HLAB48：22新等位基因发现和确认研究（可编辑）

HLAB48：22新等位基因发现和确认研究（可编辑） HLAB48:22新等位基因发现和确认研究 . 学校代码: 学 号: 学科门类:医学 专业学位口 夭肄眚科鼻萼◎ 硕士学位 , ~凸? 论文目:去:新等位基因的发现 和确认研究 去: 一级学科:基础医学 二级学科:病原生物学 论文作者:刘娜 指导教师:袁玉华 幺 导师组成员:袁玉华安仕萍闫莉娜 一 天津医科大学研究生院 二?年五月~ 。 ‘ ’? 学位论文作者 日期:咖巾 ? 签 导 师 日期:戽月日天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的: 应用荧光微珠 .基因分型技术、基因测序分型技术和基 因克隆技术,对用直接测序不能确认结果、可能携带有未知 等位基因 的样本,开展基因克隆技术分离单个等位基因、测序后获得未知 等位基因 碱基序列的研究,以确认样本中可能携带的新等位基因。 方法: 本课题应用荧光微珠 基因分型技术、基因测序分型技术 和基因克隆技术,采用商品化试剂,对含有未知等位基因的号疑 难 样本进行研究,获得单个等位基因序列;与专业数据库进行序列 比 对,将未知序列在锄进行注册;向 因子命名委员会申报 新等位基因。 结果: .在本实验室建立起用基因克隆技术分离单个等位基因的研究方 法。 .将单个未知等位基因的碱基序列,与专业数据库比对仍为未 知序列。与最接近的.::序列进行比对,在.位点第外显 因子命名委员会。 子出现个碱基替换。将未知序列上报 结论: 获得的未知等位基因的碱基序列,已经在注册,注册号为 因子命名委员会确认为新 ,于年月日被 等位基因,正式命名为.:。 序列分析 关键词:等位基因.基因克隆~ ? . 。 .昭 幸:: . . % . . ??:,. , ? : ?天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要?“? 符号说明? 前言?“?“??“”??..??”??一一”??。 刚吾”“”“?“??“”??”??”??”“”研究现状、成果? 研究目的、方法? 一、.:新等位基因的发现.对象和方法? ..材料..方法一?”??“?....数据的收集和分析软件“? .结果” .讨论??一””?” 二、基因克隆分离单个.:新等位基因.对象和方法? ..材料?“”?”?“ ..方法??..? .结果? .讨论”“结论??“一?”?“? 参考文献发表论文和参加科研情况说明综述??”?“..综述参考文献致谢??“?”??”””.. 基因库 外显子 天津医科大学硕士学位论文 刖磊 概述 主要组织相容性复合体, 是表达于 脊椎动物有核细胞表面的一类具有高度多态性,含有多个基因座位,并紧密连 锁的基因群,负责识别某一组织,是同源的予以接受,是外来的则加以排斥。 ? 在不同物种中所处的染色体位置不同,其中小鼠的又称。复合体, 位于号染色体上;人类的又称复合体,与小鼠.为同源结构, ,利用分子生 位于第号染色体短臂.上,其分布范围大约. 物学的手段已经测得该区全部序列,按其编码产物的结构、表达方式、组 织分布与功能可将这些基因进行分类见图。 . 复合体的分类 .类基因:在类基因区内,存在多达个类基因座位,已识别并 命名的有个基因座位,其中.、.、.为经典的.类基 因。 .?类基因:在?类基因区包括约个基因座位,经典的?类基因一 般 指、和,它们编码的产物均为双肽链分子。 .?类基因:免疫功能相关基因。现已发现.?类基因区至少有 个基因座位。其中、、、座位编码相应的补体成分,另外包括 羟化酶基因、、肿瘤坏死因子基因 、以及热休克蛋白,基因等。 非基因:近年来,还发现了一些位于类基因区的新基因座位,其中 部分基因的产物及功能已清楚,它们包括: 肽链转运蛋白基因即和,其产物与细胞内的肽转运有关, 已被命名为抗原处理相关的转运蛋白或抗原肽链转运肽 。 蛋白酶体相关基因 即和,其产物 参与内源性抗原处理和递呈,已被命名为低分子量多肽?或巨大 多功能 蛋白酶。天津医科大学硕士学位论文 人类复合体第号染色体: 瞰 ?????一 ?????一 ? .?图.人复合体基因在染色体上的分布 .等位基因与复等位基因 等位基因是在一对同源染色体上,占有相同座位的一对基因,它控制一对 相对性状。在一个群体内,同源染色体的某个相同座位上的等位基因超过个 以上时,就称作复等位基因。对某一个体来说一个基因座只有一对等位基因, 复等位基因是群体的概念。如乙复合体类和类基因位点多为复等位基因。 .