丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用(4)

丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用(4) 实验六 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用（4） 一、目的： 掌握竞争性抑制的概念。了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。 二、原理： 抑制剂在化学结构上与作用物类似，能与作用物竞争酶分子的活性中心并与之结合，从而抑制酶的活 性，升高其Km值。抑制程度取决于抑制剂与作用物浓度的相对比例。其作用物浓度不变，则抑制程度随 抑制剂浓度增加而增加。反之，若抑制剂浓度不变，则抑制程度随作用物浓度增加而减弱，最终Vm不变。这种由于相互竞争而引起的抑制作用，称竞争性抑制。 琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在隔绝空气的条件下，利用甲烯兰接受氢后褪色的速度 来判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性抑制的程度。 三、器材： 1.15×150mm试管及试管架 2.恒温水浴箱 3.纱布或棉花 4.小烧杯 5.小量筒 6.剪刀、镊子、磁盘 7.研钵 8.冰 四、试剂： 1. 0.2M/L、0.02M/L琥珀酸溶液 2. 0.2M/L、0.02 M/L丙二酸溶液 3. 0.1M/LpH7.4磷酸盐溶液 4. 0.02%甲烯兰溶液 5. 液体石蜡 四、操作： 1.肌肉提取液的制备 用重物猛击大鼠或家兔的头部使昏迷，剪颈放血杀死后，取约3～5克肌肉剪成小块，置烧杯中用冰冷的蒸馏水洗三次，目的是洗去肌肉中一些可溶物质和其它还原性物质。再用冰冷的 0.1M/LpH7.4磷酸盐缓冲液洗涤一次，弃去液体，将肌肉小块移入四周装有冰块的研钵内，研碎。然后按 1克肌肉加入两倍容积的冰冻0.1M/LpH7.4磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布或少许棉花过滤，取滤液置 冰浴中备用。 2.取8支试管，编号，按下表添加试剂。 试 剂 管 号 （滴） 1 2 3 4 5 6 7 8 肌肉提取液 30 30 30 30 - 30 30 - 0.2M/L琥珀酸 10 10 10 - 10 - - - 0.02M/L琥珀酸 - - - 10 - 10 10 10 0.2M/L丙二酸 - 10 - 10 - - - - 0.02M/L丙二酸 - - 10 - - 10 - - 蒸 馏 水 10 - - - 40 - 10 10 甲 烯 兰 4 4 4 4 4 4 4 4 3.将各管摇匀，于溶液上滴加一层石蜡油，以隔绝空气。再放置37?水浴中保温，随时比较观察，各管甲烯兰褪色情况，哪管快而比较彻底？并原因。 1 实验七 生物氧化（3） 一、生物氧化中氧化酶的显现 原理 马铃薯浸液中有酚氧化酶，单酚氧化酶能促进酚、二酚、多酚被氧化成醌。 操作 1.取马铃薯一个，洗净后轻轻刮去外皮，称取10克，置研钵中。加入少量石英砂研碎之。 2.加入蒸馏水20毫升稀释后，以棉花过滤至一小烧杯中。 3.取试管二支，标以号码，每管加滤液5毫升，第一管煮沸后冷却之，两管各加磷酸缓冲液0.5毫升 （pH=6）及0.5毫升新鲜的0.2%邻苯而酚溶液。（邻苯二酚）。 4.两管均匀充分摇数分钟，静置30分钟，观察颜色变化。 试剂与器材 1.试剂： （1）pH=6的磷酸缓冲液 （2）0.2%的邻苯二酚 （3）石英砂 （4）马铃薯 2.器材 （1）试管 （2）研钵 （3）漏斗 二、需氧脱氢酶（脱氢酶的显现） 原理： 牛乳中含有催化醛脱氢生成酸的醛脱氢酶，又称夏丁格酶。当于无氧条件下进行，可用甲稀蓝代替氧 作受氢体，借氧化型的蓝色甲稀蓝转变为还原型的无色甲稀蓝，以观察反应的进行。 操作： 1. 取试管二支，标以号码，各加入2毫升生牛奶。 2. 第一管在沸水浴上加热一分钟。 