玉米花粉特异性基因ZM401

玉米花粉特异性基因ZM401 震业生物技术JournalofAgriculturalBiotechnology2001,9(4):374~-377 ? 研究报告? 玉米花粉特异性基因ZM401cDNA片段的克隆及其达研究 李成霞刘俊起于静娟赵倩敖光明 (中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京100094) 摘要:采用差异筛选法,并结合肆噬菌斑筛选,从玉米l成熟花粉 cDNA支库中克隆分离了9个花粉特异性表达的eDNA 克隆,并对其中之一ZM401(zm,~ys401)进行了经基田组 Southern杂交和Northern杂交舟析表明,ZM401基因 单拷贝存在干玉米基因组中,只在花粉组织中表达,在叶片根,花药的 营养组织申均植测不到ZM401mRNA时积累.ZM401 基西的mRNA辨显表现曲1.2和2.0kb两种,推测可能为转最后前体 mRNA可变剪切的结果. 关键词:差异筛选;砖噬曹斑筛选;花粉特异性cDNA~玉米 CloningandExpressionAnalysisofPollen—specificcDNAZM401fromZeaMays LiChengx]aLjuJunqiYuJingjuanZhaoQianAoGuangming ationalLabosatoryforAgrobioteclmology.ChinaAgriculturalUnivetsiVy, Beijing1000941 A/l~na~~:N/hee/oaes,whichafesp~{fieallyex畔s钾 dinmepollen,wereobtainedbydiffereat~screeaita~ofamane polleneDNAlibraryfromZ.eamays.Co/d-plaquescreeningmethodwasalsousediI-thescreeningworkOneoftheseclones,named ZM40I(Zeamays40I),wasfltrthe-characte~dSouthernhybridizationshow.dthattheZM40】sequeaceispresentjnoneCopy in虹 maizegenomeNot~lernblotsalmlysisrevealedthattheexpressionofZM401bres~’ietedtomanlrepogenandnearlytaature anther,andZM4o1tramcriptswereriotdetectedinIeavesrootandothervegetativetissues.Uniikemostofplantgene~’amcripts. them嘲ageRNAsOfZM4o】disp/aytwosizes:1.2and2.0kbnJsmaydue刍 Dan肼确splicingnfRNA. Keywolds:Differentialscreening;cold-plaquescreening;pollen-specificeDNA;maize 近年来有关植物花粉发育的分子生物学研究有 了很大进展,克隆了多种植物花粉特异性表达的基 因,部分基因的功能也已研究清楚”目前用于克 隆花粉发育特异性表达基因的方法有差异筛选法, 以阿源基因为探针筛选法,差异显示浩,转座子标 蓥法,减去法杂交,表达序到标记法等其中,差 异筛选法更简便,快速,被广泛采用.例如来自蝈 蕈的花粉特异基因NTP303,TP10m,油菜花药 绒毡层特异基因A3,A8,A9i,拟南芥花药特异 性基因APG,玉米花粉特异性基因Zm13等都 是采用此种方法克隆的.差异筛选法的灵敏程度往 往受到mRNA表达丰度的限制.一般采用差异筛选 法倪能得到mRNA表达丰度相对商曲基因,否则就 很难用此方法获得.另外,由于eDNA探钎合成 过程中还会受到诸多困素的影响,易造成筛选过程 中但阳性克隆的增多. 针对差异筛选法的上述缺点,本实验将一种专 李戚霞:女,28岁,博士研究生Email:chendL谗m01mwi[colll ,联系作者 收稿日期:21201-04—20 门用于获得低丰度特异表达基困的方法一,争噬菌斑 筛选法与差异筛选法结合起来,用于玉米花粉发育 特异性基因的怖选克隆,并结合PCR技术进行阳性 克隆的验证,成功地克隆了玉米花粉特异性表达且 表达丰度较低的ZM40J(Zeamays401)基因的 cDNA. 1材料和方法 1.1材料实验所用玉米品种农大1O8材料取自 本室实验日,cDNA舍成试剂盒Universal@cDNA synthesissytem购自Promega公司,其它试剂购自 GIBCO-BRL,Promega,Takara等生物公司. 