【doc】 镁离子抗氧化作用的实验研究
镁离子抗氧化作用的实验研究
?
260?郧阳医学院(JYMC)2005年10月,24(5):260
镁离子抗氧化作用的实验研究
孙设宗,毛达勇,卢方安,张红梅
(郧阳医学院生化与免疫学综合实验室,附属太和医院检验都,湖北十堰442000)
[摘要】目的:探讨镁离子抗氧化作用的机制.
:3月龄昆明种小鼠5O只,随机分为正常对照组,氧化对照
组,不同浓度镁保护组,饲养10d后,腹腔注射0.15%CC1致小鼠肝损伤,将氧化对照组,不同浓度镁保护组肝匀
浆中加入FeSO和H()2,诱导自由基生成,观察镁离子在体内,外的抗氧化作用.结果:镁离子能显着降低小鼠血
清中ALT和AST活性,以及肝细胞中脂质过氧化物MDA的含量;体外实验镁离子对MDA生成有显着的抑制作
用.结论:镁离子能抑制自由基的生成,促进自由基的清除.
;自由基 [关键词]镁离子;抗氧化;小鼠
[中图法分类号】Q582[文献标识码】A[文章编号】1006—9674(2005)O5—0260一o3
Ther~m-ehofanti—oxidativemechanismofMgSUNShe—zong.MAODa
—yong,LUFang—an,eto2
(.laboratoryofbiochemistryandimmunology,YunyangMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China;Departmentof
Clinicallaboratory,TaiheHospital,Sh@an,Hubei442000,China),
oxidativemechanismofMg2.Meth Abstract:ObjectiveToexploretheanti—
odsFKtmmingmicein3monthswere
randomlydividedintocontrolgroup,o~dafiongroupanddifferentlevelofMg”groups.AfterlOdaysofbreeding,allmice
wereinjectedintraperitoneallywith0.15%CCI4,hepaticinjurywasinduced.Toinducetheproductionoffreeradical,Fe—
SO4andH2o2wereaddedtothehepatichomogenateofoxidationgroupanddifferentlevelofMg”group.Theanti—oxida—
tionofMg2bothinvlvoandvitroWasmeasured.ResultsThereWasasignificantreductioninserumALTandASTactivity
andMDA:theproductionofMDAwasinhibitedmarkedlybyMg”invitro.ConclusionMg2Caninhibittheproductionof
freeradicalandacceleratetheclearanceoffreeradica1.
Keywords:magnesium;anti—oxidation;mouse;freeradical
Mg”作为体内重要的二价阳离子,是多种酶的
辅助因子,其作用近年来日益受到人们的关注,资料
表明Mg2可以对抗自由基生成,对内皮细胞损
伤有保护作用J.本研究通过建立CC1诱导小鼠
肝氧化损伤模型,以及在肝匀浆中加人FeSO和
H2O2,诱导自由基的生成-4J,以探讨Mgn在体内,
外的抗氧化作用,为拓展镁离子的临床应用提供实
验依据和理论基础.
1材料和方法
1.1材料
昆明种3月龄小鼠50只,雌雄各半,体重28,
36g,本院动物实验中心供给.SOD,GSH,MAD,
ALT,AST试剂盒(南京建成生物
公司),其它试
[基金项目】2005年度郧阳医学院中青年基金资助计划项
目(2005ZQY02)
[作者简介】孙设宗(1954一),男,湖北竹溪人,讲师,主要
从事生物化学的教学研究.
剂均为
纯生化试剂.仪器设备:ZS83—1型内
切式组织匀浆机(浙西机械厂),MDF一382E型超低
温冰箱(Sony公司),752型分光光度计(上海第二
光学仪器厂),Konelab60i全自动生化分析仪
(Konelab公司),RA一50半自动生化分析仪(Tech—
nicon公司).
1.2方法
1.2.1实验分组:50只昆明种小鼠随机分5组,每
组lO只.设正常对照组,氧化对照组,21mmolf
L,42mmoL/LJ,63mmo1./L镁保护组,各组均给
予正常饲料,正常对照组和氧化对照组自由饮水,不
同浓度的镁保护组,在饮水中分别以MgSO的形式
加人21mmo1./L,42mmo1./L,63mmoL/L浓度的镁.
饲养10d后,正常对照组腹腔注射豆油溶液,其余
各组腹腔注射0.15%的CC1豆油溶液(10ml/kg
体重),第11d禁食不禁水24h,于眼球取血,分离
血清备用.
1.2.2血清ALT,AST活性测定:用速率法测
ALT,AST
孙设宗等.镁离子抗氧化作用的实验研究?26l?
1.2.3肝匀浆制备及MDA,SOD,GSH测定:处死
小鼠后取出肝脏置冰生理盐水中洗净血液,用滤纸
吸去水分称重,用pH7.4的PBS按1:10稀释冰浴
下匀浆,4?4000r/min离心5min.取上清用双
缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量,用pH7.4的PBS稀
释成4mg蛋白/ml备用.测MDA(丙二醛),SOD
(超氧化物岐化酶),GSH(谷胱甘肽)的含量.
1.2.4Mg?对体外诱导肝脂质过氧化抑制作用的
测定:取上述各组肝匀浆(4mg蛋白/m1)0.25ml
置相应的试管中,除正常对照组外,其余各组加6
mmol/LFeSO450l,10mmol/LH2O250l,pH7.4
的PBS缓冲液500l,正常对照组加PBS补充容量
至等量.各管置37?水浴中保温25min启动反应
产生脂质过氧化物,加15%的三氯醋酸1.5ml结束
反应,0.67%的硫代巴比妥酸溶液1.5ml,置沸水中
20min取出,冷却后离心用752分光光度计检测
A532nln处的吸光度值,以A532反映MDA的含量.
