【最新2014-2015】人体正常和曲张的大隐静脉中胶原亚型的比较-医学论文

【最新2014-2015】人体正常和曲张的大隐静脉中胶原亚型的比较-医学论文 人体正常和曲张的大隐静脉中胶原亚型的比较 【关键词】 ,,曲张静脉壁 【Abstract】 AIM: To determine the collagen subtype pattern in the greater saphenous vein of the lower limbs obtained from 21 normal and 37 varicose subjects and to compare the affected and unaffected segments. METHODS: Following elastase pretreatment and partial pepsin digestion, type?, ? ? collagens were extracted selectively by differential salt precipitation and measured quantitatively in samples obtained from normal and varicose saphenous veins. RESULTS: Significant elevations of water (water content were 78% and 80% respectively P 005) and collagen type?(P 001) content in varicose veins (both affected and unaffected segments) were observed as compared with those in normal saphenous veins. The content of collagen type ? and collagen type ? in varicose veins was found to be slightly reduced as compared with that in normal veins and as a result the C?/,C?+C?,ratio in varicose veins increased significantly (CI content was ,13〒1)%, P C? plus C? content were (19〒05)% and (25〒06)% respectively, P 001) as compared with in normal veins. CONCLUSION: The elevation of the C?/,C?+C?,ratio in varicose veins (P 001) may result in 更多精品文档,欢迎来我主页查询 the considerable weakening of the venous wall, which supports the “weak wall” theory of varicose vein etiology. Keywords】varicose vein wall;connective tissue;collagen 【 【摘 要】 目的: 研究从21个正常人体和37个下肢静脉曲张患者中得到的大隐静脉的胶原亚型，并定量地比较曲张的和未曲张的静脉节段的胶原亚型.方法: 来自正常和曲张的大隐静脉的节段样品用弹性蛋白酶预处理以及部分胃蛋白酶消化后，C?,C?和C?通过盐析而被选择性地提取出来，并被定量地测量.结果: 曲张大隐静脉中受和未受影响的节段的平均含水量分别为(78〒4)%和(80〒4)%，C?的含量均为(13〒1)%，C?+C?的含量分别(19〒05)%和(25〒06)%，正常大隐静脉的含水量为(71〒3)%，C?的含量为(3〒1)%，C?+C?的含量为(35〒07)%.曲张大隐静脉中受或未受影响的节段的含水量和C?的含量同正常大隐静脉相比有显著升高,P,001,.曲张大隐静脉中C?和C?的含量同正常相比有轻微减少，因此曲张大隐静脉中C?/,C?+C?,显著升高,P,001,.结论: 在曲张大隐静脉中C?/,C?+C?,的升高可能造成静脉壁显著薄弱的重要原因，这也进一步支持了曲张静脉病因学的“薄弱管壁”,weak wall,理论. 【关键词】 曲张静脉壁,结缔组织,胶原 0 引言 以往公认大隐静脉曲张形成的直接原因是由于静脉瓣膜关闭不全而导致，因此通过外科途径治疗即大隐静脉高位结扎、剥脱术在临床更多精品文档,欢迎来我主页查询 广泛应用，目的是减低静脉流体静力压.