【doc】168抗双链DNA抗体研究的若干进展

【doc】168抗双链DNA抗体研究的若干进展 168抗双链DNA抗体研究的若干进展 茸讣学免瘫掣井黯1994午庸d期 M~=geneyMetal+Euv】Immuno!,1991;21 1131 SzakaIAKetai.jImmu~o,~.l鸵,{14o:4 T*wIGeta1.ImmanolRe,1690;IlT:185 LtuYIeta1.E吖jImmunoi,1g:21:2951 一一 川 R1,1I 17Bereke.Immunolev.?9ii0:l? 18~acobjeta1.IExpMed?1991?173:1165 19Liayreta1.Immuno[Today,1992-19C1): l7' 20KikctardHet1.jExpMed,19861】64:1455 辇瘟tt王打粮诏,'口A麻懵,商害?,帮岛 168抗双链DNA抗体研究的若干进展 福州总医院全军医学检验中I兰蛩综述朱忠秀审问 . : 厶摘要抗救链DNA(ds—DNA)I,%~-5-毛统性虹斑猿疮(sLE)的发病,病理变化皋预意均有密 切关系,近年来的深八研究更增加7人们对抗ds—DNA@进一步认识,本文重点介绍ds-DNA抗 原的特性.抗ds—DNA抗体的特异性厦其交叉反应,相应的单克隆抗体和独特型抗体等基础冉 宄的一些最新进展.'.. 1967年Aran~在系性性红斑狼疮(SLE) 病人的血清中发现了?种能与天然DNA (nativeDN.A,nDNA)结合的自身抗体,称 为抗天然DNA抗体或抗双链DNA(doub1e— strandedDNA,ds,DNA)抗体.后来的研究 明:抗ds—DNA抗体几乎只存在于SLE病人 的血清中,是SLE的一种标志抗体.抗ds- DNA与SLE的发病,病理变化及预后有密切 关系,近年来随着各种医学生物技术的发展在 ds—DNA抗原的性质,抗ds—DNA抗体的特异 性,单克隆抗体及抗体独特型的研究方面.取 得了令人瞩目的成果,本文就此作一综述. 一 ,DNA抗碌的分子特性 DNA抗原有其独特性;首先.DNA分子 有多种基本构象:右双螺旋(B—DNA), 左双螺旋(Z—DNA)【lI,单链及三链DNA 【 .不同构象的分子之间,抗原性差别 甚大.但又彼此交叉,还可互相转变.其次, DNA有许多重复的化学基因和构象,抗原决 定簇的重复出现使DNA抗体与DNA结合的亲 和力大大增加,其反应几乎是不可逆的.换言 ? 3O{? 之.DNA分子本身就犹如一种固相载体. DNA抗原的第三个特点是多聚阴离子性.双 螺旋DNA有一个由杂环碱基堆积而成的疏水 核心和一个由强酸性的磷酸残基与戊糖组成的 糖一碑酸骨架处于分子表面,其磷酸基因使得 DNA带大量的负电荷而成为一种粘性抗 原. 天然的双螺旋DNA分子表面的脱氧核糖一 磷酸原子易与抗体接近.位于分子中心的琉水 的残基基本上包裹在核心区域,仅暴露在距离 不到1nm的因双螺旋化所形成的粕豫内.单 纯针对残基本身的抗体无法进入这种又窄又深 的淘槽.因而不能与之反应.所以在与抗体的 反应中,ds—DNA分子的高级结构起决定性作 用.也就是说,ds—DNA的抗原决定簇存在于 构象之中.虽然残基不直接参与DNA与抗体 的结台,但不同的残基序列会产生不同的构 象,从而影响DNA的抗原性[3】. 早期的研究已经证明一抗DNA抗体与 DNA的结合能力与DNA抗原的分子最有关, 分子量越大,结合率越高.Papa/jan发珊;. 