PCR-反向点杂交法在HPV基因分型中的应用

PCR-反向点杂交法在HPV基因分型中的应用 ====================================================================== 人乳头瘤病毒(HPV)可以通过多种途径感染生殖道，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。因此有针对性地进行HPV分型检测对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要意义。为了解我院妇科门诊患者HPV感染情况以及其基因型特点，对300例女性患者的宫颈脱落细胞进行了PCR-反向点杂交法检测HPV基因分型，结果报告如下。 1 与方法 1.1材料 检测标本来自宜兴市人民医院2011年1月,2011年8月的妇科门诊就诊并行宫颈多点活检患者样本共300例。年龄在20,65岁之间。以专用宫颈脱落细胞采集器进行采样。所用试剂和仪器均由深圳亚能生物技术有限公司提供。 1.2HPV-DNA提取 在宫颈处用HPV采集器获取标本(充分洗脱宫颈刷上的样本)，13000r/min离心10min，弃去上清，保留管底的细胞块，加入裂解液50μl悬浮沉淀，100?水浴加热10min，13000r/min离心10min，保留上清待用。 1.3PCR扩增 取出PCR反应管，分别加入已提取的待测样本DNA5ul，反应总体系为25ul，最后加入1滴矿物油，每次试验可设置一个阴性质控和一个阳性质控。PCR按以下条件进行扩增: 50?15min;95?10min;94?30s;42?90s;72?30s;40cycles;72?5min。 1.4杂交 首先将PCR扩增产物预变性，形成单链DNA，利用DNA双链碱基互补的原理，将PCR产物加入到固定有不同HPV亚型探针的低密度基因膜片上，共23种基因型，进行杂交。杂交后配制显色液显色。 1.5结果判读:HPV分型杂交膜上一共有23种基因型，并设有生物素(Biotin)及内对照点质控点。两质控点阳性，其他点阴性，应判定为HPV分型检测结果为阴性。两质控点阳性，其他点有1个或1个以上HPV分型点为阳性，根据膜条HPV分型分布图判断阳性点，确定HPV病毒类型。 2 结果 2.1HPV基因分型结果 300例患者中，HPV阳性者257例，检出率为85%，病理检测异常165例患者中，HPV阳性148例，单型感染93例，混合型感染24例，高危型占到HPV的78.2%，低危型占到21.8%。 2.2HPV各基因型年龄分布 300例女性HPV感染在20,30岁、31,40岁、41,50岁、51,60岁、>60岁年龄区间HPV的感染率分别为35.6%、26.8%、18.3%、8.5%和7.7%。可见HPV感染高峰在20,50岁这个年龄段。但HPV感染者的年龄差异无显著性(P>0.05)。提示女性生殖道HPV感染普遍存在于性活跃人群中。 2.3HPV阳性的分型与组织病理学关系:见表1。 注:括号内为混合感染病例数。 3 讨论 本试验共检出15种HPV基因型，提示本地区宫颈疾病患者中感染的亚 型有多种，HPV感染年龄大部分在性活跃期，34岁以下患者以低危型HPV感染为主，35岁以上患者以高危型HPV感染为主，300例中，78例子宫颈癌的患者，100%检出高危型HPV，进一步证实了高危型HPV感染在子宫颈病变发展中的重要作用。 本调查显示，高危型HPV感染是宫颈癌和癌前病变宫颈上皮内瘤(CIN)的主要致病因子。 PCR-反向点杂交法是采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术，利用PCR，分子杂交特异性高，是HPV基因分型检测的新方法[1]。应用PCR-反向点杂交法检测HPV-DNA，大大提高了检测的敏感性，特别是比单纯宫颈刮片更敏感[2]，因此，应用该方法对HPV-DNA检测可作为宫颈疾病，特别是宫颈癌及癌前病变等高风险人群的初筛手段，可根据HPV感染的基因型别预测受检者疾病风险度，以决定其筛查间隔，对积极控制HPV感染及有效治 ，降低宫颈癌的发生率,具有重要意义。 疗CIN 参 考 文 献 [1]李蕾.HPV联合宫颈细胞学检查在宫颈癌筛查中的应用[J].国外医学妇产科学分册，2007，34(5):317. [2]李洁，刘宝印.中国妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒感染及其地理分布的调查[J].中华实验和临床病毒学杂志，1996，10:50-55.