细菌分解葡萄糖,乳糖产酸产气使斜面与底层均呈黄色(酚红指示剂

细菌分解葡萄糖,乳糖产酸产气使斜面与底层均呈黄色(酚红指示剂 1 课程名称微生物学检验技术 授课专业医学检验 学时2学时 实验十二 大肠埃希菌、产气杆菌检验 一、实验目的 1.掌握E.coli、产气杆菌的分离培养与鉴定方法 2.掌握E.coli、产气杆菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及鉴定依据。 二、实验器材与试剂 1.菌种 普通E.coli、产气杆菌 2.培养基SS中国兰KIAMIU蛋白胨葡萄糖蛋白胨水枸橼酸盐琼脂斜面 硝酸盐 culture media 3.试剂 20尿素 0.4酚红水溶液 1中国兰水溶液20乳糖水溶液 1玫瑰红酸酒精液1溴麝香草酚兰酒精溶液 靛基质试剂 甲基红试剂 VP试剂40KOH肌酸溶液 氧化酶试剂与纸片3过氧化氢 4.革兰染液擦镜纸电吹风显微镜恒温箱 三、实验内容 一 标本的采集 肠道细菌感染可采集粪便肠道外感染可根据临床感染情况采集中断尿液血液脓汁胆汁脑脊液痰分泌物水等。 二检验程序 E.coli、产气杆菌 接种 SS中国兰KIAMIU蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水 枸橼酸盐琼脂斜面硝酸盐 culture media 37? 24h 观察分析结果 吲哚试验 VP试验 甲基红试验 GS 2 结果 三培养基的制备Producting culture media: 1.SS culture mediaSamonella-Shigella培养基 重点 ?成分 ?营养物示胨蛋白质牛肉膏 ?抑制物煌绿胆盐硫代硫酸钠枸橼酸钠抑制非病原菌生长 ?促进剂胆碱盐 促进病原菌生长 ?鉴别用糖乳糖 ?指示剂中性红酸红碱黄 ?原理 能利用乳糖的细菌产酸使指示剂变红色枸橼酸铁能使产H2s的菌落中心呈黑色硫代硫酸钠有缓和胆盐对痢疾杆菌沙门菌的有害作用并能中和煌绿和中性红的毒性 ?用途 是一种强选择culture media 用来分离肠道致病菌 用附现在Ssagar一般使用成品只要按一定的量加入蒸馏水即可无需调PH值无需灭菌 ?中国兰 culture media 弱选择culture media ?成分 普通ager 100ml 乳糖20水溶液 1g5ml 1中国兰水溶液 2ml 1玫瑰红酸乙醇液 1ml 配好后culture media呈淡红色 ?原理 玫瑰红酸能抑制G菌的生长。因其是酒精配制无需灭菌但加时应避免开火焰。 能分解乳糖的细菌产糖菌落呈蓝色不分解乳糖细菌呈淡紫红色。 中国兰与玫瑰红酸的变色范围如下 指示剂 酸性 碱性 3 中国红 蓝色 微蓝至无 玫瑰红酸 黄色 红色 ?用途 分离肠道致病菌用 ?KIA culture media双糖铁培养基重点、难点 ?成分 蛋白胨 FeSO4 NaCl 硫代硫酸钠 葡萄糖1g agar 乳糖10g 0.4酚红 牛肉膏水 附现一般使用成品0.7kg 15min 高压灭菌。制成斜面培养基 ?原理 ?葡萄糖乳糖的分解 细菌分解葡萄糖乳糖产酸产气使斜面与底层钧成黄色酚红指示剂变色范围酸黄碱红具有气泡。若细菌分解葡萄糖而不分解乳糖分解乳糖产酸使culture media的PH下降因此斜面和底面均成黄色但葡萄糖含量较少葡萄糖乳糖110所产生的酸可因接触空气而氧化并因细菌生长繁殖利用含氧物质生成碱性化合物使斜面部分又变成红色底层由于处于缺氧状态细菌分解葡萄糖所生成的酸一时不被氧化而保持黄色。 ?细菌产H2S可与culture media内的FeSO4作用形成黑色的沉淀。 ?硫代硫酸钠是防止FeSO4被氧化。 3用途: 鉴别肠道杆菌用 ?MIU culture media 动力-靛基质-尿素酶培养基 1成分实验指导160页 蛋白胨 10g agar 2g 水 1000ml Nacl 5g KH2PO4 2g 葡萄糖 1g 20尿素 100ml 0.4酚红水溶液 2ml 调PH为7.0 68.95kpa高压灭菌15分钟尿素与酚红高压灭菌后加入 2原理 此培养基制成半固体可观察细菌的动力蛋白胨中有色氨酸可做靛基质试 4 验原理后述产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产氨使酚红指示剂显红色。 ?用途 同时可观察细菌动力 靛基质的产生细菌分解尿素的活性 ?硝酸盐 culture media ?成分 蛋白胨:1克 硝酸钾:0.1克 水:100ml PH:7.4-7.6 ?原理 有些细菌还原硝酸盐为亚硝酸盐亚硝酸盐可与醋酸作用生成亚硝酸再与试剂中的对氨基苯磺酸 作用生成重氮苯磺酸再与α-萘胺结合生成红色的N-α 萘胺偶氮苯磺酸 ?用途: 硝酸盐还原试验用 ?蛋白胨水培养基 ?成分 蛋白胨胰蛋白胨 20克 Nacl 5g 蒸馏水 1000ml 调PH至7.4 ?