3. 二管各加5滴甲稀蓝溶液（0.01%）。 4. 用吸管向管中加入1毫升0.5%中性乙醛溶液。 5. 二管各加入液体石腊0.5毫升，置于70?水浴中记录退色时间。 试剂与器材 1. 试剂： （1）0.5%中性乙醛溶液 （2）0.01%甲稀蓝 （3）液体石腊油 （4）生牛奶 2.器材： （1）试管 （2）水浴 三、过氧化物酶的定性反应 过氧化物酶能催化过氧化氢对某些物质的氧化。过氧化物酶的特异性不甚严格，各种多酚或芳香族胺 均可在此酶作用下，被过氧化氢氧化。愈创木脂中的愈创木酸可被氧化成为蓝色愈创木酸臭氧化物，焦性 没食子酸（邻苯三酚[C H（OH）]）则被氧化生成橙红色的焦没食橙沉淀。 633 氧化物酶广泛存在于植物组织中。 操作 1.加白菜提取液约5毫升于试管内，煮沸2—3分钟后，冷却之。 取4支标有号码的试管，各加1%焦性没食子酸溶液约3毫升。第一试管，加2%过氧化氢2滴及蒸馏 2 水2毫升。第二试管，加白菜提取液2毫升。第三试管，加2%过氧化氢2滴及白菜提取液2毫升。第四试管，加2%过氧化氢2滴及煮过的白菜提取液2毫升。摇匀后，观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现。 2.取试管2支，各加愈创木脂溶液及2%过氧化氢溶液各0.5毫升。并分别加入白菜提取液和煮过的白菜提取液各几滴。观察并记录结果。 试剂与器材 1.试剂： （1）1%焦性没食子酸水溶液 （2）2%过氧化氢溶液 （3）白菜提取液 （4）愈创木脂酒精溶液 2.器材： （1）试管及试管架 （2）2和5毫升吸量管 实验八 发酵过程中无机磷的利用（4） 一、目的： 1.掌握定磷法的原理和操作技术。 2.了解发酵过程中无机磷的作用。 二、原理： 酵母能使蔗糖和葡萄糖发酵发产生乙醇和二氧化碳。此发酵作用和酵解作用的中间步骤基本相同。在 酵母体内蔗糖先经蔗糖酶水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖在发酵过程中再经磷酸化作用和其他反应生 成各种磷酸酯。 本实验利用无机磷与钼酸形成的磷钼酸络合物能被还原剂α-1，2，4—氨基萘酚磺酸钠还原成钼蓝的原理来测定发酵前后反应混合物中无机磷的含量，用以观察发酵过程中无机磷的消耗。 三、器材： 1.试管及试管架 2.乳钵 3.吸管 4.小漏斗 5.滤纸 6. 恒温水浴 7.分光光度计 8.锥形瓶 四、试剂与材料 1.酵母 2.蔗糖 3.磷酸盐溶液 4.磷酸盐溶液 5.5%三氯醋酸溶液 6. 6N硫酸和2.5%钼酸铵等体积混合液 7.α—1，2，4—氨基萘酚磺酸滤液：将0.25克α-1，2，4—氨基萘酚磺酸，15克亚硫酸氢钠及0.5 克亚硫酸钠溶于100毫升蒸馏水中。使用前，加水3份混合均匀。 五、操作方法： 1.标准曲线的制定： 按下表次序在各管内加入不同量的标准磷酸盐溶液和试剂，充分摇匀后于37?水浴中保温10分钟。 冷后，在660毫微米波长下测定光吸收值，以含磷总量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 3 标 准 磷 钼酸铵一 α-1，2，4氨管 含磷量蒸馏水660nm光酸盐溶液 硫酸混合 基萘酚磺酸钠37? 号 （微克） （毫升） 吸收值 （毫升） 液（毫升） 溶液（毫升） 水浴 1 0 0 3.0 2.5 0.5 保温 2 0.2 5 2.8 2.5 0.5 十分 钟后 3 0.4 10 2.6 2.5 0.5 冷却 4 0.6 15 2.4 2.5 0.5 至室温 5 0.8 20 2.2 2.5 0.5 6 1.0 25 2.0 2.5 0.5 2.酵母发酵: 称取2-4克新鲜啤酒酵母和1克蔗糖，放入研钵内仔细研碎。加入5毫升蒸馏水和5毫升磷酸盐溶液研磨均匀。将匀浆转移至50毫升锥形瓶中并立即取出0.5毫升均匀的悬浮液，加入到已盛有3.5毫升三氯乙酸溶液的试管中，摇匀，作为试样1。将锥形瓶放入37?恒温水浴中，每隔30分钟取出0.5毫升悬浮液，立即加入到已盛有3.5毫升三氯乙酸溶液的试管中，摇匀。共取三次作为试样2，3，4。