25bp的DNA片段与DNA抗体的结台力极 ?:?, 低,嗣为igG两个ab结合位点的距离至少在 1onto以上,而2~pDNA片段的长度仅为 8.5nm,被只能结合一个Fab,这种单价结合 显然是不稳定的.Edgington在用不同长度的 Z-DNA免疫小鼠时,发现只有60bp以上的片 段才能目J发足够的免疫反应,且片段越大,产 生的抗体滴度越高"】. Sano等人对SLE病人血DNA/抗DNA抗 体复合物中的DNA片段进行了分析IS】,他们 把分析到的DNA片段插入pBR,iz:质粒载体进 行克隆,其产物为37,79bp的DNA片段,其中 G+?含量平均为55嘶,高于人类总DNA的G +C平均含量(40.2嘶).此外,这些片段还 具有以下特征:富含CpG--核苷酸;含有较多 的重复序列,且以CCGG的出现率最高;DNA 抗体与上述克隆片段的亲和力大于天然DNA; G+c含量高的片段与抗体的亲和力高于A+T 含量高的片段j当cpo中的胞嘧嚏(C)被甲 基化时,与抗体的反应性增加100倍. DNA分子出现高含量的G+c,CpG及甲 基胞嚏啶(mC)时.易形成某些特殊的构 象l如三螺旋,z一螺旋及弯曲DNA等I.当 这些特殊结构的DNA出现在血清中,就可能刺 激机体产生DNA抗体I.那么,高G—C含量的 DNA是如何形成的呢?有作者认为:一方面 可能是活动性的SLE病人的染色体DNA在一 种不魄机铆的作用下,随机地变性成为小片段 DNA.'某些小片段的G—C含量有可能高于总 DNA中的G—C.另一方面,染色体DNA或 许主要是在G-C丰富区发生变性,结果使这些 片段释放蓟血循环中.. =,ds—DNA的免疫屎性 长期以来,不少学者采用免疫动物的方法 来翩备抗ds—DNA抗体,但未获满意的结果, 因此有人认为"ds—DNA不是免疫原.这种 经验式的观点在一定程度上限制了通过免疫动 物来获取DNA抗体的种种努力.直到1989 年Glikcson才以大肠杆菌的ds—DNA,EC ds—DNA)为抗原,首先在BALB/C小鼠体内 诱导出了抗ECds—DNA抗悻'l.细菌DNA含 有一些哺乳动物DNA分子罕见的序列和l构象, 其高G-C含量的区域和mC的出现率也较高,这 些结构特点使细菌DNA容易刺激动物产生抗 体I". 对于哺乳动物DNA,Frdrlkson尊人在研 究中发现.某些事先接种过人类多瘤病毒 ,再甩不加佐射的小牛舅腺 (BK)的家兔 DNA(CTDNA)进行免疫,可产生钟对CT dsDNA的抗体.未经BK预先接种的索兔,直 接用CTds—DNA免疫不产生抗CTds—DNA抗 体.对于这种依犊BK瘸毒的扰ds~DNA免疫 反应的机理尚不清楚.作着认为ICTdsDNA 可能不是一种最慑抗原,家兔对CTd~DNA 的免疫反应似乎需要某种预先的利激(如B苴 病毒免疫).另外,产生抗CTds—DNA执棒 的能力还存在个体差异,Ir及其它基因的功能 以及免疫系统的调节机翩或许与这种局限性有 关I". 上述研究又引发了人们对DNA及共照麓 反应的极大兴趣,相关的撮逋越来越多.II断 的资料表明1人工诱导的DNA抗体与SLn体 内自发产生的d8一DNA抗体柏特异性搬为相 似【.这些研究成果对于人们麓一步了?井 阐明自身抗体的形成机理,无鬟鲁起重安柏作 用. 三,抗DNA的单宽蠹抗体 在SLE患者体内,抗DN^抗体是多竟蠢的, 不均一的,其来源,抗原特异性和致病作用也 是多种多样的.杂交癌技术的应用,为复杂的 DNA抗体群的研究提供了方便.