皿的特异性与命名 根据不同等位基因编码的分子在抗原特异性上的差异,用血清学和细 胞学方法,检出了大量的抗原型表型,将之命名为特异性或称为型。 根据不同等位基因之间的序列的差异,用各种分型技术可以直接确 定等位基因。由于许多等位基因可以表现出同一种抗原特异性,因此等位基因 水平的多态性比抗原水平要高得多,等位基因的命名也是与它所属的抗原型联 系在一起的。 甩因子命名委员会于年月日公布了玎系统等位基因 的最新命名原则。对卸乙系统基因的命名,星号木前为基因座位,星号后 为等位基因见图。卸命名委员会指出,所有等位基因的命名至少位数, 位和位数的名字只在必要时指定,冒号代表分隔号。图中“”描述基因组, 天津医科大学硕士学位论文 即血清抗原型别;“’’代表特异性的蛋白,即亚型;“描述等位基 因在编码区同义替换不同的核苷酸;接下来的“”指定内含子序列多态性, 内含子或外显子’,’非编码区的不刚】;后缀“用于注释表达的变化。 图.命名 如.一抗原的命名由卸二因子命名委员会确定,每个特异性抗原均以 其基因位点的字头附以适当的数字按抗原被发现或正式命名的顺序表示。 标有的为暂用名,得到认可后将其去掉;年决定:新特异 性的申报要有明确的顺序,并根据间关系命名,故取消;现在所 保留的已非当初实验室暂定名的含义,例如保留以示与补体缩写 区别, 保留和以示其用细胞学方法检测。后面带括弧的表示该特异性由括弧 内的特异性分解而来,括弧内为早期确认的抗原,包含多个特异性。表中抗 原不是独立基因位点的编码产物,而是与和广泛相关,是用细胞学方法 检测的抗原。 .?.一新等位基因的发现进程 在实验室常规分型中,如检测样本与多余的探针、引物反应,为 额外反应:与相应的引物或探针未全部发生反应为短反应:或二者兼有之为共同 反应。在此基础上再进行测序,克隆等,有可能发现新的等位基因。等位 个 基因数量明显增加与技术发展是密不可分的,截止年月,共有 天津医科大学硕士学位论文 等位基因被发现【】表,其中.类基因的位点包括本实验室所发 个等位基因表。 现的.:在内,共有 表./数据库对等位基因的数量统计 数量 等位基因类.?类基因 其它非基因 保密基因 表..类各基因座位等位基因的发现 早期分型技术以血清学为主,基因分型应用技术主要是、 .强,测序非常复杂,加之其它原因,所以.年,等位基因数 量呈增长缓慢;.年.类的新等位基因发现速度高于类, 此阶段.?类基因分型技术已广泛应用于临床和科研,常用方法 为 .、.测序:.年,.类新等位基因的数目快速增长, 最高时为发现的.类的倍,这主要归功于.类基因分型技术的广泛 应用和测序技术的快速发展。从.年,人们用近年的时间发现 多个等位基因,绝 等位基因约 个,而.年年间,新发现了 大部分是在.年发现的,这基于世界各国骨髓库的发展、经济的发 展及 相关科技的进步口】见图。 天津医科大学硕士学位论文 姗 珊 珊 姗 姗 砌 黼 跚 硼 姗 姗 姗 脚 姗 啪 鲫 枷 抛 。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?几 ?几 ?几 ? 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ?? ? 旺嘲, 图.年.年月新等位基因发现的趋势图 .目前申报新等位基因的条件川: 必须进行正向、反向双向测序。 源自的序列和产物被克隆,应选择多个克隆产物测序。 扩增产物直接测序,须用来自于个不同反应的产物进行测序。 对于杂合子,若其中一个等位基因可能是新等位基因,则这个新等位基因 必须与另一个已知等位基因分离后进行测序。因此,那些由直接测序得出的杂 合序列不能成为正式命名新等位基因的依据。 扩增用的引物序列不应被加入提呈命名的序列中。 天津医科大学硕士学位论文 有时新序列应该用诸如.或者的基因分型方法,这个新序 列或者包含一个新的变异,或者存在~个原来没有发现的核苷酸序列组合序列 模序,这些须用分型技术证实,需要应用新设计的探针或者引物以便能扩 增新变异的序列,这些新设计的探针或者引物同样被要求呈递。 必须向如下三个数据库之一提交未知序列,获取个准入号码,序列可以 由下面给出的地址在线提交。 ::/...//. ::/..../. ::/...。. 如果有条件,以呈递全长基因序列为佳,提呈序列的基本要求是:对于 .类序列至少要提供第和第外显子序列,.类至少要提供第外 显子序列。 如果该新序列在内含子或者是基因非编码区,那么必须呈递全长序列,必 须包括编码区和非编码区:如果与新等位基因最接近的等位基因序列缺少全长 基因序列,在新基因被命名之前这个相近基因同样需要被测序并呈递。 