但是，后来的临床研究揭示在这样的外科手术后静脉曲张仍有复发，而且静脉瓣膜正常的人也存在静脉曲张的形成以及静脉血液的生理性回流,1,.研究证明遗传异常也是曲张的原因之一，尤其是在对人类静脉曲张的基因研究上，绝大多数患者有一个明显的家族史就是很好的例证.例如女性与同龄男性相比更易形成静脉曲张,男女比例约1?8,.女性在怀孕期间也易于形成曲张静脉，但在分娩后则可以复原,2,，这种现象与女性体内的性激素以及静脉壁的溶胶原行为的变化是一致的,8,.对大隐静脉曲张形成的另一种解释是静脉壁结构的改变和结缔组织细胞外基质,ECM,成分组成的变化，这可能是静脉曲张形成的主要因素,4-9,.人们观察到在静脉壁上一些生化改变如弹性蛋白减少,4，9,、总胶原含量增多,4，6，8,以及细胞外基质成分的退化和溶蛋白行为增强,6,.Mashiah等研究了大隐静脉超微结构并观察了曲张静脉管壁结构上的改变 ，提出大隐静脉的曲张及爆裂可能是由于血管壁局限的削弱而引起的,7,.静脉壁细胞外基质主要包括弹性蛋白、纤维结合素以及C?，C?和C?，它们维持血管结构的完整性及弹性.含量最丰富的C?，起着传递血管壁张力的作用，而C?则涉及其伸展性和弹性.C?/C?可能决定了血管壁的强度以及其对流体静力压的抵抗力.为此我们定量地确定了在正常和曲张大隐静脉中胶原亚型的型式，并加以比较研究. 1 对象和方法 更多精品文档,欢迎来我主页查询 1.1 对象 大隐静脉曲张的节段是在37位1999/2001年在我院血管外科因下肢大隐静脉曲张而接受高位结扎、剥离术的女性患者手术过程中收集到的.曲张大隐静脉的未曲张节段是从大隐静脉的距其曲张区域2 cm处的健全节段收集到的.大隐静脉的瓣膜关闭不全是通过多普勒超声,PVL,,7,证实的.正常大隐静脉的标本来自21位在我院心脏外科中心接受冠脉旁路移植术的女性患者.收集到的标本立即冷藏于-120?，以免结缔组织降解. 除非特别提到，所有的试剂均来自Sigma，St. Louis，MO，USA. 12 方法 1.2.1 胶原提取 用手术刀将大隐静脉切成长约1cm的片段，并将这些静脉组织样品片段放到滤纸上，按,500〒001, g的等份称重.然后用4?的包含不同的蛋白酶抑制剂的提取缓冲液,05 mol L-1 TrisHCl / 45 mol L-1 NaCl (pH74) ,洗涤组织.这些蛋白酶抑制剂有:胃酶抑素A,1 mg L-1,，NEM,nethylmaleimide,(2 mmol L-1)，PMSF,phenylmethylsulfonyl fluoride,(1 mmol L-1)，DIFP,diisopropyl flurophosphate,(1 mmol L-1)，亮肽素,1 mg L-1,和EDTA,依地酸,,20 mmol L-1,.洗涤后将其离心,10 000 g，30 min， 4?,收集组织，抛弃上清液.在提取液中，经弹性蛋白酶消化，再经Tris缓冲的2 mol L-1 MgCl2和4 mol L-1胍HCl在4?时洗涤后，蛋白多糖就被提取出来.同上所述，通过05 mol L-1醋酸条件下,pH25,部分的胃蛋白酶,Boeringer，Mannheim，Germany,的消化,酶底物比1:50,，胶原被第二更多精品文档,欢迎来我主页查询 次提取，离心后澄清的上清液被收集.为了灭活胃蛋白酶，将NaOH溶液加入其中并调整pH75.在中性溶液中NaCl盐析可使C?,22 mol L-1,提纯，同时留有混合C?+C?,44 mol L-1,成分.为除去残留的盐，用蒸馏水多次洗涤胶原，然后离心,20 000 g，20 min， 4?,收集，称重并保存于-20?直至使用. 1.2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDSPAGE,分析 十二碳烯酰钠硫酸盐凝胶电泳,Sodium dodecyl sulfategel electrophoresis,(5%)用于定量评定从静脉组织中提取出来的不同胶原，并同人类胶原做比较.所用的SPSPAGE分离条件适宜于胶原.在样品缓冲液中,pH 68,胶原样本水溶5 min至沸腾，并在每一条带上加入等量的标准胶原蛋白,60 μg,.凝胶固定并在醋酸?甲醇?水,1?1?8,的溶液中用Commassie brilliant blue R250 染色. 统计学处理:数据用x〒s表示，组间各有关指标比较采用方差分析及Dunnett t检验. 2 结果 2. 1 大隐静脉中提取的胶原SDSPAGE分析 通过特异的盐析而从正常的以及曲张的大隐静脉中提取出来的纯化的胶原用 SDSPAGE分析,22-25,并同标准的CI和C?