【doc】 镁离子抗氧化作用的实验研究

【doc】 镁离子抗氧化作用的实验研究 镁离子抗氧化作用的实验研究 ? 260?郧阳医学院(JYMC)2005年10月,24(5):260 镁离子抗氧化作用的实验研究 孙设宗,毛达勇,卢方安,张红梅 (郧阳医学院生化与免疫学综合实验室,附属太和医院检验都,湖北十堰442000) [摘要】目的:探讨镁离子抗氧化作用的机制.方法:3月龄昆明种小鼠5O只,随机分为正常对照组,氧化对照 组,不同浓度镁保护组,饲养10d后,腹腔注射0.15%CC1致小鼠肝损伤,将氧化对照组,不同浓度镁保护组肝匀 浆中加入FeSO和H()2,诱导自由基生成,观察镁离子在体内,外的抗氧化作用.结果:镁离子能显着降低小鼠血 清中ALT和AST活性,以及肝细胞中脂质过氧化物MDA的含量;体外实验镁离子对MDA生成有显着的抑制作 用.结论:镁离子能抑制自由基的生成,促进自由基的清除. ;自由基 [关键词]镁离子;抗氧化;小鼠 [中图法分类号】Q582[文献标识码】A[文章编号】1006—9674(2005)O5—0260一o3 Ther~m-ehofanti—oxidativemechanismofMgSUNShe—zong.MAODa —yong,LUFang—an,eto2 (.laboratoryofbiochemistryandimmunology,YunyangMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China;Departmentof Clinicallaboratory,TaiheHospital,Sh@an,Hubei442000,China), oxidativemechanismofMg2.Meth Abstract:ObjectiveToexploretheanti— odsFKtmmingmicein3monthswere randomlydividedintocontrolgroup,o~dafiongroupanddifferentlevelofMg”groups.AfterlOdaysofbreeding,allmice wereinjectedintraperitoneallywith0.15%CCI4,hepaticinjurywasinduced.Toinducetheproductionoffreeradical,Fe— SO4andH2o2wereaddedtothehepatichomogenateofoxidationgroupanddifferentlevelofMg”group.Theanti—oxida— tionofMg2bothinvlvoandvitroWasmeasured.ResultsThereWasasignificantreductioninserumALTandASTactivity andMDA:theproductionofMDAwasinhibitedmarkedlybyMg”invitro.ConclusionMg2Caninhibittheproductionof freeradicalandacceleratetheclearanceoffreeradica1. Keywords:magnesium;anti—oxidation;mouse;freeradical Mg”作为体内重要的二价阳离子,是多种酶的 辅助因子,其作用近年来日益受到人们的关注,资料 表明Mg2可以对抗自由基生成,对内皮细胞损 伤有保护作用J.本研究通过建立CC1诱导小鼠 肝氧化损伤模型,以及在肝匀浆中加人FeSO和 H2O2,诱导自由基的生成-4J,以探讨Mgn在体内, 外的抗氧化作用,为拓展镁离子的临床应用提供实 验依据和理论基础. 1材料和方法 1.1材料 昆明种3月龄小鼠50只,雌雄各半,体重28, 36g,本院动物实验中心供给.SOD,GSH,MAD, ALT,AST试剂盒(南京建成生物公司),其它试 [基金项目】2005年度郧阳医学院中青年基金资助项 目(2005ZQY02) [作者简介】孙设宗(1954一),男,湖北竹溪人,讲师,主要 从事生物化学的教学研究. 剂均为分析纯生化试剂.仪器设备:ZS83—1型内 切式组织匀浆机(浙西机械厂),MDF一382E型超低 温冰箱(Sony公司),752型分光光度计(上海第二 光学仪器厂),Konelab60i全自动生化分析仪 (Konelab公司),RA一50半自动生化分析仪(Tech— nicon公司). 1.2方法 1.2.1实验分组:50只昆明种小鼠随机分5组,每 组lO只.设正常对照组,氧化对照组,21mmolf L,42mmoL/LJ,63mmo1./L镁保护组,各组均给 予正常饲料,正常对照组和氧化对照组自由饮水,不 同浓度的镁保护组,在饮水中分别以MgSO的形式 加人21mmo1./L,42mmo1./L,63mmoL/L浓度的镁. 饲养10d后,正常对照组腹腔注射豆油溶液,其余 各组腹腔注射0.15%的CC1豆油溶液(10ml/kg 体重),第11d禁食不禁水24h,于眼球取血,分离 血清备用. 1.2.2血清ALT,AST活性测定:用速率法测 ALT,AST 孙设宗等.镁离子抗氧化作用的实验研究?26l? 1.2.3肝匀浆制备及MDA,SOD,GSH测定:处死 小鼠后取出肝脏置冰生理盐水中洗净血液,用滤纸 吸去水分称重,用pH7.4的PBS按1:10稀释冰浴 下匀浆,4?4000r/min离心5min.取上清用双 缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量,用pH7.4的PBS稀 释成4mg蛋白/ml备用.