关于描述新等位基因的文章应该发表,文章的手稿可以用呈递给 。 数据库/ 或者其它材料,最好是细胞株,如果可能,保存于一个公开的可被获 取的库中,最少应保存在原始实验室中,相关文件应该保存在命名委员会。 向命名委员会申报新等位基因需要应用:帆../ 小//.提供的在线工具,研究人员需要提供新等位基因序列 的相关信息、新等位基因序列和已知最接近的等位基因序列的比对结果,假如不 能用在线网页提供的工具呈递序列,可直接联系/获取其它呈递 序列 的方法。目前,如果所提呈的资料和数据完全符合以上要求,新等位基因将很快 获得正式命名。 研究现状、成果: 目前,确认新等位基因主要有三条途径:.直接测序.基因克隆后测 序.使用单倍型特异性分离方法分离单倍型特异性后测序。本研究所在实 验室有个疑难标本号标本,在完成.中低分辨基因分型和高 分辨直接测序后均不能确定结果。中低分辨不能给出确切分型结果,测序结果 天津医科大学硕士学位论文 显示有不可调碱基替换,与专业数据库比对后发现有可能存在新等 位基因。这种情况下直接测序的应用受到局限,可选择后两条途径之一对 新等位基因进行确认研究。其中第条途径需要由一套自动化的专业设备来完 成单倍型特异性的的提取,本研究所在实验室还不具备这种条件。另外, 命名委员会规定,命名新等位基因序列的条件之一就是:对于 带有杂合基因的个体,得到两个基因的序列应该是独立的;两个杂合基因的序 列在一起分不开的情况下,所得到的基因序列不能作为正式命名新等位基 因的依据。因此,本课题针对命名委员会的上述要求及实验室现有的科研 条件,拟对该疑难样本采用基因克隆后测序进行新等位基因的确认研究。 通过建立用基因克隆技术分离单个等位基因来研究未知等位基因的 研究体系,获得碱基序列,确认新等位基因。 以往申报新等位基因的基本要求是:.类序列要提供第和外 显子序列,.类要提供第外显子序列,这有可能造成模棱两可、难以命 名的情况:同时,近年来发现新的等位基因出现在基因的非编码区有逐渐 增多的趋势,在我国目前发现的新等位基因中约%出现在基因的非编码 区,随着研究工作的深入开展,这种编码区与非编码区的比例将倒置,故要准备 好提供全长序列技术,建立新等位基因的细胞株非常重要,以便为今后的 研究做好“铺垫,如对全长序列分析后有可能提出新的等位基因等【。目前大 部分实验室测序局限于片段测序和某位点的基因组测序、或某等位基因的片段 测序,克隆技术也常为基因片段克隆测序,全长测序较少,这也相对制约 了我国发现新等位基因的步伐,如果有条件可在大的室建立全长基 因测序或测序。 本研究所在实验室早在年发现了个新等位基因,被世界卫生 组织 命名委员会正式命名为:.公布、: .公布。到目前为止,包括本课题发现的.:在内,本实验 室已累计发现个新等位基因。 随着科技的发展,高通量测序、测序广泛应用、新技术的开发与应用、 样本量的不断增加,特别是中华骨髓库少数民族入库量增加,以及我国发现 新等位基因的经验越来越丰富、研究的越来越深入,有关对所发现的新等位基因 的数量、对发现新等位基因的思路,将会有长足进展。同时也会推动与 密切相关的干细胞移植、器官移植、与相关疾病、人类学等多领 域的 比对 所含 一?????????????????????????????????????????一~ 天津医科大学硕士学位论文 一、:新等位基因的发现 一、:新等位基因的发现 %?、是国际主 ? 和 要相容性组织委员会,所 推荐的三种基因分型方法隋。目前,国内普遍采用的分型方法是 前两者。.分型操作简便快速,但不适于批量操作,易出现结果不易判 读现象。流式反向技术将流式细胞技术与传统技术相结合,并在此基 础上加以改进,具有高效、快速、准确的优点。我们采用.和流式反向 技术对中华骨髓库天津分库的捐献者标本进行中低分辨基因分型,不 能确定结果的疑难标本进行测序,确认分型结果,寻找、发现新等位基因。 首先经快速抽提试剂盒抽提样本基因组,扩增,, 基因外显子,使用流式反向技术检测各基因位点,发现号标本 位点不能给出确切结果,可能存在新的等位基因。要求命名新的 基 因型时,必须提供测序结果。我们随后进行测序,以期得到确切结 果。 .材料和方法 ..材料造血干细胞捐献者静脉血标本例,使用% 抗凝剂.采集患者肘静脉血,摇匀,编号,备用。 ...仪器 分析系统美国公司,一序 列分析仪美国应用生物公司,高速低温离心机德国公司, 扩增仪美国公司,核酸检测仪美国公司,净化台苏净 集团安泰公司,.超级纯水器日本公司,水浴摇床、气浴摇床、 干燥箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司,加样器,法国公司。 ...实验耗材孔上样反应板美国应用生物公司,各种量度的吸 头,联扩增反应管,.,,离心管美国公司,快速纯化 柱德国公司。 .。.试剂 ... 抽提试剂:购自天根生物技术公司。 .... 分型试剂盒:购自美国公司 ....测序试剂:购自德国公司。 一、.:新等位基因的发现 天津医科大学硕士学位论文 .... 胶、含的倍测序电泳缓冲液:购自美国公司。 ..方法 。..基因组的抽提:将全血加入.微量离心管中,加红细胞裂解液, 震荡混匀至透明, 离心,弃上清,共裂解次, ,溶液,含蛋白酶 管底可见白色微带红色的沉淀物;分别加入 ,在此期间混匀次,使沉淀完 的核裂解液,混匀后放入。水浴 全溶解。取出后加入.冷无水乙醇,轻轻颠倒试管.次,絮状沉 淀析出,将所得溶液和絮状沉淀转入放有吸附柱的收集管中, 离心 ,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中,加入.缓 冲液, 离心,同样倒掉废液,再加入漂洗液, 离心,倒废液,将吸附柱放回收集管中, 离心,室温晾 干吸附柱残余漂洗液,将吸附柱转入干净离心管中,悬空滴加预 温 的.纯水,室温放置, 离心,将溶液收集到离心管中。 用前?保存,用后.?冻存。 ..。 纯度/及浓度 /测定:取山基因组,用 核酸检测仪测定、、和的吸光度值,纯度 一般为...,浓度约/。 ...流式反向法基因分型:将样本稀释至/、含有 的缓冲液、酶、引物混合,加入扩增板。反应循环参数为:。 ???、?、? 个循环???、?、? 证??保存。按操作说明进行杂交、染色和读板,取. 个循环一? 扩增产物,加入..变性缓冲液,室温孵育,再加入.中和缓 冲液,吹打混匀,颜色由紫色变为浅黄色,加入包被寡核苷酸探针 的磁珠 荧光 进行杂交, ,用洗涤缓冲液洗遍后,加入 进行标记反应,再置入流式仪自动检测、 缓冲液,仪 读取数据,由软件分析结果,获得.人,的特异性。 ...直接测序分型: 反应缓冲液 .... 扩增反应:在.的离心管内加入 和. 金酶,取出山作阴性对照,在其余的混合液中加入浓度在 ./.的基因组,混匀后加入到各个反应孔中进行扩增。 反应循环参数为:??、?、? 个循环一? 中,?,降解残余引物和,然后?灭活酶,冷却至? 备用。 .... 测序反应:使用商品化的. 进行测序反应。 实验在冰浴条件下进行,反应管中加入 染料混合液,山测序反应 引 扩增仪上进行测 物,山纯化产物,总体积山。封盖后放入 序反应, ??、? 个循环一?保存。 . 和 ....纯化测序反应产物:使用葡聚糖凝胶 纯化柱。 .....制胶和制柱:按葡聚糖凝胶加水可分配给个离心柱计 算,根据测序反应孔数,取适量的葡聚糖凝胶和水加入到带盖的 “或的 离心管中,放置,期间摇晃数次。然后将纯化柱置入接收管 上,把制备好的胶分装到柱中,每只柱加至约/处, 离心,去 掉柱中水分。弃掉滤液,保留接收管以备再用。 .....测序反应产物的纯化:按照测序反应的顺序标记.的反应 管, 把纯化柱放在管上,依次将测序产物加到纯化柱葡聚糖凝胶的斜面上, 离心. ,洗脱液就是纯化的测序产物,避光保存,用于测序仪上样。 ...运行测序仪进行毛细管电泳: ....在孔反应板中,每孔先加入 .兆欧.纯水,然后按照 测序反应格局依次加入纯化测序产物,密封反应板,组装反应架,放入测序 仪的自动加样器中。 .....设置毛细管电泳条件:毛细管长/一胶/含的×缓冲液 /注入电压 /荧光染料组/电泳温度?/电泳电压. /进样时间或 ,根据荧光信号强度调节进样时间。 ..数据的收集和分析软件:点无结果。 ..直接测序分型: .. 组特异性引物扩增产物电泳图谱见图:结果显示组,组阳性, 参照.试剂组特异性引物表见表,号标本的两个等 位基因恰巧同在第一组。 .. 序列分析:将第孔和孔产物纯化后,分别进行第外显子反 向和第外显子正向测序,仍没有得出确切的分型结果。测序软件的碱基注释 图谱显示,多数为蓝色,说明碱基识别的可信度高,实验成功图。 . 分型软件列出了多组可能的分型结果,其中包括:当只有第外显 子的第位碱基发生替换时,结果接近于:和::; 当第外显子的第、,位共处发生碱基替换时,结果接近于:: 和::见图,。 图.样本应用 .试剂进行直接测序时目的片段扩增产物电泳图 分子量标准是 、 、 、 、 、, ,,,,,,.,,,,,,,, ,,,, ., , , ,,, . 塑竺翌璺 一. ?????????????????????????????????????????????????????? 一一 三竺一 天津医科大学硕士学位论文 一、.:新等位基因的发现。...?? 