高糖对视网膜色素上皮细胞TLR2 表达的影响

高糖对视网膜色素上皮细胞TLR2 表达的影响 编号 201109136 刊用形式 论著 高糖对视网膜色素上皮细胞TLR2表达的影响 陈雪梅，张学东，宗元娟，沈 强 (400016重庆，重庆医科大学附属第一医院眼科，眼科学重庆市市级重点实验室) [摘要] 目的 观察高糖对体外培养的ARPE-19细胞TOLL样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)表达的影响及机 制。方法 各组ARPE-19(RPE细胞系)细胞分别刺激48h，正常糖浓度组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、中度高糖组(15.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(25.5 mmol/L D-葡萄糖)、PKC-α抑制剂组(25.5 mmol/L D-葡萄糖加10 mmol/L Go6976 PKC-α抑制剂)、高渗对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖加20 mmol/L甘露醇)。Western Blot检测各组ARPE-19细胞TLR2 蛋白表达水平，以及PKC-α蛋白胞浆向胞膜的转位情况;Real-Time PCR分析各组ARPE-19细胞TLR2的mRNA表达水平。 结果 与正常糖浓度组相比，高糖组和中度高糖组TLR2的mRNA和蛋白表达，以及PKC-α转位均增加(P<0.05)，并且 高糖组高于中度高糖组(P<0.05)。与高糖组比较，PKC-α抑制剂组的TLR2蛋白表达降低(P<0.05),PKC-α蛋白转 位显著降低(P<0.01)。结论 高糖可以上调ARPE-19细胞TLR2的mRNA和蛋白表达,刺激PKC-α转位;高糖可能是通过 PKC-α通路上调ARPE-19细胞TLR2表达。 [关键词] 糖尿病视网膜病变;ARPE-19;TOLL样受体2;高糖 [中图法分类号] R774.1 [文献标志码] A Effect of different concentrations of D-glucose on toll-like receptor -2 expression in ARPE -19 Chen Xuemei, Zhang Xuedong, Zong Yuanjuan, Shen Qiang (Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Ophthalmology, 400016, China) [Abstract] Objective To observe effect of different concentrations of D-glucose on expression of toll-like receptor-2 in ARPE-19. Methods ARPE-19 cells were divided into different D-glucose concentration groups (5.5, 15.5, 25.5 mmol/L D-glucose), inhibition group (10 mmol/L Go6976, PKC-alpha pharmacological inhibitor, plus 25.5 mmol/L D-glucose); and osmotic control group (20 mmol/L mannitol plus 5.5 mmol/L D-glucose). After ARPE-19 cells were cultured in those conditions respectively for 48 h, Western Blot was used to determine TLR-2 protein expression and PKC-α translocation, while Real-Time PCR for TLR-2 mRNA levels. Results High glucose group (15.5, 25.5 mmol/L) increased TLR2 mRNA and protein expression, and PKC-α translocation (P<0.05), meanwhile the 25.5 mmol/L group increased higher than the 15.5 mmol/L group (P<0.05). PKC-α inhibitor significantly weakened the up-regulation effect of high glucose on TLR2 protein expression in ARPE-19 (P<0.01). Conclusion Expression of TLR2 in ARPE-19 was augmented by high glucose, whose effect could be suppressed partly by PKC-α inhibitor. [Key words] diabetic retinopathy;ARPE-19;toll-like receptor-2;high glucose Supported by the Key Project of Chongqing Municipal Health Bureau (2011-1-029). Corresponding author: Zhang Xuedong, Tel: 86-23-89012704, E-mail: zxued@sina.com [基金项目] 重庆市卫生局重点项目(2011-1-029) [通信作者] 张学东,电话:(023)89012704, E-mail:zxued@sina.com 编号 201109136 刊用形式 论著 CCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)[1]3’，扩增长度为186bp。