(神经病学优秀论文)微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗

(神经病学优秀)微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗 复卫土学博士碍竟生丰土论文霸?词各固一本文常用的缩略词’??????—????????帕金森病虹膜色素上皮海藻酸钠多聚赖氨酸一海藻酸钠羟基多巴胺黑质致密部阿朴吗啡酪氨酸羟化酶多巴胺高香草酸神经生长因子脑源性神经营养因子胶质源性神经营养因子逆转录多聚酶链反应辣根过氧化物酶高效液相色谱袁同学论文独创性声明本论文是我个人在尊师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特加以标注和致谢的地方外不包含其它人或其它机构已经发或撰写过的研究成果。其它同志列本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定。即学校有权保留送交论文的复印件允许论文被查阅和借阅学校可以公布论文的全部或部分内容可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的沦文在解密后遵守??咄规定。作者签名一咩师签名一一一曙期袁同学复卫土学博士碍宪生牛土论文十文稿姜微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗帕金森病大鼠的实验研究中文摘要帕金森病‘是以黑质多巴胺神经元变性为特征的疾病细胞移植是有前景的治疗方法。寻找合适的供体细胞是细胞移植的关键问题之一。虹膜色素上皮细胞 在解剖结构上和睫状体上皮细胞等相连为单层上皮细胞其下可见基底膜可与基质分离。近年来发现体外培养的含有多种生长因子如碱性成纤维细胞生长因子胶质源性神经生长因子脑源性神经生长因子色素上皮生长因子等。这些生长因子对于保护神经细胞、促进细胞的生长和发育有一定作用。虽然目前未见细胞分泌多巴胺的报道但是细胞胞浆中含有黑色素颗粒考虑到多巴胺和黑色素的产生有着共同的通路所以我们检测了体外培养的细胞我们发现细胞可以分泌多巴胺和多种神经营养因子并可以结合铁离子所以我们认为细胞可以作为帕金森病移植治疗的细胞来源。免疫排斥是细胞移植的难题海藻酸钠一多聚赖氨酸是一种生物相容性良好的半透膜材料用它来包裹移植物可以很好起到免疫隔离的作用。本实验旨在详细研究猪细胞体外多巴胺及神经营养因子的分泌特性。观察失去光线刺激的外环境是否会影响其功能为其下一步的移植奠定基础。将该细胞用海藻酸钠一多聚赖氨酸包裹制作成微囊后观察微囊包裹对细胞活性和其分泌特性的影响。将微囊包裹后的细胞立体定向植入大鼠模型的纹状体观察移植后疗效。第一部分猪细胞的体外原代培养及鉴定目的建立稳定的猪细胞原代培养、纯化及鉴定方法。方法酶消化法获取猪细胞纯化及传代后观察细胞形态及生长状况绘制细胞生长曲线免疫细胞化学方法鉴定细胞细胞角蛋白 和一的表达统计阳性细胞数分别计算原代和传代后阳性细胞率。