1.2植物总RNA的提取及Poly(A)+RNA的寓 集总RNA提取方法参照deVrieseta/的方法, 并进行了适当改进以用于大量提取.PoIy(A)+ RNA的富集参见分子克隆. 1.3eDNA文库的构建及筛选 1)eDNA舍成按Promega公司eDNA合成试 剂金Universal~eDNAsynthesissytern操作#说明#进 行,克隆载体为去磷酸化的l0 j潍整.j 竖塑圭堂堕笠:至鲞垄鳖特昱基2~ZM40leDNA片段的克隆爱其表 达研究375 2)差异筛选法与冷噬茵斑筛选法结合,对eDNA 文库进行筛选.eDNA文库共铺出100000个噬茵 斑的平板.每平板揭两张硝酸纤维素膜,做好标记, 用玉米成熟花粉eDNA探针和叶片eDNA探针进行 差异筛选.两轮筛选后,挑取只与成熟花粉探针有 杂交信号而与叶片振针没有杂交信号的克隆,以及 与花粉和叶片探针都没有杂交信号的克隆(即玲噬 菌斑)进一步验证 1.4噬菌斑的PCR扩增挖取单个噬菌斑至1.5 mL离心管中,加八100uL的无菌水,液氪中速冻 1min.室温融化.重复冻融一次离心后,吸取30 上清液作为进行PCR扩增.反应条件:95?, lmin;55?,1min;72?,1.5rain;30个循环后 72?延伸10min. 1.5Northern杂交RNA甲醛变性电泳,毛细管 转移及杂交方法参见分子克隆.探针标记见Pro- megaPrime-a-gene产品说明书. 1.6植物基因组DNA的提取及Southern杂交提 取方法参见Junghaseta1.方法(1990)”,略有改 进.Southern杂交方法参见分子克隆实验手册. 1.7反转录PCR分别以玉米成熟花粉,花药,叶 片,根等组织的总RNA为模板,在oligo(dT)}l 物引导下反转录合成eDNA第一链.根据 ZM40leDNA测序结果,在序列内部一对;物. 以反转录产物为模板进行PCR扩增,反应条件为 95?,lmin;55?,lmin;72?,lmin;循环数为 30 1.8eDNA片段克隆及测序eDNA片段从阳性 DNA上EcoRI酶切下,克隆至同样酶切处理的 pGEM7Zf(+)载体上.利用QIAGEN-mini?pr印Kits 提取双链质粒作为测序横板,方法见产品说明书 1.9eDNA序列的分析用DNASTAR,DNASIS 分析.GenBank,EMBL,DDBJ数据库中进行同源 性比较. 2结果与分析 2.1噬菌斑的PCR扩增及阳性克隆的验证从 eDNA文库中共筛选得到48个克隆根据构建载体 l0序列设计了一对}l物: 正向引物 反向引枷 筛选得到的单噬菌斑为模扳进行PCR扩增, PCR产物的大小即为eDNA插入片段的大小. 48个阳性克隆的PCR产物各取20L,95?变 性10min,置于冰上分别在预先作好标记的两套 硝酸纤维素膜上各点10PCR产物,同一个克隆 的产物点至两套膜相对应的位置.室温晾干,80”(2 烤膜30min.分别标记成熟花粉和叶片的eDNA探 针,备与其中一张膜进行杂交.结果表明在初选出 的48个克隆中只有9个为花粉特异性表达的阳性克 隆,其余克隆均在叶片组织中有一定程度的表达, 为假阳性.按照筛选编号分别命名为ZM109,ZM301, ZM305,ZM310,ZM40I,ZM50I,ZM502,ZM703, ZM801.选取ZM401克隆进行进一步分析鉴定. 2.2ZM401在玉米基因组中拷贝数的鉴定分别 以EeoRI,BamHl,和HindlII三种限制性内切酶消 化玉米基因组DNA,电泳转膜,以ZM401eDNA为 模板标记探针,进行Southern杂交,结果如图1所 示.用不同的限制性内切酶消化,杂交均表现为一 条带由此推断,ZM401基因在玉米基因组中是以 单拷贝存在的 7.0kls 4.5 匿lZM40I的心m 杂交结果 Fig.1Southernblotanaly sisofZM40l 用不同的限制性内蜘畴消化 目DNA. 【E~oRI;2BtlmHI;3Hi,udill Genomi~D『Awasdigested wjthEcoRI;Bnmt-lL丑dl/I 2.3ZM401转录产物的检测以ZM40leDNA片 段为模板标记探针,对玉米各组织部位进行Northern 杂交检测,结果如图2.杂交后的尼龙膜除去探针 后,用rDNA为模板标记探针进行再次杂交,用作 各个样品RNA量的指示. 由图2结果可知:ZM401的表达只能在成热花 粉中检测得到,而在其它所检测的组织(花药,呼 片和根)中都检测不到该基因的表达;而且ZM401 的信使RNA有1.2和2.0kb两种. 以玉米钧嫩花药,近成熟期的花药,成熟花粉, 叶片和根组织的总RNA为模板进行RT-PCR,结果 (如图3)表明只有在接近成熟的花药和成熟花粉中 能够检测得到ZM401转录产物的积累,在幼嫩的花 药,叶片和根中均检测不到ZM401的表达.