测MDA(丙二醛),SOD (超氧化物岐化酶),GSH(谷胱甘肽)的含量. 1.2.4Mg?对体外诱导肝脂质过氧化抑制作用的 测定:取上述各组肝匀浆(4mg蛋白/m1)0.25ml 置相应的试管中,除正常对照组外,其余各组加6 mmol/LFeSO450l,10mmol/LH2O250l,pH7.4 的PBS缓冲液500l,正常对照组加PBS补充容量 至等量.各管置37?水浴中保温25min启动反应 产生脂质过氧化物,加15%的三氯醋酸1.5ml结束 反应,0.67%的硫代巴比妥酸溶液1.5ml,置沸水中 20min取出,冷却后离心用752分光光度计检测 A532nln处的吸光度值,以A532反映MDA的含量. 按计算镁离子对脂质过氧化物——MDA产生 的抑制率 1.3数据处理 SPSS10.0软件用方差分析处理. 2结果 2.1Mg对CC1肝损伤小鼠血清ALT,AST含量 的影响(表1) CC1进入机体后由肝微粒体细胞色素P4卯代谢 生成三氯甲基自由基(?CC1),攻击肝细胞膜上磷 脂分子中不饱和脂肪酸产生脂质过氧化物,从而损 伤细胞膜,导致ALT,AST漏出细胞,引起血清中酶 活性升高.氧化对照组与正常对照组比较,能显着 升高ALT和AST(P<0.01),不同浓度的镁离子保 护组与氧化对照组比较可显着性的降低血清中 ALT,AST的含量(P<0.01),说明镁离子对自由基 引起的肝损伤有保护作用. 表1Mg对CC1肝损伤小鼠血清ALT,AST含量的影响(?s) 注:与正常对照组比较P<0.01;与氧化对照组比较’P<0.01. 2.2Mg”对小鼠CC1肝损伤MDA,GSH,SOD的种浓度的Mgh与氧化对照组比较,可显着降低 影响(表2)MDA的含量(P<0.01),但体内清除自由基的主要 氧化对照组与其它各组比较MDA显着升高(P成分SOD和GSH并没明显的变化,实验提示急性肝 <0.01),说明CC1进人体内产生三氯甲基自由基损伤时,Mg抗氧化作用也可能通过非酶性途径对 (?CC1,),后者攻击细胞膜产生脂质过氧化物抗自由基的生成或清除. (LPO),导致LPO的代谢产物MDA显着升高.三 表2Mg对小鼠CC1肝损伤MDA,GSH,SOD含量的影响(?s) 注:与正常对照组比较.P<0.01,与病理造模组比较’P<0.01. 2.3Mg”对体外诱导肝脂质过氧化物抑制作用的高于空白对照组(0.359),说明诱导肝匀浆脂质过氧 测定(表3)化是成功的,饮水中加入不同浓度的Mg的小鼠肝 将上述肝匀浆在试管中加入6mmol/LFeSO50匀浆,与氧化对照组比较可明显的抑制脂质过氧化 ,10mmol/LHO50tL1,在保温过程中可诱导脂物的生成,A,显着降低,证明镁离子可对抗自由基, 质过氧化物的生成,氧化对照组As32为0.697,明显抑制脂质过氧化 物的生成.不同浓度的Mg+抑制 ? 262?郧阳医学院(JYMC)2005年lO月,24(5):260 率存在一定的差异,以饮水中42mmol/L的镁离子 抑制率最大. 表3镁离子对体外诱导脂质过氧化物 产生的抑制作用(4-s) 注:抑制率计算方法按文献[4]. 3讨论 用CC1诱导小鼠实验性肝损伤是经典的实验 方法,目前认为,CC1诱导肝损伤的机制,主要是 CC1经肝细胞微粒体内细胞色素P4.代谢裂解生成 ? CC1,.在?CC1,启动的脂质过氧化连锁反应中, 可产生毒性更强的超氧阴离子自由基(O一)和羟自 由基(OH?),这些在体内产生的自由基可攻击膜磷 脂中不饱和脂肪酸,产生脂质过氧化作用而损伤线 粒体膜和肝细胞膜,导致细胞中ALT,AST逸出细 胞;在肝匀浆中加人FeSO和HO,HO是活性 氧,如遇Fe则可诱导产生羟自由基,攻击不饱和 脂肪酸产生脂质过氧化物.MDA作为自由基与生 物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产 物,其含量可反映自由基的变化和膜损伤程度卜引. 本实验表明,给小鼠饮水中加人Mg?,可显着 降低血清中ALT,AST的含量,抑制脂质过氧化物的 生成,降低肝匀浆中MAD含量.在体外抗氧化实验 中直接在氧化对照组和Mg保护组加人FeSO和 HO,诱导产生羟自由基,攻击不饱和脂肪酸产生脂 质过氧化物,Mg?保护组对脂质过氧化代谢产 物——MDA的生成有显着的抑制作用;可阻止脂质 过氧化物的生成,对自由基损伤有保护作用.但是, Mg?并不一定能增加SOD和GSH的含量,其抗氧 化作用并不完全依赖于SOD途径.Mg”抗氧化作 用的可能机制是:Mg?是钙离子的天然拮抗剂,可 减少跨膜钙离子内流,降低了细胞内钙超载,对膜起 保护作用;Mg?能抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸氧化酶的活性,减少自由基的生成.本实验Mg” 有直接促进自由基的清除作用. 给小鼠饮水中加人21mmol/L,42mmol/L,63 mmol/LMg”,与氧化对照组比较,各浓度的Mg均 具有显着性(P<0.01)的抗氧化作用,但不同浓度 之间抗氧化作用强度存在一定的差异;体外抗氧化 作用证明,不同浓度的Mg”对脂质过氧化产物—— MDA生成的抑制率,分别为54.5%,70.38%,47. 65%,提示Mg抗氧化作用与浓度有关,以42 mmol/LMg”浓度的抗氧作用最强.可能是由于 Mg”浓度过低,不能有效的拮抗Ca和对抗自由基 的生成,Mg”浓度过高改变细胞内的二价阳离子的 平衡,过度抑制了钙通道和Ca”的作用,抗氧化 作用反而减弱. [参考文献] [1]时安云,徐海.镁对缺血心肌的保护作用[J].中国 病理生理杂志,1996,12(2):126—129. 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