将每个试样静置10分钟后用干滤纸过滤以分别取得各试样的无蛋白滤液。注意在每次吸取悬浮液前，将锥形瓶中的混合物 充分摇匀。 3.无机磷的测定： 取5支洁净干燥的试管。编号后按下表加入各种溶液并按标准曲线制定的同样方法操作，分别测定各 管660nm的光吸收值，各管均应作一平行管，取其光吸收的平均值，从标准曲线上查出各试样的无机磷含 量，以试样1的无机磷含量为100%，计算酵母发酵30、60和90分钟后消耗无机磷的相对百分数。 钼酸铵—α—1,2,4—管 发酵时无蛋白滤 液 蒸馏水660nm光37? 硫酸溶液氨基萘酚磺号 间（分） （毫升） （毫升） 吸收值 保温（毫升） 酸钠（毫升） 十分0.1(试样1) 1 0 2.9 2.5 0.5 钟后0.1(试样2) 2 30 2.9 2.5 0.5 冷却0.1(试样3) 3 60 2.9 2.5 0.5 至室 0.1(试样4) 4 90 2.9 2.5 0.5 温 5 - - 3.0 2.5 0.5 实验九 血糖的测定（3） 一、原理 2+葡萄糖的醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热后，被氧化成羧基，而碱性铜试剂中的二价铜（Cu） 则被还原成红黄色的氧化亚铜（CuO）沉淀。氧化亚铜又可使磷钼酸还原，生成钼蓝，使溶液呈蓝色，其2 蓝色的深度与血滤液中葡萄糖的浓度成正比。可用比色法于620毫微米下测定之。 测定血糖含量时必须先除去其中的蛋白质，制成无蛋白滤液，再行检验。向抗凝血（如加入草酸钾的 血液）中加入钨酸钠、硫酸锌、氢氧化锌及三氯乙酸等均可制得无蛋白滤液，现常用钨酸法。钨酸钠与硫 酸作用，生成钨酸，可使血红蛋白等凝固、沉淀，离心或过滤除去沉淀，即得无蛋白滤液，此种滤液还适 用于测定非蛋白氮、肌酸和尿酸等。 NaWO+HSO?HWO+NaSO 24242424 钨酸钠 钨酸 二、操作方法 1.用钨酸法制备1：10全血无蛋白滤液 4 用奥式吸量管吸取1毫升混匀的抗凝血（2克草酸钾/升血液），擦去管外血液，将管插到25毫升锥形瓶的瓶底，缓慢地放出血液，勿使血液粘附于吸量管管壁。 加入7毫升蒸馏水，充分混匀，使完全溶血后，再加入2/3N硫酸1毫升，随加随摇，再加入1毫升10%钨酸钠溶液，随加随摇。加完后充分摇匀，放置5—10分钟，待沉淀，由鲜红色变为暗棕色，即用优 +质不含氮的干滤纸过滤或离心，除去沉淀。如滤液不清，需重滤。过滤时在漏斗上盖一表面皿，减少Cu与空气的接触。如此制得的无蛋白滤液每毫升相当于1/10毫升全血。 2.测定血糖 取3支具有25毫升刻度的血糖管编号，然后在血糖管中按下表进行操作： 血糖管 空白 标准 样品 试 剂 无蛋白滤液（毫升） — — 1.0 蒸馏水（毫升） 2.0 1.0 1.0 葡萄糖标准液（应用液）（毫升） — — 1.0 碱性铜试剂（毫升） 2.0 2.0 2.0 混合，置沸水浴中8分钟，于流动冷水中冷却三分钟（勿摇动） 磷钼酸试剂（毫升） 2.0 2.0 2.0 混匀，放置2分钟。（使二氧化碳气体逸出） 以1：4磷钼酸试剂稀释液加至（毫升） 25 25 25 再于72型分光光度计上，在620—640毫微米波长下，迅速比色。 三、计算： O.D(样品) C(标准) 样品的血糖毫克%= × ×100 O.D(标准) V(样品) 式中:V应由所取血滤液体积折算为所取全血的体积0.1毫升，C为0.1毫克/毫升。 （样品）（标准） 试剂和器材 1.试剂： O.D（样品） 即：样品的血糖毫克%= ×100% （1）草酸钾粉末（A.R）。 O.D（标准） （2）10%钨酸钠溶液。此溶液应为中性或弱碱性，否则蛋白沉淀不完全。其校正方法是取此溶液10毫升，加入0.1N硫酸溶液0.4毫升，再加入1%酚酞1滴，溶液应呈粉红色。若呈紫红色，可加入0.1N硫酸溶液，若呈黄色，需加入0.1N氢氧化钠溶液，直到出现不褪色的粉红色的中性反应为止。计算出应加的酸或碱的量。 （3）2/3N硫酸溶液。 （4）葡萄糖标准液： 贮存液：称取1000克恒重过的葡萄糖（A.R），溶于水，稀释到100毫升，其浓度为10克/毫升。 应用液：取1毫升贮存液置于100毫升容量瓶中，用苯甲酸稀释到刻度。