原理 细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质和对位二甲基氨基苯甲醛后有玫瑰红化合物生成 3用途 靛基质试验用indole ?枸橼酸盐culture media ?成分 Nacl 5g agar 20g 蒸馏水 1000ml MgSO4 0.2g NH4H2PO4 1g KH2PO4 1g 5 枸橼酸钠 5g 1溴麝香草酚兰酒精溶液:10ml 调PH至6.8此培养基不加agar为枸橼酸盐液体培养基 制成斜面culture media ?原理 枸橼酸盐培养基中枸橼酸钠为碳的唯一来源而NH4H2PO4是唯一来源。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源因此能在其生长并且分解枸橼酸盐产生碳酸盐使培养基变碱指示剂有绿色变为深兰色阴性不生长、不变色 ?用途 枸橼酸盐利用实验用citrate ?葡萄糖蛋白胨水培养基 ?成分: 蛋白胨 0.5g 葡萄糖 0.5g K2HPO4 0.5g 蒸馏水 100ml 调PH至7.2 ?原理 甲基红试验 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸等使培养基的PH降低到4.4以下甲基红显红色 阳性代表菌株:大肠杆菌 VP实验 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸再将其脱羧形成乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰二乙酰与培养基蛋白胨中精AA等所含的胍基化合物结合生成红色化合物在培养基中加入胍基化合物如肌酸、肌肝等可加速此反应。 阳性代表菌株:产气杆菌 ?用途 甲基红试验VP试验用 四、实验安排 6 一制备培养基贴上标签 第一台SS平板16个 葡萄糖蛋白胨水32支 第二台中国兰平板:16个 蛋白胨水 16支 枸橼酸盐琼脂斜面16支 第三台KIA 16支 MIU16支 硝酸盐16支 二接种安排 ?每两人领有SS平板中国兰平板各1个葡萄糖蛋白胨水2支 蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂斜面、KIA、 MIU 、硝酸盐各1支共8种培养基。 ?四人一大组2人一小组分别接种大肠杆菌和产气杆菌。 ?KIA与枸橼酸盐琼脂斜面用琼脂斜面接种法具体方法如下示教 用接种针挑取单个菌落插入斜面正中垂直插入底部抽出后在斜面上做蛇形划线即可。 五、实验结果 一菌落观察 ?SS平板 大多不生长少数生长者分解乳糖产酸通过中性红指示剂菌落呈红色同时与胆盐结合成胆酸而发生沉淀故菌落中心混浊 大肠杆菌中等大小圆形凸起边缘整齐光滑湿润不透明的红色菌落 产气杆菌同大肠杆菌 ?中国兰平板 大肠杆菌圆形凸起边缘整齐光滑湿润不透明的蓝色大菌落 产气杆菌圆形凸起边缘整齐光滑湿润不透明的蓝色大菌落 二生化反应 KIA MIU 斜面 底层 产气 硫化氢 M U 大肠杆菌A A /- — — 产气杆菌A A /- — —- 7 I M VP C 大肠杆菌 — — 产气杆菌 — — 三形态观察GS 革兰阴性 中等大小杆菌 两端钝圆多呈单个分散存在 六、实验报告 写出大肠杆菌、产气杆菌在SS中国兰平板上的菌落特征革兰染色结果及各种生化反应结果。 七、实验准备 SS培养基 15ml/2人 普通培养基 15ml/2人 KIA 3 ml/2人 MIU 2ml/2人 蛋白胨 2ml/2人 葡萄糖蛋白胨 2ml/人 枸橼酸盐琼脂 3ml/2人 硝酸盐培养基 2ml/2人 1中国兰水溶液 2瓶 1玫瑰红酸酒精液 2瓶 20乳糖水溶液 2瓶 20葡萄糖水溶液 2瓶 20尿素 2瓶 0.4酚红水溶液 2瓶 1溴麝香草酚兰酒精溶液 2瓶 中号平板 1个/人 中号试管 1支/人 小号试管 5支/2/人 5ml无菌吸管 1筒/教室 1ml无菌吸管 1筒/教室 8 斜面板: 2个/教室 靛基质试剂 3瓶/教室 甲基红试剂 3瓶/教室 VP试剂40KOH肌酸溶液3瓶/教室 氧化酶试剂与纸片 2瓶/教室 3过氧化氢 3管/教室 玻片 2张/人 硝酸盐还原试剂 1套/教室 镊子 3把/教室 八、实验 1.VP实验的培养物按每ml加0.1ml40的KOH肌酸溶液放臵50度水浴2小时或37度孵育4小时充分摇动观察结果。40的KOH肌酸溶液的量可以多一 些水浴的结果更好观察。 2.进一部强调革兰染色的操作。 3.详述各种生化试验的原理。 附一甲基红试剂的配臵 甲基红 0.02g 95酒精 60ml 蒸馏水 40ml 将甲基红研磨溶解于酒精中再加水即可 附二硝酸盐还原试验试剂配臵 9 甲液对氨基苯磺酸0.8g 溶于5molL醋酸100ml 乙液α-萘胺 0.5g 溶于5molL醋酸100ml 附三靛基质试剂的配臵 对位二甲基氨基苯甲醛 5g 95酒精 150ml 浓盐酸AR 50ml 先将对位二甲基氨基苯甲醛溶于酒精中再徐徐加入浓盐酸即可若酒精用丁醇或戊醇来代替更好 10