【doc】受体克隆技术与转基因动物在药物筛选中的应用

【doc】受体克隆技术与转基因动物在药物筛选中的应用 受体克隆技术与转基因动物在药物筛选中 的应用 参考文献 1LohoRABenefitsondmbofestrogenrepla~memtherapyAm, Obstett~-ol,1995173:982 2DorenM.SchneiderTheimpactofdifferentHRTregim~tso? compliancefntJFerti2Menopausalstud,19964l(1):29 3CartBPHRTmmagmt:the.Americane~perien~eEur』Ob "(ReprodB/o],I996,64:17 4TikkanenTbemau?ardhortac~ereglaoeraemdaera~: lipid,lipoproteins,coagulationandfihrlnolytcfactors.glaturitas, l996.23(2):209. 5An'tpagmliC,BigliaN,ImnzaMG.aldm?cprogestogerLs oppmethedecreaseofinsuli~llkegrowthfactorIse/uilllevdin ducedhyconjugatedestrogensmpostmenopausalw?e?Maturz- 衄,I994,19【1):25 6vanErpecum,VanBergeHengouwenGPDiffermthopatobil ia~y. effentoforaland1ranemtmdk~inposmaenopausal ?C-astroentemloff3,.I991.】0O:482 7BounaraeauxH.debloerIc*P.[自n1D枷AOralcontraceptiveand of menopausalhormc~ereplacemetlteffects0nherr~xstaslaandri【 velu)/Is1}蚓S…MedV~twnachr.1996.I26 l4I]:l756 8Godsland】F.AngerK.WaIttx~C.口Imsulinresistancesecti~. andelirmnafoninpostraencpamalreplac廿】ttherap2," 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周勇张斌陈国平(重庆州区404000重庆j峡中心医院) ?--—一 R?}/ 摘要目的:介绍受体克隆技术与转基固动物在药物筛选ee的应用.:对近年来 重组受体,转基因动物,基固探针等基因 技术在药物筛选ee的应用加以归纳,综连.结果:受体克隆技术与转基因动物 与药物筛选相结合为人娄发现了许多有新 颖药理作用的先导化合物结论:受克隆技术与转基固动物是新药筛选方法上的革 命. 关键词堑塑堕垒兰斗竺兰!兰兰}圭!苎兰 将重组受体,转基因动物,基因探针等基因工程基本技 术手段应用于药物筛选之中,不仅为人类发现了许多有新颖 药理作用的先导化合物,而且有力地推动了药物筛选方法上 的革命.笔者将近年来国内外受体克隆技术与转基因动物 在药物筛选中的应用作简要综述. 1重组受体与药物筛选 传统的受体制备是从大量的组织匀浆中提取,生物技术 的进步为重组受体技术的产生奠定了基础,它把受体或受体 亚型的基因从人体组织中克隆出来,再在微生物或哺乳动物 细胞内达.重组受体与传统的受体制备技术相比,其优点 很多:?受体是人的而不是动物的,所以用重组受体所得的 试验结果与在人体试验的结果直接相关.?可大量制备受 体,并能得到只在特定组织中存在,用传统制备方法难以获 得的受体.◎用克隆方法可得到纯的受体.?重组受体在 细胞内或细胞膜上.包含了0蛋白等信号转导系统,更接近 人体的自然状态.?重组受体更经济等.重组受体的诸多 优点吸引着越来越多的人们用重组受体进行药物筛选的研 究.