九 . . ..。 .. ?川??嘲嘲?? ?“:: 『 哪龇脚册 虬 :脚州吖仃胛仃胛胁阿踟跚咄 跚咖泓踟 删吣礅卿脚础 。........ .. ... . ”眦盯佗比胛比胛不 啊 阻盯啊 舶 脚 啦耵砸黜髓 必丽 . 舢??四舢..????吣?砌? 四四四四四四六六四筛五四四。 盯 饥哪 蝴】蝴黜盯踟 舢舵 必 眦 眦 岫 砌? ?????? ?????? ???????? ??????? ??????? ???????? ???? ???????? ?? ?????? ? ??????????? ???,???... 下?????????? ??????????; ???????????? ??????????? ?????‘?: ???????? ???????????????? ????????????????? ?????????????? ?? ????????? ???????????????? ????????; ????????;??????? ?????????????? ??? ??????????????? ??????????????????? ???????? ????×???一? ????????????????????? ????????????? ????;??????????? ?????????????????? ???????????????????????????.. ??????,????? ????????????????????? ??????????????.??????????? ??????????????????????? ???????????????????????? 下?????? ????????????????? ????????.??????????直???????? ???????,且??????? ??????????????????? ?????????;?????????; ?????????????扫 ???????,?????????? ?????????????? ??????.????????????????????? ????????????????? ???????????????????:? ??????????????.?? 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~一 簿 一 一 叼 溅 一 潜 们 ? 溜 ? ?重 鲤巴醯鲥 骂 九 :伦 ?’ 酬。哆 三 圈譬。日”二 \ ,. 、/ ‖?认八厂\ 八八?八‖ 一。型 , , . : 洲 ?翟二月 怕 ?曩 口.,‘二 气 , ,八.../\小\.支/、八棚 二 孺. .?. .壁堂 . 竺 。 .“。 ‘:型?坐: 擘锨四船斓棚瀚嘲? 【】 。 。 】 ’ 口 ’『付’ 图.阳 .如分型软件对未知序列与 ::,::比对分析结果 一、:新等位基因的发现 天津医科大学硕士学位论文 .讨论: 由于中华骨髓库的建设推动了我国基因分型检测技术的快速发展, 从方法、杂交技术、基因芯片、再到测序只经过了短短几年 的时间。目前临床移植配型主要采用方法,骨髓库建设则主要采用 荧光微珠流式杂交分型技术。 技术的原理是:扩增基因片段,利用序列特异性寡核苷酸探针, 通过杂交方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与产物在一定条件下的杂交 具有高度的特异性。本实验中所采用的新型方法是美国 公司在传统方法基础上发展出的一种新方法,其原理是一种反向 配型系统。将相关的特异性探针事先包被在纳米大小的微珠上,与经过扩 增的片段进行杂交并标记后,被 流式仪读取出来【。每次可 以同时进行份标本的分析,不但提高了实验速度,而且增加了实验精度,由 于其自动化程度高,减少了人为因素造成的影响,在基因分型研究中具有 其他分型方法不能比拟的优势,已经开始取代传统的杂交技术在骨髓 库中的地位,具有很好的应用前景。但是由于现有的分型试剂均是以目前已经 发现的基因序列为基础进行设计的,而且大多数是以西方人群资料为依据,在 用来进行中国人群的分型检测时不可避免的出现新的反应格局,有时无 法与试剂盒所提供的判断模板相匹配,因而出现不确定的模棱两可结果】。 本例分型,位点未得到确切结果。分析软件提示:如果号珠 子为假阳性,则可能得出的结果是木,?,但号珠子与质控珠 子反应图谱相似,且与该标本同批次检测的标本共有个,整体反应格局清晰, 说明号珠子是真阳性,上述假设不成立,进行次.