每常规的单 克隆抗体技术相比,自身抗体单克袋抗体的翩 备更为简便,不需要人工免疫动物,直接将自 身免疫病的动物模型的脾细胞或病人外周血淋 巴细胞(PBLC)与相鹰的瘤细胞融台就可建 立杂交描,采用不同的自身抗蹶进行筛选,则 可获得多种自身抗体. 杂交癌技术应用于D^抗体的研究始于 80年代初.按融合细胞的来撮不同,DNA抗体 ? 3O5' 的杂交瘤可分为羔类;第一类是鼠一鼠杂交 瘤,即将近交的SLE小鼠模型如:NZB, NZB/NyW,MRL的脾细胞与小鼠骨髓瘤细 胞进行融合.第=类,人鼠杂交癌,周SLZ 病人能自发分泌DNA抗体的B细胞与鼠的骨髓 癌细胞融合【0】.第三类是人一人杂交瘤,用 SLE病人的PBLC或脾细胞与人的骨髓瘤细胞 抹融合而成【11此外,还可将经过EB病毒 , 转化的SLE病人卫细胞进行克隆,来得到DNA 单克隆抗体_1J. 四,DNA抗体的交叉反应 无论单克隆还是多克隆韵DNA抗体,都 能与ds—DNA叉可与单链DNA(ss—DNA)反 应,还能与Z-DNA,DNA?RNA杂交体. tRNADNA/组蛋白及某些人工合成的多核 苷酸结合i-1.甚至可与多种细胞表面蛋白 质结台】苯少嬲离子亿台物如心磷脂和其 它磷脂,硫酸右旋糖酐,透明质酸和硫酸软骨 素以及硫酸肝索等都可与抗ds—DNA抗体结 合[1.】抗ds—DNA抗体与多种构象的DNA及 人工合成的多核苷酸的交叉反应被认为是抗体 与存在于这些分子中的共同抗原决定簇(糖一 磷馥骨架)绪台而引起的.DNA抗体与磷脂 类绚质结台vJ鳍构基础是磷脂表面重复排列的 磷酸脂类似于DNA分子中的磷酸脂II..另 一 方面静电吸附引起非特异结台,也是一个 重要原因II. DNA抗体如此广泛的交叉反应已引起人 j『丁的重视,研究辑了解这类交叉反应具有重要 意义.如抗(is—DNA抗体与心磷脂的交叉反应 可以解释1sLE病人常常出现梅索试验阳性的结 果.利甩抗ds—DNA抗体与硫酸右旋塘酐 (Ds)的反出,Suzuki将DS吸附在硝酸纤维 素柱上,用来去除SLE宿人血中的ds—DNA抗 体[1.】.这种交叉反也的现象还提示;对抗 ds—DNA抗体在SEE中的致病作用需进行重新 的评价.一般认为:SLE是一种免疫复合物痛, 抗ds—DNA与DNA抗溶澎戚的免疫复合物沉积 在肾脏,血管内皮及其它{E织器官,继而激活 ? 3O6? 补体,使组织和器官遭到慢害.但近年来许多 作者提出了新的观点:郎抗DNA抗体还可能 通过与肾小球某些成份的交叉反应_l,或者 通过电荷的作用1,直接结台在肾小球基底 膜上,产生阻塞或导致补体介导的炎症和组织 损害.. 五,抗ds—DNA的独特型 在DNA抗体中,一种独特型(【d)可能 只存在于某一类型的抗体,称为私有1d (privateId),而几种或多种抗体共同拥有 的IdV,,0称为公共Id(publicId).在SLE的 动物模型NRL/LPr和NZB/NZW中,50呖以 上的个体带有一种称为HBO的公共Id标志, 而在活动性的sLE中,约有一半双上的病人血 清中的DNA抗体带有一种称为16/6的公共Id 标志I. t6/eId主要存在于IgM型的DNA抗体 中,与SLE的活动性有关,病情活动时, i6/6Id的滴度上升,反之则下降.SLE病人 受损的组织中显示有16/6的沉积【l,更重 要的是:t6/6Id可以诱导正常的小鼠发展成 SLE用1"g带有tS/6的DNA单克隆抗体免 疫小鼠后,小鼠体内产生并维持高滴度'的'抗 16/6Id抗体,同时亦可检测到16/6Id,还可 检潮出其它一系列的自身抗体,并出现血沉加 快,白细胞减少,蛋白屎等SLE样的症状,免 疫组化显示16/6在肾赃沉积!l".Tiflcani 用取自SLE病人且带有16/6的多克隆抗体, 亦成功地诱导出小鼠实验性SLE【"1.