【word】 金水宝胶囊对肺肾两虚型COPD大鼠病理及免疫功能的影响

【word】 金水宝胶囊对肺肾两虚型COPD大鼠病理及免疫功能的影响 金水宝胶囊对肺肾两虚型COPD大鼠病理 及免疫功能的影响 圈团圃匿 窦虐 壤瘸璎废晌 山东大学附属山东省立医院(250021)张才擎梁铁军 山东中医药大学(250014)张伟张心月何荣 摘要:目的探讨金水宝胶囊对肺肾两 虚型COPD大鼠病理及免疫功能的影 响.方法采用改良烟熏加气管滴加脂 多糖方法复制COPD模型,第22天起 大鼠背部皮下注射浓度为25mg/ml的醋 ,连续8d.进 酸氢化可的松O.3ml?只?d一 行二次造模复制成肺肾两虚型COPD. 然后随机分为治疗组,模型组.进行对 比.结果治疗组大鼠症状较模型组明 显改善.结论金水宝胶囊对于COPD 大鼠气道功能,结构改善起着非常重要 的作用. 关键词:金水宝胶囊;肺肾两虚型;慢 性阻塞性肺疾病;大鼠;病理;免疫功能 1材料 1.1实验用动物8周龄Wister大鼠72 只,健康雄性,体重为(200+20)g.清洁级 (动物生产许可证号SCXK鲁 20030004),全部动物自由摄食,饮水,饲 料为混合标准颗粒饲料.使用消毒垫料 且定期更换.饲养室温度20~23~C,湿度 50~60%.光照每天12h. 1.2药物和试剂指定品牌香烟;脂多 糖(1ipopolysaccharide,LPS),产于美国 Sigma公司;戊巴比妥钠,进口分装,中国 医药集团上海化学试剂公司,批号: F20020915;IL一4,IL一8,TNF一0【放射性 免疫试剂盒,购于解放军总医院科技开 发中心放免所;IFN一ELISA试剂盒购 于武汉博士德生物工程有限公司. 1.3主要仪器AE200电子分析天平(梅 特勒一托利多仪器上海有限公司),FAS— CO型全自动血液流变快测仪(重庆大 学维多科研所),GMJ型全自动放射免疫 计数器(江苏省医疗电子研究所), 垒{墨:墨 DDL-5冷冻离心机(上海安亭科学仪器 厂),~BR.IO型全自动酶标仪(意大利), 日立H一800扫描电子显微镜等. 2方法 2.1动物分组及模型将实验动物随机分 为以下两组:对照组24只.COPD肺肾两 虚模型组24只.COPD肺肾两虚治疗组24 只.造模组模型复制采用宋一平【1】的方法 并加以改良建立大鼠肺肾两虚型COPD 模型,即在室温环境中,第1,14天大鼠 麻醉后气管内滴脂多糖.第2~28天给予 大鼠每天两次香烟烟熏.每次点燃烟丝 的重量为9.03g(每支烟烟丝重量为 O.645g),持续时间大约1小时.二次造 模:第22天起大鼠背部皮下注射浓度为 25mg/ml的醋酸氢化可的松O.3ml?只? d一.连续8d.空白对照组不做任何干预, 相同室内环境下自由饮食饮水.实验前 后分别称重.计算体重增长指数=(实验 后体重一实验前体重)/实验前体重. 2.2给药方法第3O天起肺肾两虚治疗 组灌服金水宝胶囊混悬液.每天灌服 2ml(浓度15g?ml?d,,相当于成人剂量 的1O倍).连续3O天. 2.3观察指标及方法 2.3.1气管超微结构观察暴露气管,取 隆突上气管1~1.5cm,迅速置于4~C2%戊 二醛中固定.4~C冰箱保存,2小时后PBS 缓冲液充分漂洗,再用四氧化锇固定30~ 60min,双蒸水洗3次.固定过程温度保 持在4~C.