免疫组织化学技术

免疫组织化学技术 一、实验目的 免疫组织化学技术是组织学中的常规实验技术，能够敏感的检测出标本中的抗原，对标本中的目的抗原进行定性、定位检测。通过学习免疫组织化学染色技术，熟练的运用到实验中去。 二、实验原理 1、免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)是利用抗原抗体反应进行的检测方法，及应用标记号的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物(如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。 2、内源性过氧化物酶的灭活:在免疫组化染色中，若采用过氧化物酶检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理，如果不处理，组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC其反应而造成假阳性，可能干扰染色结果。 3、血清封闭:一般在加一抗之前使用封闭血清，血清种属的选择一般与二抗的种属相同，可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清，也可以免去此步骤。 4、抗原修复:是否进行抗原修复和所用方法并无太大关系，主要取决于切片类型，石蜡切片中，组织经甲醛固定后，蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联，抗原修复的目的就是打开醛键，羧甲键，或者是解开蛋白交联，因为这些原因可能导致抗原决定簇封闭。如果不进行抗原修复，抗原部位难以暴露，而其他固定剂固定的组织也就不存在这样的问题，自然没必要进行抗原修复。 三、实验材料和试剂: 1、仪器设备 微波炉、恒温箱、冰箱、微量加样器、湿盒、切片架、微波修复盒、染缸 2、试剂: ?PBS缓冲液(pH=7.2-7.6):NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L. ?0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH=6.0，1000ml):柠檬酸三钠 3g，柠檬酸0.4g。 ?1mol/L的TBS缓冲液(pH=8.0):在800ml水中溶解121gTris碱，用1mol/L的HCl调至pH=8.0，加水至1000ml. ?3%H2O2溶液:用30%H2O2溶液稀释配置。 ?封片剂:中性树胶。 四、实验步骤 主要介绍SABC法 1、 脱蜡和水化: 脱蜡前60?恒温箱中烘烤60min ? 二甲苯?:10min; ? 二甲苯?:10min; ? 无水乙醇:5min; ? 95%乙醇:5min; ? 80%乙醇:5min; ? 70%乙醇:5min; 2、 SABC免疫组织化学染色: ? PBS洗两次各5min; ? 用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10min，蒸馏水洗3次; ? 抗原修复:微波90-95?30min，自然冷却;PBS洗5min; ? 滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体; ? 滴加一抗，室温1h或者4?过夜或37?1h;PBS洗三次，每次2min; ? 滴加生物素化二抗，20-37?，20min;PBS洗三次，每次2min; ? 滴加试剂SABC，20-37?，20min;PBS洗四次，每次5min; ? DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度); ? 蒸馏水洗。苏木精复染2min，盐酸乙醇分化，自来水返蓝; ? 脱水、透明、封片、镜检。 五、实验结果分析: 1、抗原阳性结果 2、抗原的定位 3、阳性细胞组织学分布 4、阳性标记强度特征