浓度为0.1克/毫升。 （5）碱性铜试剂：在400毫升水中加入40克无水碳酸钠；在300毫升水中加入7.5克酒石酸，在200毫升水中加入4.5克硫酸铜结晶，分别加热使溶解，冷却后将酒石酸溶液倾入碳酸钠溶液中，混合移入到 1000毫升容量瓶中，再将硫酸铜溶液倾入并加水至刻度。此试剂可于室温下长期保存。 5 3 赖氨酸是一种必须氨基酸，研究表明：成人每天食用高赖氨酸含量的玉米粉300克，即可维持人体的氮素平衡。所以，培育高赖氨酸含量的玉米品种，提高玉米的应养价值具有重要的意义。在这种工作中， 首先必须解决赖氨酸含量的测定方法，本实验采用比色法测定玉米中的赖氨酸含量 蛋白质中的赖氨酸具有一个ε－NH，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，其颜色的深浅在一定范围内2 与赖氨酸的含量成线性关系。 亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有一个氨基（α－NH,相当于蛋白质中赖氨酸残基上的ε2－NH因而可以用量氨酸作标准进行比较. 2, 三.仪器与试剂: 1. 仪器 ? 721型分光光度计 ? 分析天平 ? 恒温水浴 ? 康氏震荡器 ? 具塞试管×8 ? 具塞三角瓶:250毫升×1 ? 漏斗 ? 容量瓶:100毫升×1,1000毫升×1 ? 刻度吸管:1毫升×3,2毫升×1 2. 试剂： ?0.2M柠檬酸缓冲液(pH5.0):称取2.10克柠檬酸和2.94克柠檬酸三钠,溶解于蒸馏水中,调pH至5.0。 ?茚三酮试剂：称1克茚三酮溶于25毫克95%乙醇中。称40毫克二氯化锡溶于25毫升柠檬酸缓冲液中，将两种混合液摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱保存备用。 ?0.02N盐酸：取12 N盐酸1.8毫升，用蒸馏水稀释定容至1000毫升。 ?亮氨酸标准液：准确称取5毫克亮氨酸，加数滴0.02N盐酸使溶，然后用蒸馏水稀释定容到100毫 升，则得浓度为50μg/ml的标准溶液。 ?50%乙醇液 四、操作步骤： 1．标准曲线的制作： 取七支带塞试管编号，按下表添加试剂： 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 亮氨酸标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （ml） 加蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 亮氨酸浓度（μ0 5 10 20 30 40 50 g/ml） 再向以上每支试管内加1毫升茚三酮试剂，摇匀后塞紧管塞，置沸水浴加热5分钟，用冷水冷却试管 6 至室温；再向每支试管内加50%乙醇8毫升，混合后用1厘米比色杯在530nm处测光密度；以所得值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标绘制出标准曲线。 2．样品的测定： 称取100毫克已粉碎脱脂的玉米样品于250毫升的带塞三角瓶中，再加300毫克石英砂和50毫升蒸馏水，在室温下置于震荡器上震荡20分钟，然后过滤，取1毫升滤液于带塞试管中，以后操作同标准曲线 相同。 从标准曲线上查得值（微克 ） 样品中赖氨酸的含量（%）=样液稀释倍数× 样品重（毫克） × -3 10×100 由于亮氨酸与赖氨酸的分子量不同，故用亮氨酸标准曲线计算赖氨酸时，需乘以校正系数1.1515，同时还应从最后的计算结果中减去游离的氨基酸含量。各种作物种子中游离氨基酸的含量是：玉米0.1%；小麦0.05%；水稻0.01%。 豆丁致力于构建全球领先的文档发布与销售平台，面向世界范围提供便捷、安全、专业、有效的文档营销服务。 包括中国、日本、韩国、北美、欧洲等在内的豆丁全球分站，将面向全球各地的文档拥有者和代理商提供服务， 帮助他们把文档发行到世界的每一个角落。豆丁正在全球各地建立便捷、安全、高效的支付与兑换渠道，为每一 位用户提供优质的文档交易和账务服务。 7