固定后用递增浓度的酒精脱 水,临界点干燥,用导电胶将样本枯敷在 金属样品台上,金属镀膜,行扫描电子显 微镜观察超微结构. 2.3.2肺组织标本处理及HE染色取 左肺上叶置于10%中性福尔马林溶液中 固定.以混合固定液(酒精,福尔马林各 半)固定2小时.酒精梯度脱水后二甲苯 透明标本,浸蜡(时间>3h),包埋,切片(厚 5m).常规HE染色,光学显微镜下观察 肺组织形态学改变. 2.3.3动脉血气分析用10%水和氯醛 (350mg/kg)腹腔注射将大鼠麻醉,然后 将大鼠固定于手术台上.迅速打开腹腔. 从腹主动脉取血lml(肝素抗凝),动脉 血迅速送化验室进行血气分析. 2.3.4肺组织匀浆测IL-4,IL-8,TNF一 0【,IFN一含量取右肺组织,洗净称重 后,冰盘上剪碎,每克肺组织加入10ml 生理盐水.用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆 2O次左右.取匀浆液置离心管中,4~C 15000r/min离心20min,取上清液,保存 于一80~C超低温中.放射免疫法测肺组织 匀浆IL一4,IL一8,TNF一0【含量.酶联免 疫法测肺组织匀浆IFN一含量. 2.4统计学方法采用SPSS11.5统计软 件处理.计量资料采用方差分析,数据以 附1各组大鼠动脉血pH,PaO扒PaCO2结果比较(s) 注:与对照比较,P<O.05,P<O.01;与模型组比较,AP<0.05 ?s表示. 3结果 3.1一般情况比较对照组大鼠活泼好 动,毛发有光泽,体重逐渐增加,呼吸平 稳.无任何特殊表现;模型组大鼠于造模 开始第1天即出现明显的咳嗽,之后不 吸烟时也出现咳嗽,声音减小,渐转为慢 性咳嗽.分泌物较多.活动量减少,拱背 蜷卧,体重增幅减轻,食量减少,行动迟 缓.造模28天后,出现气急,部分可闻及 哮鸣音.经二次造模后,模型组呼吸浅 急,喜扎堆而卧,行动迟缓,精神倦怠.治 疗组经喂药症状明显减轻.模型组大鼠 死亡1只,治疗组大鼠死亡2只. 3.2大鼠体重增长指数比较与对照组 比较.模型组及治疗组大鼠体重增长指 数显着下降;与模型组比较,治疗组大鼠 体重增长指数显着上升.(均P<0.01) 3.3肺组织外观对照组大鼠两肺大小 适中.淡粉肉色,外表光滑柔和,弹性好; 模型组大鼠两肺体积明显增大,暗红偏 紫伴点状苍白,外表粗糙略硬,弹性差. 支气管黏膜红肿,管腔中有较多粘液性 分泌物;治疗组外观较模型组明显改善. 3.4大鼠肺组织病理学变化HE染色: 对照组中,小支气管黏膜上皮细胞排列 整齐.未见嗜酸细胞浸润.纤毛无损伤脱 落;肺泡结构连续,肺泡壁完整,肺泡间 隔无充血水肿,肺泡腔无扩大,且未见明 显渗出;模型组小气道2~3级上皮细胞 变性坏死糜烂脱落,可见不同程度的慢 性炎性细胞浸润,纤毛倒伏,脱落,变性 坏死:肺泡扩大融合,肺泡数量减少,肺 泡毛细血管床减少;治疗组各级气道上 皮细胞变性坏死明显减轻,慢性炎性细 胞浸润程度较模型组减轻,纤毛倒伏,脱 落减少.肺大泡数量减少. 电镜下可见:模型组纤毛不同程度 倒伏,粘连,缺失,管腔内可见炎性分泌 物:治疗组明显好转. 3.5动脉血气分析附表1示,与对照 组比较,模型组,治疗组PaO均明显降 低(P<0.01),PaCO2均明显升高(P< 0.05—0.01);与模型组比较,治疗组PaO 显着升高(P<0.05),PaCO显着降低(p< 0.05):模型组pH值较对照组明显降低 (P<0.05),模型组与治疗组动脉血pH 值无显着差异(P>0.01). 