分型,结果一 致,有理由认为该标本位点存在不能为目前检测试剂所识别的未知核苷 酸序列,提示可能存在新的等位基因,需通过序列分析进一步证实。 直接测序分型技术是对扩增的目的片段进行序列分析,通 常情况下可以直接得到基因型【。但是,.分析软件显示, 即无确切的结果。软件列出了多组接近 标本的直接测序结果为: 的结果,其中当只有第外显子的第位碱基发生替换时,结果接近于: 和.::;当第外显子的第、,位共处发生碱基替换时,结果 接近于::和.::。上述的碱基替换是在受检标本序列的毛细管一、.:新等位基因的发现 天津医科大学硕士学位论文 因 电泳荧光信号正常,背景信号弱,电泳图谱均匀的情况下出现的, 子命名委员会公布的已知的标准序列进行比对【,与最接近的序列相比较仍存 在不同的碱基。因此,推测该标本可能存在新等位基因。由于直接测序试剂属 于组特异性试剂,该标本的两个等位基因恰巧同在第一组,因此不能确定替换 的碱基属于还是。另外 命名委员会规定,命名新等 位基因序列的条件之一就是:对于带有杂合基因的个体,得到两 个基因的序列 应该是独立的;两个杂合基因的序列在一起分不开的情况下,所得到的基因序 列不能作为正式命名新等位基因的依据。为此,下一步将通过在本实验室 建立用基因克隆技术分离单个等位基因的方法,获得碱基序列,确认 新等位基因。 二、基因克隆分离单个:新等位基因 国内外的文献资料表明,、.、基因克隆和测序已成为 新等位基因研究的必要手段。.、.由于技术原理的限制,不能 对所有的等位基因进行严格的区分,而出现摸棱两可结果,特别是以往没 有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决,然而,当遇到等位基因杂合 时,测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧,这 时要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列钔, 这种情况下,基因克隆成为确认新等位基因所不可缺少的关键技术。因此, 对于现有号疑难标本,有待于克隆出单个等位基因后测序进行确 认。当 前,商品化基因克隆试剂日趋稳定、实用,便于操作,也为本课题 的顺利开展 提供了保障。年底,号标本中的未知序列被成功克隆和测序。 年月日,未知序列被 因子命名委员会确认为新等位基因,正式 命名为.:。 .对象与方法 ..材料 ...骨髓库自愿捐献者血液标本编号,.冻存血样直接测序不 能确认结果,重提 ...仪器:高速低温离心机德国公司, 扩增仪美 国公司,凝胶成像分析系统中国医学科学院血液学研究所生物制 品公司, 核酸检测仪美国公司,净化台苏净集团安泰公司,..? 型电泳稳压稳流器美国公司,电泳槽美国公司,. 超级纯水器日本公司,水浴摇床、气浴摇床、型电热恒温培养 箱湖北黄石医疗器械厂,加样器法国公司,酒精灯,接种环。 ...实验耗材:各种量度的吸头,.离心管,扩增管美国 公司,玻璃管,玻璃吸管,牙签经过高压。 ...试剂 .... 抽提试剂:购自天根生物技术公司。 ....引物合成:由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,用 前加入 纯水稀释成/。 ....扩增试剂盒: 含染料,购自北京全式金生 物技术有限公司。.... ,购自北京全式 扩增产物纯化试剂: 金生物技术有限公司。 双抗性、快速克隆,包括 ....基因克隆试剂: 克隆载体、.感受态细胞、肉汤培养液、异丙 基硫代半乳糖苷、.溴一氯;哚一.一半乳糖苷、铺好的培养平板、 含氨苄青霉素的液体培养基,购自北京全式金生物技术有限公 司。 ,购自北京 ....高效提取高纯度质粒试剂盒: 全式金生物技术有限公司。 .... 分子量标准: ,分子量为,,,, , 由条线状 宝生物工程大连有限公司。 双链条带组成,分子量为,,,,,,, ,北京全式金生物技术有限公司。 ....琼脂糖:原产西班牙,由上海公司分装. ....其他常用试剂:无水乙醇天津市文达稀贵试剂化工厂,天 津市恒吴化学试剂厂,硼酸天津市光复精细化工研究所,进口分 装, 碱公司进口分装. ...常用溶液的配制:配制溶液所需纯水均用纯水机制造。 ....溴化乙锭:/水溶液,避光保存。 , .... 电泳缓冲液倍贮存液:取碱,硼酸,. 加纯水定容至,用前稀释成.倍应用液。 ...电泳用琼脂糖溶液的配制:均使用.倍溶液配制。 .溶液 .%琼脂糖溶液:.琼脂糖 .溶液 .%琼脂糖溶液:琼脂糖 ..方法 应用自己设计的引物,建立以样本的基因组为模板扩增. 位点.