结果细胞胞浆内含有大量黑色素颗粒细胞经纯化、传代后 和一表达阳性率均较原代提高细胞生长曲线显示传代后第天为指数生长期天以后为平台期。第二部分猪细胞体外生物学特性研究袁同学复卫土学博士研究生毕土论文十文稿要目的观察猪细胞体外、神经营养因子的分泌特性和铁结合能力以及失去光照的环境是否对细胞功能产生影响。方法收集第、、、、、代细胞传代后的培养上清液高效液相色谱一电化学法检测样品中的含量第代细胞分为正常培养组、光照组和遮光组收集各组传代后第的培养上清液法测定含量法检测、、和的分泌量并测定细胞结合铁的能力。免疫细胞化学法检测细胞中的表达方法检测该细胞中的表达。结果第代细胞在传代后开始检测到多巴胺的分泌分泌量在达高峰以后缓慢下降并趋稳定、、和的分泌以及铁结合力较为?愣ㄋ孀排嘌 奔涞难映げ?挥忻飨员浠 , 蟾鞔 赴 置诹课尴灾 鸸庹兆榈姆置谠谇靶?焙推渌 阶槲薏畋鹦?焙蟮姆置诿飨愿哂谄渌 阶椤～ ???偷姆置谠诟髯橹 涿挥忻飨圆畋稹,诠庾榈奶 岷狭λ坪醯陀谄渌 阶榈 敲挥型臣蒲б庖濉,庖呦赴 Х 觳獾较赴 杏械谋泶锓椒 觳獾较赴 谟械谋泶铩,谌 糠趾,逅崮莆?业闹谱骷拔?叶韵赴 锘钚缘挠跋炷康挠呕 屎舷赴 奈?抑谱魈跫 ,鄄煳?一 韵赴 至岩约啊?窬 蜃臃置谇榭龅挠跋臁,椒ㄓτ酶哐咕驳缡轿?页尚妥爸弥票负,逅崮贫嗑劾蛋彼嵛?一 赴 髯钍屎系闹票覆问 晕?迪鹿鄄煳?业男翁 ?饬课?业闹本队靡浦菜 玫?a name=baidusnap2>针头来回抽吸微囊观察其强度显微镜下观察囊内细胞的生长状况并在第、、、、天破囊后进行细胞计数并用台盼兰染色法检测囊内细胞存活率将微囊化和非微囊化两组细胞在接种后第天收集培养上清液检测其中、、、、以及的量观察微囊包裹对其分泌特性的影响并检测铁结合力。结果制备微囊的最佳参数为室温—?内层海藻酸钠浓度为外层海藻酸钠浓度为液面高度为—成囊电压为 微囊形态接近正圆表面光滑大小均一直径为 。微囊经针头抽吸后未见破损微囊内细胞的总数没有明显变化细胞微囊化后培养内微囊组的分泌与非微囊组相比明显增加以后二者无显著差异。微囊内细胞、、、、的分泌量与非微囊组细胞相比无显著差异。铁结合力二组之间没有显著性差别。第四部分大鼠模型的建立及细胞的移植袁同学复卫土学博士研竟生牛土语文十文捕姜目的建立稳定的毁损的偏侧大鼠模型确立可靠的行为学评价指标。观察微囊化细胞移植到模型大鼠纹状体的疗效。方法模型的制备及鉴定一毁损内侧前脑束 建立大鼠模型通过旋转试验、组织病理证实并评价其它行为学指标是否有效。移植分组分为细胞微囊组空微囊组单纯手术损伤组进行右侧纹状体两点立体定向移植分别植入 个细胞、约个含细胞的微囊相应的对照组注射等量的生理盐水和空微囊。移植后的检测观察移植后大鼠旋转行为以及其他行为学指标的变化法测定各组纹状体区和的含量。移植后第周取大鼠脑进行的免疫组化染色。提取移植区周围组织的蛋白电泳后观察移植物是否影响移植区周围脑组织的蛋白合成。结果。大鼠模型经旋转试验、组织病理鉴定模型成功。