Real-Time PCR法扩增:总反应体系是一种慢性低度炎症性疾病，病变视网膜的炎症介 为25 μl，采用两步法进行PCR反应，扩增条件:95 ?预变质表达增加，促炎症因子和炎症细胞在视网膜微血管 性30 s, 60 ? 退火30 s，72 ?延伸30 s，共35个循环。采损伤和新生血管的形成中发挥作用。视网膜色素上皮 用Bio-Rad MiniOpticon(Bio-Rad公司)进行反应，由CFX软件(retinal pigment epithelial,RPE)细胞能够分泌 生成扩增曲线和溶解曲线。 一系列细胞因子，调节局部免疫反应，对维持稳定的 视网膜免疫环境起重要作用。近来陆续发现DR中RPE1 .4 Western Blot 检测各组ARPE-19细胞TLR2、细胞在结构和分泌功能上的各种异常，RPE细胞参与D[2]细胞总PKC-α、细胞膜PKC-α蛋白的表达 R的炎症反应和新生血管的形成过程。 [3]各组ARPE-19细胞PBS清洗，加入全细胞裂解液吹打裂解，TLR2(toll-like receptor-2)是Toll样受体 4 ? 12000 r,min离心15min，取上清液，提取细胞的总蛋家族成员，属固有免疫中的模式识别受体，可以识别 白，用于检测TLR2，细胞总PKC-α。各组ARPE-19细胞PBS清感染性外源配体和非感染性内源危险信号分子，激活 洗后，加人200 μl胞浆蛋白提取液于玻璃匀浆器中冰上匀浆的TLR2可以上调多种促炎因子的表达，启动或加强炎[4-6]l0 min，4 ? 1000×g离心10min弃上清，沉淀加入100 μl症反应。这一机制在多种慢性低度炎症性疾病和[7]胞膜蛋白提取液，反复吹打后于4 ?摇床平缓摇动1 h，4 ?缺血性疾病中发挥作用。本研究观察高糖对体外培 16000×g离心20 min，取上清液即为胞膜蛋白成分，用于检养视网膜色素上皮细胞TLR2表达的影响和可能的机 测细胞膜PKC-α。用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮制，为进一步探讨TLR2与DR的关系打下基础。 沸5 min。行10,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,1材料与方法 转膜2 h，5%脱脂奶粉37 ?封闭2 h,一抗(抗TLR2抗体以1? 1 000稀释，兔来源;抗PKC-α抗体以1?1 000稀释，小鼠来1 .1 细胞及主要试剂 源)加到PVDF膜上4 ?孵育过夜,TBST清洗。二抗(辣根过氧 ARPE-19细胞(ATCC公司)，特级胎牛血清、胰蛋白酶、化物酶标记的羊抗兔IgG;辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgDMEM低糖培养基(GIBCO公司)，D-葡萄糖、甘露醇、Go69G)加到PVDF膜上37?孵育1h，TBST清洗。ECL法化学发光，X76(Sigma公司)，anti-TLR2抗体(Abcam公司)，anti-PKC线底片曝光显影。以GAPDH为内参。 -α抗体、anti-GAPDH抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIP 1 .5 统计学分析 A蛋白裂解液、细胞膜蛋白抽提试剂盒、BeyoECL Plus、辣 根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊采用SPSS 17.0 统计学软件对所有数据进行统计处理，抗小鼠IgG(碧云天公司)，逆转录试剂盒、定量PCR试剂数据资料以x??s表示。不同糖浓度组和高渗对照组的各组盒、引物(TaKaRa公司)。 间比较，采用多样本均数间多重比较的方差分析。PKC-α抑 制剂组分别和正常糖浓度组、高糖组比较，采用独立样本t1 .2 细胞培养及分组 检验进行统计分析。 ARPE-19用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、链霉 素(100 U/ml)的DMEM培养基(D-葡萄糖浓度:5.5 mmol/L)，2 结果 在37 ?、5, CO条件下培养。取第16,20代的ARPE-19细胞2 2 .1荧光实时定量PCR检测高糖对体外培养的ARPE用于实验。将细胞接种于6孔板中培养至细胞铺满板底80%左 右时，换含有0.5%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，分别用-19细胞TLR2 mRNA 表达的影响 不同糖浓度的无血清DMEM培养基刺激48h(正常糖浓度组:D-与正常糖浓度组(0.571?0.153)相比，中度高糖组葡萄糖浓度:5.5 mmol/L;中度高糖组:D-葡萄糖浓度:15.