的反应体系,然后进行基因克隆和测序,获得两个等 , 位基因的独立序列,与数据库的已知序列进行比对 若发现存在未知等位基因序列‘,立即在注册,获取注册号,然后 再向 因子命名委员会申报新等位基因,以获得正式新等 位基因命名。 ...重新提取基因组,核酸蛋白测定仪测定浓度及纯度:为., 浓度为. /.,保存备用。 ...设计并合成等位基因扩增引物:遵循引物设计的原则,采用和 引物设计软件自行设计引物,扩增. .,引物长度为个 碱基,扩增目的片段长度 ,设计引物序列如下:正向引物:’. .’:反向引物:’一 .’。 ...等位基因扩增反应体系的建立:按照试剂盒说明,开展预实验, 对基因 组模板浓度为./.的加入量进行摸索,引物进行浓度梯度实验, 从而最终确定优化后的等位基因扩增反应体系。 ....预实验反应体系及循环参数的设定表 表.预实验反应体系 , 循环参数: ??, 个循环;? ?;??保存。....引物浓度梯度实验表 表.引物浓度梯度实验加样格局 ,? 循环参数:?? ;??,。 个循环;?? ;??保存。 电泳检测。 ...扩增产物检测:扩增产物经.%琼脂糖凝胶 ...扩增产物纯化:用纯化试剂盒纯化去除多余的引物和寡核苷 酸片段,纯化后的产物可用于克隆反应。 ...克隆反应体系的建立:按载体公司试剂盒说明 进行连接反应,载体弘,纯化产物】轻轻混合,室温 .感受态细胞中,加 ?.?反应。将连接产物转入 液, 入 ?孵育后,取菌液接种于已涂有, .混合液的平板,?过夜培养。具体克隆过程见图。 ...质粒的增殖培养:准备灭菌玻璃试管,加入预热后的肉汤培养 基 含氨苄青霉素;依据蓝白斑筛选,每个培养皿选择.个白色质粒克 隆,在 原位作好标记,挑取菌落,分别接种于肉汤培养基中,封管,置于 空气浴箱中, ?最大速度振荡培养。~ ????????????????????????????????????????????????一一?? 睁魁体 。群 转化 ?硝老体 ‘筛选 克隆 ???? 图.目的片段的克隆过程 ...转化质粒的提取:转化质粒克隆增殖培养后,培养基底部可见浑 操作说明,吸出上清,沉淀倒入. 浊,按照 离心管中, 离心,吸尽上清;加入重悬缓冲液含 ,振荡悬浮沉淀后加入裂解液,温和上下翻转混合,菌体充分裂解, 形成蓝色透明溶液;加入.中和液,轻混.次,形成紧实的黄色凝块; ,吸出上清加入吸附柱中; 离心 离心,弃流 , 出液;加入洗液, 离心,弃流出液; 离心 去除残存洗液;将吸附柱置于干净离心管中,柱中央加入预热的洗脱液, 静置; 离心,洗脱质粒。 ...转化质粒浓度的测定:核酸检测仪检测,各转化质粒浓度及 纯度。 ...阳性重组子的鉴定:使用引物、,按照设定参数对转化质粒所携带的目的片段进行反应,扩增产物经.%琼脂糖凝胶 电泳,鉴定转化成功后,准备进行测序。 ... 阳性重组子的测序:由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供技 术支持。.结果 与 ..预实验扩增产物电泳图谱见图:扩增片段条带大致齐平,证实为目的片段;电泳条带都宽且亮,似有拖尾现象, 分析可能:模板过量?引物加样量大?循环次数过多下一步准备 调整参数。 ..降低模板用量,引物浓度做个梯度,扩增循环参数降为个循环 周期,扩增结束后电泳结果见图:目的片段条带更加清晰,浓度适中,拖 尾现象减轻,结果较理想。 .. ?位点一 扩增优化反应体系的最终确立表 表.优化的扩增反应体系 加入量 终浓度 反应体系 . ‖ 模板 . 土/ 正向引物 . 上/ 反向引物 × 土 总体积 , , 个循环;? ;? 循环参数:。 ;??保存。 图.预实验扩增产物电泳图谱 、 、 分子量标准是 、 、 、三:基固杰隆盆直茔仝旦班过登堡垄垃毯 勤豳 丞洼医型态堂亟?堂僮金塞 图.引物浓度梯度扩增产物电泳图谱 、 、 、 、 矾河分子量标准是 、 左右, .. 扩增产物电泳检测结果见图:目的片段大小为 的 条带比对后确认。 与分子量 图.优化扩增反应体系后目的片段电泳结果 : .扩增条带 、 、 、 、 分子量标准是 、/ 转化质粒编号浓度/ ..克隆后扩增鉴定阳性重组子,%琼脂糖电泳图谱见图:与 条带比对后确认为阳性重组子。阳性重组子所携带的目 的片段浓度较高,故电泳条带较宽较亮。阳性重组予长度较空载 体增加约 空载体长度 ,电泳后与 条带大致齐平, 电泳位置滞后,速度较慢,进一步证实为阳性重组子见图。 .. 株.阳性克隆,共获得株目的克隆,第株克隆株测序结果 无法判读表。图为年月日/数据库公布的: 与::、::的序列比对结果。