黑曲霉发酵柠檬酸　

黑曲霉发酵柠檬酸　 黑曲霉发酵生产柠檬酸 (中北)生物技术 18083108 陈园园 摘要:黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。 关键词:黑曲霉、黑根霉、柠檬酸 实验材料和试剂: 样品:新鲜土壤样品(来源于食堂垃圾堆处) 培养基:查氏培养基、马铃薯培养基 无菌水:带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶 试剂:400U/mL庆大霉素液、10,苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4 实验器材: 无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱 实验步骤 一(黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养 1.黑曲霉的分离培养 ?土壤样品的采集 用取样铲，将层5cm左右的浮土除去，取5,25cm处的土样10,25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 ?制平板: 在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶 制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。 ?制备土壤稀释液: 1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10,苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10,1的土壤悬液。 2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10,2、10,3、10,4，再加入0.9mL无菌水。取10,1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10,2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10,3、10,4土壤稀释液。 无菌操作法分别吸取10,2、10,3 、10,4土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上。 ?涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min。 2.黑根霉的分离培养 马铃薯培养基2块 1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离， 2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解， 取稀释液0.1mL在上面进行均匀涂布。 将划好的培养基置于517房间30?培养箱内正置培养3天，进行结果观察和转接。 3.菌种和扩培 培养72小时后，星期一过来，检查查氏培养基和划线马培，看是否有产酸的曲霉菌落，和典型的根霉菌落，并显微检测其是否为黑曲霉和黑根霉。确证后分别将其转接至剩余的两块PDA平板培养基上扩增培养和保藏。 二(黑曲霉发酵柠檬酸 1.种子液制备 菌种获得(纯种)，无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液。 2.液体深层发酵 无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，30?培养5,6天。 三(柠檬酸的提取 把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取出来，并通过精制成为合格产品，该过程通常称为后提取，后提取是发酵工程不可缺少的部分。 1、处理黑曲霉玉米粉发酵液: 布氏漏斗垫上纱布抽滤除去菌体和残渣，量筒测量清液体积 V0; 2、滴定: 量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2,3d酚酞指示剂，用0.1M NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1; M总酸(g),V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210× V0 /5 M碳酸钙(g),M柠檬酸×( V0 ,5)/ V0 ×1/210×3/2×100 3、钙盐沉淀: 称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中(防止产生大量的泡沫)，85?反应5min(使柠檬酸钙沉淀下来)，趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物2,3次(除去残糖、蛋白质等可溶性杂质); 4、酸解: VH2SO4(mL),M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000 在沉淀物中加入约两倍体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液; 5、 低压浓缩: 将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60,70度，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10; 6、冷却结晶: 将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m柠檬酸。 计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率:M总酸(g)/ V发酵液(mL) 计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率:m柠檬酸(g)/ 原料(g) 实验结果: 1.黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养结果 黑曲霉菌丛黑褐色，菌丝发达多分枝，顶囊大球形，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。 黑根霉菌落呈黑色灰色菌丝为白色呈絮状，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成球形的孢子囊。 2.柠檬酸的提取结果 柠檬酸呈白色结晶粉末 V0=125ml V1=7.8ml M总酸(g),V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210× V0 /5 M总酸(g),7.8×0.1×0.001×1,3×210×125,5=1.365g M碳酸钙(g),M柠檬酸×( V0 ,5)/ V0 ×1/210×3/2×100 M碳酸钙(g),1.365×110,125×1,210×3,2×100=0.86g VH2SO4(mL),M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000 VH2SO4(mL),0.86,100,0.1×1000=86 ml 计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率:M总酸(g)/ 原料(g) 黑曲霉发酵柠檬酸的产率=1.365,10.0=13.65, 计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率:m柠檬酸(g)/ M总酸(g) 钙盐沉淀法柠檬酸的得率=0.56,1.365=41, 讨论: 本次实验目的为掌握真菌的分离、培养基本方法;获得黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸;了解产物发酵生产的机理;柠檬酸发酵的发酵条件;掌握发酵过程步骤;了解产物提取的几种方法;学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理;掌握沉淀法提取柠檬酸的方法。 1.土壤样品的采集需注意以下因素 根据土壤特点 1(土壤有机质含量和通气状况2.土壤酸碱度和植被状况3(地理条件4(季节条件 根据微生物生理特点采样 1.根据微生物营养类型2.根据微生物的生理特性 2.柠檬酸合成的代谢调节 1、由于锰离子的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓度升高，促进 了EMP途径的畅通。 2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。 3、在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。 4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶,和丙酮酸固定CO,反应相平衡，以及柠檬酸合成酶 不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。 5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失 活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。 3.柠檬酸发酵的条件: 1、合适的碳源(淀粉、麦芽糖、甘露糖等)，高浓度的糖; 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源(铵盐); 3、合适的pH值; 4、发酵液中溶氧量要高(摇床的转速250r/m); 5、限制重金属离子如Mn2，、Fe2，、Zn2，含量。 4.影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素 ?菌种?发酵培养基(碳源、氮源)?纯种发酵与灭菌?无机添加剂?pH对微生物生长的影响?溶氧的影响?温度对微生物生长的影响 5.影响柠檬酸提取效率的因素 钙盐沉淀中是否充分沉淀;可溶性杂质是否完全除去;多次抽滤操作中抽滤是否充分;冷却结晶是否充分。