相比较.Fig 1a为来自大隐静脉的纯化胶原SDSPAGE分析(5%).在右边，通过三体,τ,，二体,β,，三体,α,的各种各样单体,α,的迁移，胶原的链被显示出来.在左边，高分子量球蛋白标准:Mr为205〓105的肌更多精品文档,欢迎来我主页查询 球蛋白,兔肌肉,,Mr为116〓105的β半乳糖苷酶,E.Coli,,Mr为97〓104的磷酸化酶b,兔肌肉,.等量的蛋白加入到每一条带中.带A,C?，鼠尾,Sigma,,带B,C?，人类胎盘,Sigma,, C?，曲张静脉(受带C,C?，曲张静脉(受影响部分),带D,C?, C?,C?，曲张静脉(受影响部分).胶原类型可通影响部分),带E, 过它们的α链的迁移而鉴定:C?通过轻α2,?,链，C?通过轻α1,?,链，此链与重α1,?,链一起迁移，C?与重α1,?,3链一起迁移. 上一页1 2下一页 图1 来自大隐静脉的纯化胶原的SDSPAGE分析(略) Fig 1 SDSPAGe analysis (5%) of purified collagens from saphenous veins,略, 本结果显示C?通过NaCl沉淀充分提纯，然而C?，C?不得不一起定量.所有的三型胶原都是从正常以及曲张静脉中提纯的，且C?的相对数量比另外两种高.这一点与以前的在人类血管壁上的数据相对应,26,.Fig 1b中描述的所有的实验都被在条带E中C?样本所还原,reduction,.条带A,C?，人类胎盘,Sigma,,带B,C?，曲张静脉(受影响部分),带C,C?，正常静脉,带D,C?+C?，曲张静脉(未受影响的节段),带E,C?，人类胎盘,Sigma,被5%αβ硫基乙醇还原. 2. 2 静脉中水含量 血管壁水含量的改变可能反映了其结缔组织含量的改变.本结果显示正常大隐静脉水含量为(71〒3)%，曲张静脉更多精品文档,欢迎来我主页查询 受和未受影响的节段的含水量分别为,78〒4,%和,80〒4,%.因此，曲张静脉受和未受影响的节段的含水量同正常的大隐静脉相比 001,. 有所提高,P, 2. 3 静脉的总胶原含量 本结果显示，正常大隐静脉总胶原含量占静脉干重的,6〒2)%，曲张静脉,受或未受影响的节段,总胶原含量占静脉干重均为(15〒3)%.因此，正常大隐静脉总胶原含量占静脉干重同曲张静脉,受或未受影响的节段,相比，有显著提高,P,001,. 2. 4 静脉中C?与C?+C?含量比 本结果显示正常大隐静脉C?和C?+C?质量分别占静脉干重的,3〒1)%和(35〒07)%，曲张静脉中受影响的节段C?和C?+C?质量分别占静脉干重的(13〒1)%和(19〒05)%，曲张静脉中未受影响的节段C?和C?+C?质量分别占静脉干重的,13〒1)%和(25〒06)%.因此，同正常大隐静脉比较，曲张静脉中C?含量有显著提高,P,001,，C?+C?含量稍有下降.由于同正常静脉相比较，曲张静脉中C?上升和C?+C?下降，因此C?/ ,C?+C?,比率在曲张静脉的受影响和未受影响的节段中同正常隐静脉相比都有显著提高,P,001,. 3 讨论 由于静脉壁结构的异常而导致的血管机能不全，已成为人类静脉曲张形成的主要病因,4-9,.因而“薄弱管壁”,weak wall,理论,7,可用来解释薄弱的大隐静脉壁节段性的曲张和爆裂，因为这些节段中ECM的成分构成异常. 更多精品文档,欢迎来我主页查询 本研究定量地评定了曲张大隐静脉中曲张或未曲张节段中胶原亚型的型式，并同正常大隐静脉做了比较.结果显示曲张静脉中C?含量显著增加，这同以往研究显示结缔组织穿入曲张静脉中层的平滑肌之间,4-8,9,的现象是一致的.而同正常大隐静脉相比，曲张大隐静脉中包括曲张或未曲张节段都包含有异常增多的C?，这将使得我们以后有更多的兴趣聚集于对在曲张静脉的血管壁中层及血管内膜下的结缔组织成分的异常的研究. 本研究支持曲张静脉病因学的“薄弱管壁”理论，结缔组织侵入血管中层平滑肌打破了规则的细胞模式并分离了平滑肌束,7,.通过对纤维母细胞和来自曲张大隐静脉的曲张和未曲张节段以及正常大隐静脉的平滑肌细胞中每一种胶原的评定，就证明了这一点. 本研究可有助于对静脉曲张这一类疾病发展新的治疗，如在有静脉曲张倾向的患者中早期应用雌激素抑制剂，可使静脉中C?含量降低，C?+C?含量上升，即C?/,C?+C?,比率下降.此疗法可能防止乃至于系统地治愈曲张，并且也支持了静脉曲张手术时对保留大隐静脉主干的限制,10，11,，减少了术后并发症的发生，为广大静脉曲张患者带来福音. 【参考文献】 ,1, Timmons MJ. 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