成功地建立起了亲代谢答氨酸受体,神经肽Y受体, 654?Chin‰?J,1999OctoberW34NotO 肾上腺索受体亚型等多种重组受体并应用于药物筛选. 抻经细胞通过突触释放化学递质而起作用,L一答氨酸是 哺乳类动物的一种兴奋性递质,它可澈活一系列受体,直接 介导或间接调节突触传递:答氨酸受体的过渡澈活或其它 一 些机制的缺陷会导致病理性功能紊乱.包括癫痫,抻经性 头痛,慢性抻经变性等.各氨酸受体分为2种亚型,即亲离 子(ionotropic)受体亚型和亲代谢(metalzotlopic)受体亚型 (mG【uR).Knopfd等…分离出mGluR的eDNA,再用聚合酶 链式反应(PCR)扩增后在哺乳动物细胞内表达,建立了8种 mGluR.,rr~31uP,s不同的亚型,筛选激动剂和拮抗剂,用已确 定的激动剂和拮抗剂为寻找新的配体=Lin等成功地 克隆并稳定表达了人类mGluR】b受体,与重组mGluRs进行 了药理学特性比较认为稳定表达特定的各氨酸受体亚型可 筛选与各种受体亚型选择性结合的激动剂和拈抗剂.另外, 还有许多人应用重组受体或受体亚型进行药物筛选的尝试 或证明所建立的重组受体的可靠性.D~vies等.把编码人 体内啡肽受体的cDNA插人鼠红白血病细胞(ery- throleukeraiaceu)在3--4周内得到了高效表达的重组受体. 国药学杂志1999年10月第卷第10 用重组的受体亚型进行竞争性试验.以IC为指标,试验结 果表明,与天然受体作用的结果相似,证明了所建立的重组 受体可用于药理学和药物筛选. 目前,制药工业正在从传统动物受体制备向克隆的人体 受体转变.S3maptic制药公司研究了能调节神经系统功能的 肾上腺素受体亚型,含5-I-IT的受体亚型及人类转移因子受 体亚型,并已克隆了许多受体.正用于筛选治疗精神失常及 由神经功能失调引起的其他疾病的药物_4_4.此外,其它一些 重组受体如克隆的人体多巴胺受体亚型,缩胆囊素一B,促 胃酸激素受体,血管紧张素?的I型受体等也已用于药物筛 选并申请了专利.估计此项技术的发展也许还需要10--15 年时间,但已证明克隆的人体受体在药物筛选中是有用的. 2转基因动翱与药物筛选 转基因动物是指用实验方法将外源基因导^染色体基 因组内进行稳定整合,并能遗传给后代的一娄动物.在医学 研究中转基因动物可以"真实"地体现目的基因的括动特征, 将分子水平,细胞水平,整体水平的研究有机地联系起来,可 在不破坏活体原有系统的前提下,对一个或多个因素进行研 究,使问题简化.利用转基因动物可建立敏感动物品系及人 类相同疾病的动物模型用于药物筛选,避免了传统的动物模 型与人类某种症状相似的疾病在致病原因,机制不尽相同的 缺点,其结果准确,经济,试验次数少,大大缩短试验时间,现 已成为人们试图进行药物"快速筛选"的一种手段.目前,已 经培育出较多的转基因动物用于药物筛选研究,并已在抗肿 瘤药物,抗艾滋病病毒药物l5J,抗肝炎病毒药物,肾脏疾病药 物的筛选中取得突破性进展. 多药耐药性是肿瘤有效治疗的一大障碍.由人体多药 耐药性(mulfidrug-resistance,mdr-1)基因编码表达的能量依 较性药物排出泵,能泵出有效天然细胞毒药物,如柔红霉素, 长春碱,长春新碱,放线菌素D,紫杉醇等,这一转运系统称 之为多药转运系统(或P'糖蛋白),肿瘤细胞以这种方式引起 的对抗肿瘤药物的耐药性称之为多药耐药性.药理研究着 眼于抑制多药转运蛋白以促进现有的人类肿瘤的化疗,但由 于缺乏有效的动物模型而延缓了药物研究的进展.Miekiseh 等应用重组DNA技术建立了多药耐药转基因鼠,使mdr-1 基因在实验动物骨髓细胞中表达,在其膜表面产生多药转运 蛋白,然后测定转基因能否保护骨髓细胞免受化疗的损害, 作为鉴定动物模型是否可靠的指标.试验表明,利用多药耐 药转基因动物模型可做到:?判断一个新的化疗药的骨髓 毒性.?对具有骨髓毒性的新药用大剂量来揭示其它器官 的损害,而这往往被忽视.?