按公式计算镁离子对脂质过氧化物——MDA产生
的抑制率
1.3数据处理
SPSS10.0软件用方差分析处理.
2结果
2.1Mg对CC1肝损伤小鼠血清ALT,AST含量
的影响(表1)
CC1进入机体后由肝微粒体细胞色素P4卯代谢
生成三氯甲基自由基(?CC1),攻击肝细胞膜上磷
脂分子中不饱和脂肪酸产生脂质过氧化物,从而损
伤细胞膜,导致ALT,AST漏出细胞,引起血清中酶
活性升高.氧化对照组与正常对照组比较,能显着
升高ALT和AST(P<0.01),不同浓度的镁离子保
护组与氧化对照组比较可显着性的降低血清中
ALT,AST的含量(P<0.01),说明镁离子对自由基
引起的肝损伤有保护作用.
表1Mg对CC1肝损伤小鼠血清ALT,AST含量的影响(?s)
注:与正常对照组比较P<0.01;与氧化对照组比较’P<0.01.
2.2Mg”对小鼠CC1肝损伤MDA,GSH,SOD的种浓度的Mgh与氧化对照组比较,可显着降低
影响(表2)MDA的含量(P<0.01),但体内清除自由基的主要
氧化对照组与其它各组比较MDA显着升高(P成分SOD和GSH并没明显的变化,实验提示急性肝
<0.01),说明CC1进人体内产生三氯甲基自由基损伤时,Mg抗氧化作用也可能通过非酶性途径对
(?CC1,),后者攻击细胞膜产生脂质过氧化物抗自由基的生成或清除.
(LPO),导致LPO的代谢产物MDA显着升高.三
表2Mg对小鼠CC1肝损伤MDA,GSH,SOD含量的影响(?s)
注:与正常对照组比较.P<0.01,与病理造模组比较’P<0.01.
2.3Mg”对体外诱导肝脂质过氧化物抑制作用的高于空白对照组(0.359),说明诱导肝匀浆脂质过氧
测定(表3)化是成功的,饮水中加入不同浓度的Mg的小鼠肝
将上述肝匀浆在试管中加入6mmol/LFeSO50匀浆,与氧化对照组比较可明显的抑制脂质过氧化
,10mmol/LHO50tL1,在保温过程中可诱导脂物的生成,A,显着降低,证明镁离子可对抗自由基,
质过氧化物的生成,氧化对照组As32为0.697,明显抑制脂质过氧化
物的生成.不同浓度的Mg+抑制
?
262?郧阳医学院(JYMC)2005年lO月,24(5):260
率存在一定的差异,以饮水中42mmol/L的镁离子
抑制率最大.
表3镁离子对体外诱导脂质过氧化物
产生的抑制作用(4-s)
注:抑制率计算方法按文献[4].
3讨论
用CC1诱导小鼠实验性肝损伤是经典的实验
方法,目前认为,CC1诱导肝损伤的机制,主要是
CC1经肝细胞微粒体内细胞色素P4.代谢裂解生成
?
CC1,.在?CC1,启动的脂质过氧化连锁反应中,
可产生毒性更强的超氧阴离子自由基(O一)和羟自
由基(OH?),这些在体内产生的自由基可攻击膜磷
脂中不饱和脂肪酸,产生脂质过氧化作用而损伤线
粒体膜和肝细胞膜,导致细胞中ALT,AST逸出细
胞;在肝匀浆中加人FeSO和HO,HO是活性
氧,如遇Fe则可诱导产生羟自由基,攻击不饱和
脂肪酸产生脂质过氧化物.MDA作为自由基与生
物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产
物,其含量可反映自由基的变化和膜损伤程度卜引.
本实验表明,给小鼠饮水中加人Mg?,可显着
降低血清中ALT,AST的含量,抑制脂质过氧化物的
生成,降低肝匀浆中MAD含量.在体外抗氧化实验
中直接在氧化对照组和Mg保护组加人FeSO和
HO,诱导产生羟自由基,攻击不饱和脂肪酸产生脂
质过氧化物,Mg?保护组对脂质过氧化代谢产
物——MDA的生成有显着的抑制作用;可阻止脂质
过氧化物的生成,对自由基损伤有保护作用.但是,
Mg?并不一定能增加SOD和GSH的含量,其抗氧
化作用并不完全依赖于SOD途径.Mg”抗氧化作
用的可能机制是:Mg?是钙离子的天然拮抗剂,可
减少跨膜钙离子内流,降低了细胞内钙超载,对膜起
保护作用;Mg?能抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷
酸氧化酶的活性,减少自由基的生成.本实验Mg”
有直接促进自由基的清除作用.
给小鼠饮水中加人21mmol/L,42mmol/L,63
mmol/LMg”,与氧化对照组比较,各浓度的Mg均
具有显着性(P<0.01)的抗氧化作用,但不同浓度
之间抗氧化作用强度存在一定的差异;体外抗氧化
作用证明,不同浓度的Mg”对脂质过氧化产物——
MDA生成的抑制率,分别为54.5%,70.38%,47.
65%,提示Mg抗氧化作用与浓度有关,以42
mmol/LMg”浓度的抗氧作用最强.可能是由于
Mg”浓度过低,不能有效的拮抗Ca和对抗自由基
的生成,Mg”浓度过高改变细胞内的二价阳离子的
平衡,过度抑制了钙通道和Ca”的作用,抗氧化
作用反而减弱.
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[收稿日期]2005—04—05