3.4肺组织匀浆测IL一4,IL一8,TNF—d, IFN一含量及比较附表2示,与对照 组比较,模型组,治疗组IL一4,IL一8, TNF—水平均明显升高(P<0.05— 0.01),IFN,水平及IFN一~//IL-4比值 下降明显下降(P<0.05~0.01);与模型组 比较.治疗组IL-4,IL一8,TNF—水平 均明显下降(P<O.05~0.01),IFN一水平 及IFN一~//IL一4比值明显升高(P< 0.01). 4讨论 T淋巴细胞主要分泌IFN一和IL一 4,IFN一能激活肺泡巨噬细胞和单核细 胞,促进细胞介导的细胞毒反应,增强肿 瘤坏死因子(TNF)对血管内皮细胞所介 导的多种功能;IL-4对免疫应答的影响 主要是抑制细胞免疫,促进杯状细胞增 生和气道粘液分泌,促进平滑肌细胞增 生及上皮下纤维化,因而IFN一和IL-4 以相互拮抗的方式调节着机体正常免疫 应答的平衡.肿瘤坏死因子~x(TNF—) 主要由单核细胞和巨噬细胞产生.能促 进中性粒细胞脱颗粒伴蛋白水解酶释放 和呼吸爆发.刺激血小板激活因子,前列 腺素,白三烯等合成从而导致气道高反 应性和气道炎症,还可增强中性粒细胞 的细胞外蛋白分解作用,促进炎症反应, 血管生成和组织纤维化.加重了COPD 附表2肺组织匀浆测IL一8,IL-4,TNF—a,IFN-y含量变化及E较(s) C—APIT 生 ALM 业 EDICINE国团固?—??????—??- 气道炎症反应及气道结构的重塑,导致 肺功能下降.IL-8是一种有肺泡巨噬细 胞,支气管上皮细胞等多种细胞产生的 具有多种生物活性的细胞因子,脂多糖 可以诱导上述细胞产生IL一8.研究表 明,IL一8在COPD患者肺组织中中性粒 细胞及其他炎症细胞聚集,介质释放等 炎症过程中起关键作用,可作为判断 COPD严重程度的指标之一. 本研究表明肺.肾两虚型COPD大 鼠小气道2~3级上皮细胞变性坏死糜烂 脱落,可见不同程度的慢性炎性细胞浸 润.气道纤毛粘连,倒伏,缺失,变性坏 死,肺泡扩大融合,肺泡数量减少,肺泡 毛细血管床减少,大鼠动脉血PaO降 低,PaCO升高,经金水宝胶囊治疗后, 各级气道上皮细胞变性坏死明显减轻, 慢性炎性细胞浸润程度较模型组减轻, 纤毛倒伏,脱落减少,肺大泡数量减少, 大鼠动脉血PaO升高,PaCO降低,提示 金水宝胶囊能明显改善管腔阻塞,降低 气道高反应性,促进气道的修复.本研究 还表明肺.肾两虚型COPD大鼠肺组织 匀浆IL一4水平及IL一8,TNF—水平均 明显增高,IFN一水平及IFN一~//IL-4 比值显着降低.提示存在气道的慢性炎 症和反复感染的情况;经金水宝胶囊治 疗后.IL一4水平及IL一8,TNF—水平显 着下降,IFN一水平及IFN一/IL一4比 值显着升高.提示小青龙汤具有纠正 Th,/Th比值的失衡,抑制炎症介质的产 生,增强机体对病原菌的清除功能,而产 生解热,抗炎,平喘,镇咳和抗过敏作用. 参考文献 1宋一平.崔德健,茅培英.慢性阻塞性 肺病大鼠模型的建立及药物干预的影 响.军医进修学院,2001,22(2):99~ 102 (20080711收稿) 注:与对照比较,P<0.05,P<0.01;与模型组比较,AP<0.05,AAP<0.01