同时设 置PCR负对照,直接以总RNA为模板进行PCR, 无扩增产物,排除了RNA中混有基因组DNA,影 农业生物技术2001年 响RT-PCR结果的可能性.可见,ZM401为一个玉 米小孢子发育过程中特异表达的基因,根据其表达 曲时间可将其归为晚期基因的范畴. 2.4ZM401cDNA的克隆,测序及其序列分析将 ZM401cDNA片段从载体上EcoRI酶切下来,构建 rDNA 图2zM40l的North- em杂交蚌巢 Fig2Northernblot analysisofZM401 l花药巷RNA;2l袅熟 花粉总RNA;3叶片巷 RNA;4根恩RNA ltotalRNAofanthe 2to~tlRNA盯mature pollen 3totalRNAoflea~es 4totalRNAofroots 图玉米不同组织总 RNA的RT-PCR结果 F蟾3ZM401expressioa 至同样酶切处理的pGEMTZf(斗)载体上,进行核 酸序列测定及分析.结果表明,该eDNA片段长682 6p(见固4,见下页).将eDNA序列翰人Genhank+ EMBL+DDBJ进行基因同源比较,来得到与之同源 的基因信息,初步认定该基因为一个新的玉米花粉 特异表达的基因,但有关该基目的功能尚需进一步 的研究确定. 3讨论 1)差异筛选法作为一种比较成熟的分子生物学 方法,在克隆植物花粉发育特异性基因方面作出了 很大贡献,至今仍被广泛应用于植物基因的克隆工 作中.但是,此法在实际的操作过程中存在一定的 局限性.它是采用两种或两种以上材料(或组织) 的eDNA探针,因此,其灵敏程度往往受到nlRNA 表达半度的限制.一般仅能得到mRNA表达丰度相 对高的基因,对于那些表达丰度低予0.1%的中等或 低丰度的基因,就很难采用此方法获得[71.为了筛 选得到表达丰度相对低一些的基因,特将一种专门 用于获得低丰度特异表达基因的方法一冷噬菌斑筛 选法与差异簿选结合起来应用,得到了表达丰度约 为O.O1%的花粉特异性基因ZMS02和丰度约为 O001%的ZM401基因.基因表达丰度的估算是根 据该基因在构建的eDNA文库中出现的频率.另外, 由于eDNA探针合成过程中还会受到诸如mRNA质 图4ZM40leDNA片段测序结果 F4SequenceofZM401eDNAfragraent 2)通常根据植物花粉发育相关基因表达的时空特异性,可以将其分 为两类:早期基目和晚期基 蠢蠢l 苎塑圭盛堕兰:至蕉粉特异性基因ZM401cDNA片段的克隆及其表达研究377 因”.早期基因在花粉母细胞减数分裂后不久即开 始积累,花粉成熟前达到表达高峰,随即迅速减少: 而晚期基因则在花粉发育的后期开始积累,在成熟 花粉粒中表达最高.根据RT-PCR研究分析ZM401 表达模式的结果,ZM401只在成熟花粉和接近成熟 的花药中表达,在幼嫩的花药中检测不蓟 ZM401mRNA的积累,可将ZM401基因归为晚期 基因的范畴.另外,在开裂散粉后的花药(只剩下 营养组织),叶片,根中均未检测到ZM401mRNA 的积累,可毗认为ZM401只在生殖组织中表达,而 在营养组织中并不表达. 3)真核基因的转录后加工剪切(Processingand Splicing)是一个十分复杂的过程,对基因的正确表 达非常关键,而同一个基因产生几种mRNA则是由 于转录后可变剪切(AlternativeSplicing)的结果 毗ZM401cDNA为探针进行的Northern杂交结果表 明:ZM401的mRNA表现为:1_2和2.0kb,而且 这两种mRNA表达程度基本相当,这一现象的产生 可归因于ZM401基因转录后前体mRNA可变剪切 的结果.已报道的大多数具有可变剪切现象的植物 基因,其产生的不同转录产物表达量是有差异的. 如玉米转座子基因En,该基因转录后,产生两种不 同大小的成熟转录物.两种产物的积累量差异很大, mpA约为tnpD量的100倍,而ZM401基因咀不 同剪切方式产生的两种mRNA,其表达量基本相当, 从Northern杂交的结果上看不出明显的差异另外, 一 些研究结果表明,环境因子如温度,激素等可以 调控基因的转录后可变剪切过程,如淀粉合成酶的 基因GBSS虬厦来自拟南莽的花器官发育相关基因 apetala3-1的转录后加工剪切过程均受到温度的调节 [141 .不同的温度条件下,其选择的剪切方式厦产生 的转录产物的种类和积累量均有很大差异.克隆自 黄瓜的细胞分裂素阻遏表达基因CR20也存在着转 录后可变剪切现象,细胞分裂素可以调控其剪切方 式的选择.ZM401基因转录后前体mRNA是如 何剪切的,其剪切是否具有组织,器官特异性,是 否受到外界因子的调控等,仍然不很清楚.目前克 隆得到的仅为ZM401cDromNicotianatabaccumex. 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