筛选那些不被多药转运蛋白作 用的新的化疗制剂.随着癌基因的不断发现,越来越多的肿 瘤疾病模型被用于药物筛选.如Porter等:建立了?只 wap-ras转基因鼠,并发展成4种实体瘤模型,可用于筛选紫 杉醇及其它影响微管蛋白聚台的抗肿瘤化台物. 转基因动物是当今分子药理学研究的重要手段,是作为 疾病模型用于药物筛选的一种重要工具但仍存在一些问 题,如选择的实验动物的种属差异性,性别不均衡,转基因产 国药学杂志1999年10月第34卷第10 物并不一定能长期表达,目的基因能否准确地定位于等位基 因上等技术问题..另外,建立转基因动物模型需明确疾病 的基因遗传背景和克隆表达.现常用的微量注射法及胚胎 干细胞法各有优缺点,故有人设想,是否能将这两种方法结 合起来,产生更多的实驻模型,如早老性痴呆,帕金森病等. 3基因探针技术与药翱筛选 所谓基因探针是指能识别特异碱基顺序的有标记的单 链DNA(或RNA)分子片段.也可以说是一段被测定的核苷 酸顺序互补的带标记的单链核苷酸.将其与被检测的基因 中的同源互补序列杂交,从而检测出所要查明的基因释之为 基因探针技术J.目前,人们已尝试将此技术应用于新药筛 选中.研究发现,红霉素,四环素,利福霉素,两性霉素,阿霉 素等重要抗生素均作用于多聚乙酰(potyketide)生物合成途 径.在同样作用于这一生物合成途径的放线紫红素(acti— ncchodin)的生物合成基因族完全搞清后.以actI,act]~等基 因片段作为探针,应用DNA-DNA同源杂交技术(Southea~l 印迹法)直接筛选一些产生作用于多聚己酰途径的新抗生素 产生菌的方法亦已建立. 4其它 应用基因重组工程菌——大肠肝菌来表达真核生物大 鼠的DNA聚合酶卢已获成功,这为大量筛选DNA聚台酶抑 制提供了充足的靶酶:最近还报道了利用PCR技术来筛选 作用于DNA结构的微生物药物的新的筛选方法. 虽然我国利用基因工程技术筛选药物起步较晚,但近年 已取得鼓舞人心的进展,如上海医药工业研究院应用基因重 组技术,建立了酵母双杂交系统,用以筛选对胰岛素不敏感 的糖尿病的新药. 参考文献 1KfdT,KuhnR,Al~derHMetabotropicg[utattmtereceptors} r~ve[1algetsfordragdevdc@mentMed1995,38(9)} L417 2LinFF,VameyM,Saca~AI,eta1.ClorfngandstabieDre蚰 ofthe功GlLlbsubtypeofh?T帅metabot~picoeptorsandphar rnac01ocoompan9.fIjfhthemGluRssubtype.Neuro~arma ?gy,1997.36(7):917. 3DaviesA,WhitingEBathC,础a2Theapp[icatic0aofthe]roman beta-glc~ingenefocusccmtro[regionandmtmneerythroleukeraia cd[systemtotheandp}IalT【Iaccharacteaazza6c~ ofhumanendothdinreoeptorsubtypesJPharmacolTazical M~thods,1995.33(3):153. 4Sedlak目sig,~?tI.ntechnologyhrmsfrednonuc molecularbuttonsGenelEng,1996,16(1):8 5MehtaliM,MunschyM,All—HadjiD.alAnodtr'ma~genic mottserooddfortheinz硼evahmtlonofi—htmaanhaamunodefl, ci~ney,tintstype1drugs.AIDS脑HumR1992.8 (t2):1959 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