行为学指标调整步态、启动时间、单足运动的步距和速度是有效的行为学指标自由运动的步距和速度不适合作为大鼠模型的行为学评价指标。移植后微囊组的大鼠只旋转行为在移植后第周开始逐渐改善至第周改善更加明显与其他组相比几乎不旋转一直持续到本试验结束第周。二次移植治疗的大鼠从第二次治疗的时间开始计算仍有的大鼠只有效。总的计算有约的大鼠只治疗有效。这些出现疗效的大鼠的调整步态、启动时间、单足运动的步距和速度均明显改善。其他两组移植后行为学无明显改善。各组移植后纹状体含量的变化同其行为学改善相符合。组织免疫化学发现大部分微囊形态不规则囊壁皱缩但囊壁完整、未见破损。微囊内可见散在的圆形细胞。行为学得到改善的大鼠纹状体染色显示囊内细胞呈阳性微囊周边的纹状体可见阳性纤维密度较空微囊组和单纯损伤组明显增高。移植区周围组织的蛋白和对侧相比没有明显差别。微囊组中有只大鼠移植后周左右出现严重的扭转痉挛解剖后发现形成肿瘤样组织。结论猪细胞取材方便易于分离、纯化体外生长、增殖活跃。机械一酶消化法获得的细胞经免疫细胞化学鉴定证实为细胞传代后细胞纯度提高。猪细胞体外基础状态下即能分泌少量、、、和并具有结合铁的能力。这些功能不受传代的影响。光照会使分泌增加其它功能不受影响。细胞中还检测到及蛋白的表达。用高压静电微囊成型装置制备的微囊形态、大小、均匀度及强度均十分理想。微囊内的细胞不增殖。细胞的、、、和袁同学复卫土学博士研霓 革皇论文十文搐姜的分泌以及结合铁的能 力不受微囊包裹影响。毁损建立偏侧大鼠模型的成模率高。调整步态、起动时间、单足运动的步距和速度是有效的行为学评价指标。微囊化猪细胞的纹状体移植对大鼠模型有治疗作用。疗效均持续至移植后周。移植物对移植区周围脑组织?牡鞍缀铣刹辉斐擅飨杂跋臁,兄淮笫笠浦睬 鱿种琢觥,丶 逝两鹕 ?赴 浦仓砗缒ど 厣掀は赴 喟桶泛,逅崮贫嗑劾蛋彼嵛?音腔 喟桶吩 Ц次捞 Р?堪 可 嶂芈畚挠?牟督 氇悛濯岐绐妾绐瑾妾猹岐绐妾绐濯绐氇岐猹绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐猹濯猹岐悛妾瑾绐悛猹濯岐濯妾悛岐绐悛绐妾岐绐猹悛濯岐妾猹岐岐濯绐妾妾绐濯绐濯岐妾猹帷 妾妾妾妾濯绐濯愍飒绐岐濯绐猹岐猹绐猹悛岐濯岐瑾濯猹岐妾岐绐妾瑾妾绐岐绐岐濯绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐妾猹岐妾濯妾悛濯猹妾岐绐濯绐岐绐猹猹戟楠濯绐猹濯绐猹猹猹岐猹濯岐悛悛濯猹悛濯绐绐飒悛猹猹岐猹濯妾岐猹绐岐妾瑾妾妾瑾飒绐猹瑾妾绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐妾岐岐绐妾绐楠猹濯绐濯绐岐绐绐瑾绐飒岐绐妾猹绐猹岐猹绐妾猹岐猹绐濯濯濯濯妾悛岐绐悛绐瑾妾濯岐绐猹飒猹岐绐岐瑾猹瑾妾戟绐濯飒悛绐妾妾绐飒濯濯飒岐妾悛悛绐瑾岐岐濯绐妾猹绐猹岐猹绐岐楠岐岐岐楠妾楠妾猹岐岐妾濯妾濯绐岐绐绐猹妾濯飒岐绐绐绐妾濯妾濯绐猹妾妾猹濯绐悛绐飒猹猹悛濯岐岐岐瑾濯猹绐濯猹悛绐猹濯妾妾濯绐猹岐妾妾妾濯妾猹戟岐绐猹楠濯猹帷 