株克隆测序结果与已知序列 ::完全一致,证实等位基因的改变在这个等位基因上,该等位基 因第外显子区域有个碱基发生替换,造成个氨基酸的改变,第位, 导致第号密码子编码的氨基酸由酪氨酸组氨酸;第位,三:基国壶 隆筮直皇仝旦些』坐墼丝立毪洼塑 云洼匡型太堂亟?堂焦论室 导致第号密码子编码的氨基酸由丝氨酸丙氨酸砧;第位, 导致第号密码子编码的氨基酸由缬氨酸蛋氨酸 图.转化质粒所携带的目的片段扩增后电泳结果 编号,.:.转化质粒编号; 分子量为,,,, 图.转化质粒电泳结果 编号:.转化质粒编号 分子量为,,,,一一~ ?????????????????????????????????????????一一 表.阳性克隆株结果分析 注:※引物处丢失个碱基;?引物处增加个碱基。 .讨论 .. 分型技术的发展及现状: 年前我国.类分型绝大部分停留在血清学上,由于.基因 分型试剂的开发比.类较为简单,所以.类基因分型已进入大部分 实验室。世纪年代末至年代初,我国开始应用、.、 等做临床移植配型,包括盲配。较早..主要用于 盲配和亚型的研究,比较多的用于.亚型的研究。年代初,. 的发展迅速替代了.和】。年由于中华骨髓 库的发展,流式分型技术也称为液体芯片开始在我国应用,它的 快速和 高通量很快就被各实验室接受,大大提高了我国分型的质量和数 量,为加 快建设我国骨髓库,提高质量提供了技术保证:同时,对加快我国 新等位 基因发现起到了非常重要的作用。 帅:: 》::?一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 扣: ?一??一一一 从 嗍:: :: 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 .: 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 眦 :: :: 一一一一一一一一一一一?一一一十一卜?一 一一卜一 : 一一一一一一一一一一一一?一一一七一一蛾 啪:: 嗍:: 一一一一一一一一一一一一一一一十一一一一一一一一一一 .: 一一一一一一一一一一一一一一一’?一一一一一一一 腻 仳 :: .:: 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 黔: 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一从娜 嗍:: .:: 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一十一一一 附: 一一一一一一一一一一一一一一一一一卜一一一十一一一 从 :: 脚:: 一一一一一十一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 .: 一一一一十一一一一一一一一一一一一一一一一一一一:: ::????一????一 .: 瓜?::,::和:第、外显子核苷酸序列比较参比序列::, 图. 方框标识改变的碱基位置蹦咖序列比对发布于年月日三:基因立 隆盆离望仝至坠企量垒曼;堑笠僮基固 云潼医型太堂亟?堂僮金塞 ,,基因分型检测是建立骨髓库的通用方法【】,而常规分型策 略如:,杂交条,流式荧光微珠法、基因芯片等,均是根据已知的 等位基因来测定的,人群中未知的等位基因通常无法检出【们。 基因测序被称为 分型的金标准,已有报道,血清学结果为空白或和未 能检出或几种分型结果不一致时,均可通过技术获得准确、可靠 的高分辨 结果【之。之所以优于.和,主要在于它能分析包括非 多态性位点在内的整个基因组序列【,但其仍存在模棱两可分型结果。这时需 要用特殊的方法加以区分才能得到确切的序列【】,通常采用序列特异性引物测 序、单倍型测序、克隆测序等方法对可疑标本进行测序分析,确认新的等 位基因。 近两年分子克隆技术在实验室的开展,对特殊情况下的新等位 基因的发现发挥了重要作用。克隆测序分型分为基因组克隆测序及 克隆测序,目前实验室常规采用的克隆测序多为基因组克隆测序。 现今国内克隆测序采用的载体体系主要有: 克隆体系,无需使用含限制酶序列引物,不需纯化产物,不用将 产物作平端处理,不必在扩增产物上加接头,即可直接克隆。 克隆体系,避免了传统限制酶切法先把目的片段切下来再连接到表 达载体上,而导致一些编码非原始蛋白的其它核苷酸也混在其中,影响蛋白表 达和蛋白的功能。 基因组克隆测序可以发现内含子及外显子中的各种碱基突变,但它不 能发现等位基因的不同剪接转录本,即由转录为蛋白质的过程中 发 生的变化