(1.133?0.069)的TLR2 mRNA表达增高(P<0.05),高糖组5 mmol/L;高糖组:D-葡萄糖浓度:25.5 mmol/L;高渗对照(2.234?0.191)的TLR2 mRNA表达显著增高(P<0.01)，组:D-葡萄糖浓度:5.5 mmol/L+甘露醇20.0 mmol/L;PKC-高渗对照组(0.651?0.123)的TLR2 mRNA表达无差异;高α抑制剂组:含D-葡萄糖浓度:25.5 mmol/L+PKC-α抑制剂G糖组比中度高糖组的TLR2 mRNA表达高，差异有统计学意义o6976 10.0 mmol/L)。 (P<0.05)。 1 .3 Real-Time PCR检测高糖对体外培养的ARPE-12 .2 Western blot 检测各组ARPE-19细胞TLR2、9细胞TLR2 mRNA表达的影响 总PKC-α、膜PKC-α蛋白表达水平 采用Trizol一步法分别从各组细胞中提取总RNA，逆转成与正常糖浓度组相比，中度高糖组的TLR2蛋白表达增高cDNA,采用荧光定量PCR分析TLR2 mRNA表达水平。引物由TaKa(P<0.05),高糖组的TLR2蛋白表达显著增高(P<0.01)，Ra公司并合成，TLR2引物序列:上游5’-GTGTTGCAAGCAG高渗对照组TLR2蛋白表达无差异;高糖组比中度高糖组的TGATCCAAAG-3’，下游5’-CACAAAGTATGTGGCATTGTCCAG-3’,LR2表达高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Go6976 PKC-扩增长度为157bp;内参基因ACTB引物序列:上游5’-TGGCAC 编号 201109136 刊用形式 论著 α抑制剂组比高糖组的TLR2表达降低(P<0.05)，然而仍然膜结构和功能，调节局部免疫反应，参与眼局部的比正常糖浓度组TLR2表达高(P<0.05)。 免疫赦免。近来的研究陆续证实DR中RPE细胞结构 各组细胞总的PKC-α蛋白表达无统计学差异。与正常糖和功能发生改变，RPE细胞参与DR炎症反应、新生[2]浓度比，中度高糖组胞膜PKC-α蛋白表达增高(P<0.05),。研究发血管形成以及黄斑水肿的发生发展过程高糖组胞膜PKC-α表达显著增高(P<0.01)，高渗对照组的现，高糖损害RPE细胞对水、葡萄糖、视黄醛的转胞膜PKC-α表达无差异;高糖组比中度高糖度的胞膜PKC-运功能，高糖还会影响RPE细胞分泌的炎症因子和[2]<0.05)。Go6976 PKC-α表达高，差异具有统计学意义(P生长因子，从而加重DR的发生发展。越来越多的α抑制剂组比高糖组的PKC-α表达显著降低(P<0.01)。见人认为RPE细胞在DR的发病机制中起重要作用。 [8]图1、表1。 RPE表达TLRs(TLR 1-7、9),ARPE-19是一种 广泛用于实验研究的RPE细胞系，本研究发现高糖 可以增加ARPE-19细胞TLR2的mRNA和蛋白表达， 呈现剂量依赖性，而高渗对照组ARPE-19细胞TLR2 的mRNA和蛋白表达无增高，因此排除了高浓度葡萄 糖导致渗透压增高对TLR2表达的影响。我们推测在 糖尿病视网膜病变中，高糖可以上调表达RPE细胞T LR2的表达。TOLL样受体(toll like receptor，TL[3]R)属固有免疫中的模式识别受体，是参与非特异性 免疫的一类重要分子,也是连接非特异性免疫和特 异性免疫的桥梁。人类的TLR蛋白属于I型跨膜蛋 白，由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成;胞外1:正常糖浓度组;2:高渗对照组;3:中度高糖组;4:高糖组;5:PKC-区由富含亮氨酸的重复序列LRR(1eucine-rich rep α抑制剂组 eats)组成，胞内区与IL-1受体胞内区相似，称为T图1 Western blot检测各组细胞相关蛋白表达的变化 IL-1 receptor)区。迄今，在人类体内发IR(Toll,表1 各组细胞相关蛋白表达的变化(x??s) [3]现了11种TLR 家族成员(TLR-1,11)。TLR2是惟组别 TLR2 细胞总PKC-α 细胞膜PKC-α 一能够与TLR1或TLR6形成异二聚体的，能够对不 同的配体产生反应，TLR2可以识别各种病原相关分正常糖浓度组 1.000?0.177 1.000?0.213 1.000?0.140 子模式，还可以识别各种内源性的配体，即细胞和甘露醇对照组 1.030?0.100 1.230?0.238 0.998?0.166 组织损伤后释放出的危险信号分子，例如:高速涌 * ?* ?动蛋白框1(high mobility group box 1 protein中度高糖组 0.987?0.144 1.278?0.084 1.367?0.113 [5]s，HMGB1)等。研究发现HMGB1存在于糖尿病患者??高糖组 1.118?0.145 1.549?0.132 1.720?0.134 的玻璃体中，且增殖性糖尿病视网膜病变患者的增[9]* ?#殖膜中也发现有HMGB1表达。目前认为高速涌动蛋PKC-α抑制剂组 1.103?0.202 1.196?0.181 0.659?0.136 *?白框1(HMGB1)是一种内源性警告素蛋白，具有促炎表示和正常糖浓度组相比差异具有统计意义(P<0.05),表示和正常糖?[10]浓度组相比具有显著差异(症、促血管生成作用P<0.01)，表示和高糖组相比差异具有统计。高糖上调表达RPE细胞TL#意义(P<0.05)。表示PKC-α抑制剂组和高糖组相比具有显著差异(P证明

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