不携带 1B/6的DNA抗体不错诱导SLE说明SLE极 有可悲是一种由Id诱导的疾病 目前对l6/6Id诱导SLE的机理还不清 楚,Slaoenfeld提出了这样的假设l"1:以16/6 Id(Ab)免疫小鼠,刺激产生了抗一16/6Id (Ab,),Ab:又可刺激小鼠产生抒抗一 16/6Id(Ab3),而A3则带有原来的病理 性16/6Id,这种抗体可能就是抗DNA抗体, 后者可导致SLE的发生.亦有人认为_l7】针对 16/6Id曲抗一16/6Id与自身抗砾(DNA)相 似(内影像关系),因此这种抗l6/6Id产生 的同时又进一步诱导能与DNA结台的抗一抗一 ~6/61d由于单克隆或多克隆B细胞的激活和 随后的体细胞突变,16/6Id和抗16/6Id的网 络就可能扩大,导致各种自身抗体的出现.因 此可以认为:l6/6Id诱发了一种起免疫原作 用的抗一16/6Id启动了实验小鼠体内Id的级 联放大作用.为了验证上述观点,Mendlovic 用一种经I6/6Id诱导为SLE的小鼠的拱 16/B_Id(Abz)单克隆抗体,成功地在另一 只小鼠体内诱发了SLEt1.Waisman镪备 了一种抗一抗一16/6Id(Aba),该抗体可结 合DNA,也可与兔抗一1s/6Id和鼠抗抗一is/6 Id结合与人的l6/6Id相似【2". 上述实验结果为SLE和其它自身免疫的研 究开辟了新的思路,尤其是实验性SLE的诱导 成功,将大大促避这方面的研究.可以设想. 利用独特性网络治疗SLE和其它自身免疫病也 是颇有希望的jIJ. 穴,结语. E 近年来国外学者对DNA抗体的研究十分热 门,许多束解之谜吸引着人们,对于DNA抗体 的来耀琅l产生机理以及在SLEhh~作用. 学者们众l说纷纭,莫哀一是.随着探讨的进一 步深入,人们已经意识到:揭开DNA抗体神 秘的面纱对予SLE和其它自身免疫病,乃至整 个免疫学领域的研究,均有着重要曲意义. 参考文献 2MJ.C』ca!.Bi0:Chen,19;';230:33I5 3M.iaF,etai.Ccl1I玉n?,:03;L4 l一8 4三din~ionSMeta:.M]【I_I:'n'i,1992) 20300 5SagoHeta..StandjIm]l,l989)30: 5 6G"ke1GSeta【.jImcao,ig39:142; 4e2 7Fred~;k坤nKeta【.Scn.】Im血)' eqhs?O 8KrjshnanMRea】.jkImun0:,1明】50: 40^3 9WinkerTHeta:.C1inExpInmun)!,990- 85:379 10Eh1ens—e}Meta【.C{inExpI1盟"?' i993;92:39 ilBanksTAeta1.Immu?11nvest,1993)02: 22g JRazEetalEarjImmltno['1明|23:083 l3Sh0enreidYeta】.FASEB3'l?;4:1e 2『le【fne?rDeia!.Biomateriais'1992~ 13:59 15Ka#hihar8Neta1.ActaMdOkayama' 1993:47:255 l6SazskKefa!.Langet'】9日0-33S:253 . 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