protective effects on PC12 cells from two injured models. Both of them could increase the number of living cells and decrease LDH activity significantly, particularly in hypoglycemia injured model. Conclusion TSM and NBP have protective effect on PC12 cells from two injured models effectively in vitro. Key words,Tongsaimai pellets,butylphthalide,PC12 cell, hypoxia model,hypoglycemia model 通塞脉微丸(TSMP)是在中成药通塞脉片的基础上经拆方二 次开发而成的新的复方制剂。该制剂以黄芪、当归等为基本组成药物, 具有补益气血、养阴清热、活血化瘀、通经活络等功效,临床用于治 疗缺血性脑中风。丁基苯酞(NBP)为当归挥发油的主要成分,在有效部 位筛选实验中发现当归的超临界萃取物有较好的抑制血小板聚集和 促进血管生成的作用,NBP与全方制剂治疗缺血性脑中风的疗效密切 相关。另有文献报道,NBP具有增加缺血区脑血流量、缩小脑梗死面 积、减轻脑水肿、改善大鼠大脑缺血引起的认知缺损等作用[1]。本实 验通过建立细胞缺血样损伤模型,观察TSMP和NBP对大鼠肾上腺髓 质嗜铬瘤分化细胞株(PC12细胞)损伤的保护作用。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 1 实验材料 1.1 仪器 BP211D电子分析天平(德国sartorius公司),DK-8D电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司),CO2培养箱(Forma scioentific),Pureplus纯水器(U.S.A),SW-CJ-1FD净化工作台(苏净集团安泰公司),Bio-TEKEL900酶标仪,LeicaDMIL型倒置显微镜,TU-1800S紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。 1.2 药物与试剂 TSMP自制,NBP购自中国医学科学院,丹参酮(Tanshinone, TAN)自制。以上各药配置后经微孔滤膜除菌过滤,4 ?冰箱保存备用,实验时用1640培养液稀释成不同的浓度。连二亚硫酸钠(Na2S2O4)为上海硫酸厂双流工贸公司产品,批号970531,PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株,引自武汉大学菌种保藏中心,本研究室传代保存),1640培养基、MTT(四甲基偶氮唑盐)购自Sigma公司,小牛血清购自杭州四季青有限公司,二甲基亚砜(DMSO),上海凌峰化学有限公司,批号060514,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,批号070524。 2 实验方法[2-4] 2.1 药物对实验模型的保护作用 2.1.1 细胞的接种 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 接种1×105/mL的PC12细胞于96孔培养板中,37 ?、5% CO2温箱孵育6 h。 2.1.2 缺氧损伤模型的建立和药物对实验模型的保护作用 将Na2S2O4干粉加入1640培养液中,使终浓度为0.87 mg/mL,充分搅拌,调整pH为7.2,即为缺氧溶液。将缺氧溶液180 μL加至PC12细胞上,再加入不同浓度的TSMP、NBP和TAN各20 μL, CO2培养箱中作用8 h,换成正常1640培养液继续培养6 h,观察结果。实验除设损伤对照及正常对照外,还设非低氧溶液(配制同缺氧溶液,放置3 d以上实验)对照,以消除Na2S2O4在水中分解产物的影响。 2.1.3 缺糖损伤模型的建立和药物对实验模型的保护作用 将无糖Eagle’s液加于PC12细胞培养板中,180 μL/孔,再加入不同浓度的TSMP、NBP和TAN各20 μL,CO2温箱中作用10 h,换成正常1640培养液继续培养6 h,观察结果。 2.2 观察指标 2.2.1 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察PC12细胞的生长及细胞病变情况。 2.2.2 MTT法测定PCl2细胞存活数 细胞培养实验结束前4 h,每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,37 ?、5% CO2温箱中继续培养,待蓝紫色的复合物形成后,加入200 μL DMSO,振荡10 min,使颗粒彻底溶解,Bio-TEKEL900酶标仪在波长570 nm下测定吸光度值。 