岐岐悛绐飒戟岐悛瑾猹濯绐濯绐岐绐岐猹岐瑾妾猹岐妾绐瑾飒岐绐绐绐妾猹瑾悛濯猹飒绐濯绐猹岐猹濯妾猹濯绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐绐濯悛妾猹濯岐绐悛猹飒飒妾帷 岐绐妾岐猹猹猹飒猹悛绐妾悛濯濯岐绐濯绐濯狻 岐悛妾瑾绐猹岐戟绐戟岐濯瑾岐濯绐猹岐岐绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐悛濯妾岐绐妾绐瑾飒绐猹岐绐猹猹濯绐濯妾绐妾猹瑾绐瑾濯悛猹濯岐妾岐猹妾濯楠岐妾猹绐瑾岐濯瑾岐绐猹岐岐悛妾瑾绐妾戟绐岐猹妾濯楠悛猹妾妾岐妾猹绐猹猹濯绐濯妾绐妾氇岐绐绐濯悛瑾绐绐妾狻 濯猹岐悛妾瑾绐悛猹濯岐妾绐濯岐妾悛岐绐绐猹岐岐绐妾绐濯绐瑾猹瑾岐绐濯濯绐濯绐濯濯飒瑾绐瑾濯岐岐绐绐猹岐猹悛猹濯岐妾岐楠绐濯猹绐楠猹妾绐瑾悛妾濯妾猹绐猹妾猹濯悛濯濯飒瑾绐瑾濯悛瑾濯绐猹岐岐岐绐绐猹岐猹妾绐猹妾猹濯岐妾戟濯岐飒岐愍飒妾绐猹岐悛瑾濯岐绐濯岐妾濯濯濯猹濯悛猹猹岐妾岐濯猹戟绐瑾濯楠妾戟濯濯猹濯猹濯岐绐岐绐绐猹岐瑾濯绐濯猹岐濯绐猹岐妾楠煸 Ц次劳裂Р?烤躬绶嵋德畚挠?拇そ 瑾岐猹飒绐猹妾绐岐岐戟绐妾悛濯濯嬉华岐飒绐猹濯岐瑾濯绐飒猹妾戟妾妾瑾濯妾瑾绐妾猹妾绐楠濯绐猹悛猹濯岐妾妾濯猹戟绐瑾濯楠妾猹戟绐绐绐氇悛猹岐岐绐濯猹戟绐悛濯猹猹妾妾绐妾猹岐岐绐濯飒绐濯悛妾妾戟绐悛绐猹濯妾绐妾绐猹猹戟岐飒妾绐濯绐濯绐绐瑾飒猹岐绐猹饷 濯绐濯妾绐妾猹瑾绐瑾濯悛猹濯峥讵妾猹绐楠猹妾绐瑾飒绐猹猹濯绐濯妾绐妾猹瑾绐瑾濯悛猹濯岐妾岐岐猹瑾绐戟绐濯绐飒岐妾濯绐岐瑾濯猹绐濉 悛绐猹濯妾岐岐戟绐濯濯猹岐妾猹濯岐猹绐岐绐猹绐绐戟绐濯绐飒氇悛濯妾妾猹岐岐悛濯猹绐岐楠妾绐猹妾猹岐岐绐濯绐猹岐妾绐濯岐飒悛濯猹濯岐洫瑾濯猹绐猹濯悛飒绐濯猹妾妾飒岐绐妾瑾悛绐岐绐妾猹绐猹瑾濯妾绐濯悛妾妾岐猹岐岐绐濯绐猹岐戟濯瑾濯猹瑾绐戟绐岐濯猹岐岐岐悛绐飒戟妾妾瑾濯戟绐绐岐瑾岐猹飒绐狻 妾绐岐岐戟濯悛猹飒绐猹妾瑾濯氇悛濯妾妾猹岐楠妾猹妾瑾绐妾戟妾濯妾绐绐绐绐猹瑾濯妾绐濯悛妾妾岐濯濯楠绐绐悛猹岐岐绐濯绐猹岐绐猹瑾濯绐濯悛妾妾楠妾猹岐濯猹岐岐岐悛绐飒戟濯猹岐妾绐岐绐瑾岐绐猹岐岐濯妾妾濯绐猹岐瑾绐岐猹绐岐妾濯绐猹岐猹绐猹绐濯妾瑾妾绐岐妾洫瑾岐绐绐飒猹岐悛濯猹绐岐戟濯绐绐岐悛猹濯岐妾濯纰螵猹岐妾绐濯瑾绐猹岐猹濯猹悛妾瑾妾岐猹绐楠绐飒岐妾猹濯猹岐悛妾瑾绐妾猹绐楠猹悛濯猹楠濯猹悛 妾瑾悛濯悛濯绐猹岐猹岐绐猹岐妾猹濯悛猹濯岐妾岐岐猹瑾绐岐妾岐濯猹戟绐岐妾瑾妾绐岐妾妾濯绐猹岐绐濯岐悛妾瑾绐猹岐绐猹妗 濯猹岐悛妾瑾绐妾戟濯猹岐妾绐濯瑾绐戟绐楠猹绐绐猹妾绐妾飒妾绐悛绐悛濯绐濯妾绐氇绐悛濯绐瑾濯戟濯瑾濯猹瑾绐猹岐岐绐濯绐猹岐猹绐岐绐妾绐岐濯猹洫瑾妾瑾濯岐濯猹岐悛妾瑾绐楠猹绐妾恪,绐濯悛濯妾妾瑾濯绐猹濯岐愣擢猹绐濯猹悛妾瑾岐绐飒悛岐瑾妾绐岐岐绐濯岐妾瑾濯楠楠濯绐戟濯濯猹濯绐绐绐绐岐飒妾瑾岐濯濯猹妾猹悛猹岐岐绐濯绐猹岐妾猹濯岐绐濯猹帷 岐岐悛绐飒戟濯濯猹濯悛濯猹濯绐猹岐绐濯濯猹岐悛妾瑾绐猹岐妾瑾绐妾猹悛绐猹岐岐绐濯绐猹岐猹岐绐妾猹濯濯妾悛猹岐岐妾绐岐濯猹洫?