2.2.3 乳酸脱氢酶法测定细胞损伤程度 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 收集细胞培养上清液,按LDH测试盒说明操作并计算LDH活力。 2.3 统计学方法 数据以x?s示,组间数据进行t检验。 3 结果 3.1 细胞形态学观察 PC12细胞形状呈不规则圆形,为贴壁细胞,折光度强,生长速度快,培养3 d后细胞生长成簇。损伤后,细胞先肿胀,折光度减弱,最终细胞圆缩,脱落。模型中PC12细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一致。 3.2 MTT法活细胞测定 (见表1、表2)表1 TSMP对缺氧、缺糖损伤模型中PC12细胞存活数的影响(略)注,与对照组比较,?P0.01,与模型组比较,*P0.05,**P0.01(下同)表2 NBP对缺氧、缺糖损伤模型中PC12细胞存活数的影响(略) 3.3 乳酸脱氢酶法测定细胞损伤程度 (见表3、表4)表3 TSMP对缺氧、缺糖损伤模型LDH的影响(略) 表4 NBP对缺氧、缺糖损伤模型LDH的影响(略) 4 讨论 大鼠肾上腺PC12细胞具有神经内分泌细胞的一般特征, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 因其有可传代特点,广泛应用于神经生理和神经药理学研究[5]。在脑缺血引起的神经元死亡的过程中,脂类代谢的变化始终发挥着作用。EC Larsena等[6]用PC12细胞缺氧、缺糖的体外模型分析磷酸卵磷脂(PC)和鞘磷脂(SM)新陈代谢的变化,细胞中PC和SM水平显著减少,神经酰胺明显增加,磷酸卵磷脂酶C、D活性增加、磷酸卵磷脂酶蛋白表达增强,胞二磷胆碱三磷酸盐显著减少,增加的无用的磷酸卵磷脂酶活性进一步引起了SM的减少和神经酰胺的增加。这些变化导致了PC和SM的进一步降低、1,2-二酰基甘油的消耗、神经酰胺和游离脂肪酸的增加、线粒体中细胞色素C的释放、细胞内Ca2+的增加、丝氨酸磷脂的分泌,以上因素都将导致细胞的凋亡,从而造成神经元的死亡。本实验结果显示,TSMP、NBP和阳性对照药TAN对PC12细胞缺氧缺糖损伤有显著的保护作用,可显著提高损伤模型中PC12细胞的存活数,降低细胞损伤程度,这些作用的发挥可能是通过调节PC12细胞缺氧缺糖的体外模型引起的脂类代谢的变化而实现。该实验药物直接作用于细胞,反映了药物对受损细胞的保护作用,通过干预细胞凋亡过程发挥对神经元损伤的保护作用,从细胞水平为TSMP用于缺血性脑中风的治疗提供了依据。 【参考文献】 [1] Zhang Y, Wang L, Li J, et al. 2-(1-Hydroxypentyl)-benzoate increases cerebral blood flow and reduces infarct volume in rats model of transient focal cerebral ischemia[J]. Pharmacol Exp Ther, 2006,317(3),973,979. DOC格式论文,方便您的复制修改删减 [2] Chang-Suo Liu, Nai-Hong Chen, Jun-Tian Zhang. Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced cytotoxicity by salvianolic acid B, a new compound isolated from Radix Salviae miltiorrhizae[J]. Phytomedicine,2007,14(7-8),492, 497. [3] 董高翔,冯亦璞.丁基苯酞抑制低氧低糖诱导的大鼠皮 质神经细胞凋亡[J].药学学报,1999,34(3),176,180. [4] 何丽娜,杨 军,姜 怡,等.丹参酮对培养PC12细胞损伤 模型的保护作用[J].中国中药杂志,2001,26(6),413,416. [5] Anders Edsj?a, Linda Holmquista, Sven P?hlman. Neuroblastoma as an experimental model for neuronal differentiation and hypoxia-induced tumor cell dedifferentiation[J]. Seminars in Cancer Biology,2007,17(3),248,256. [6] EC Larsena, JF Hatchera, RM Adibhatla. Effect of tricyclodecan- 9-yl potassium xanthate (D609) on phospholipid metabolism and cell death during oxygen-glucose deprivation in PC12 cells[J]. Neuroscience,2007,146(3),946,961. DOC格式论文,方便您的复制修改删减