抗蓝舌病毒VP7单克隆抗体的制备及其特性

抗蓝舌病毒VP7单克隆抗体的制备及其特性 () 畜牧兽医学报 ,2001 ,32 5,4582462 A ct a V ete ri n a ri a et Zootech nica S i nica 抗蓝舌病毒 VP7 单克隆抗体的制备及其特性 1 1 1 2 2王健伟,姜慧英,洪 涛,李晓成,李云岗 ()11 中国预防医学科学院病毒学研究所 ,北京 100052 ;21 农业部动物检疫所 ,青岛 265063 () 摘 要 :为了提高蓝舌病毒 B TV快速免疫诊断方法的灵敏度和特异性 ,对蓝舌病毒 V P7 特异性 单克隆抗体的制备进行了研究 。用纯化 B TV1 颗粒为免疫原 ,以重组 B TV13 V P7 为筛选抗原建 立了能分泌高效价单抗的 6 个杂交瘤细胞株 ,抗体滴度最高可达 1?32 000 000 。初步结果明 ,所 获单抗与 V P7 的结合可被不同型 B TV 参考血清阻断 。随后用单抗与重组 V P7 抗原初步建立竞 争抑制 EL ISA 方法 ,对 21 份血清进行测定 ,结果与间接 EL ISA 检测结果完全符合 ,有可能用于建 () 立我国 B TV 快速可靠的新型诊断方法 竞争 EL ISA。 关键词 :蓝舌病毒 ; V P7 蛋白 ;单克隆抗体 ;制备 () 文章编号 :0366 - 6964 200105 - 0458 - 05 中图分类号 : S852 . 65 文献标识码 :A () 蓝舌病是由蓝舌病毒 Blueto ngue virus ,B TV引起的一种烈性动物传染病 ,主要危害牛 、 1 绵羊等家畜 ,在世界范围内广泛流行。因此 ,通过建立简便可靠的检测方法对本病的流行 进行监测以控制其流行具有重要意义 。蓝舌病诊断技术的发展方向是在保证灵敏度的基础 上 ,最大限度地保证方法的特异性 。目前国际上公认的 、符合这一要求的方法是竞争抑制性 ( ) EL ISA Co mpetitive EL ISA ,c EL ISA, 国际兽疫局已向全世界推荐使用并将作为方法 。 我国在这 方 面 的 研 究 比 较 落 后 , 国 内 目 前 应 用 的 检 测 方 法 主 要 是 琼 脂 糖 免 疫 扩 散 试 验 2 3 () A GID,其后发展了间接 EL ISA和斑点 EL ISA,这些方法在特异性方面均存在一些问 ( ) 题 。由于得不到抗 B TV V P7 的特异性单克隆抗体 Mo noclo nal antibo dy , McAb,国内对竞争 抑制性 EL ISA 方法研究的很少 ,因此大大阻碍了我国 B TV 诊断技术水平的提高 。为此 ,在成功研制基因工程 B TV V P7 群特异性抗原的基础上 ,本文对抗 B TV V P7McAb 制备进行了研 究 。 1 材料与方法 111 材料 11111 病毒 、抗原与血清 :B TV1 中国分离株由农业部动物检疫所提供 ,重组杆状病毒表达的B TV 13 V P7 抗 原 、野 生 型 杆 状 病 毒 感 染 昆 虫 细 胞 的 裂 解 液 按 文 献 4 方 法 制 备 , B TV1 、 B TV13 、B TV20 参考羊抗血清均由农业部动物检疫所提供 。待测羊血清标本由农业部动物检 疫所收集 。 () 11112 细胞系与实验动物 :小鼠骨髓瘤细胞系 Sp 2/ 0 与幼地鼠肾细胞 B H K - 21均为本室 传代细胞 。BalB/ c 小鼠 、昆明小鼠均购自中国药品生物制品检定所动物繁育场 。 收稿日期 :2000204227 ( ) 基金项目 :农业部九五畜牧兽医重点项目 95 牧202203206 ( ) 作者简介 :王健伟 1968 —,男 ,山东烟台人 ,博士 ,副研究员 ,从事分子病毒学与病毒基因工程学工作 。 ( ) 11113 主要试剂 : HA T 与 H T 选 择 性 培 养 基 、降 植 烷 Pristane、完 全 与 不 完 全 弗 氏 佐 剂 、 P E G1 000 、抗体亚类分型试剂 、TMB 、R PM I 1640 培养基均购自 Sigma 公司 。新生牛血清购自 杭州四季青生物工程材料研究所 。 112 方法 11211 B TV 的培养与病毒颗粒纯化 :参见文献 5 。 (μ) 11212 动物免疫 :6,8 周龄雌性 BALB/ c 小鼠 体重 18,22 g,首次免疫用 50g B TV1 纯 μ化病毒颗粒与等量福氏完全佐剂混匀 ,腹腔注射 。2 周后再用 20 g B TV1 与等量福氏不完 μ 全佐剂混匀后 ,腹腔注射追加免疫 ,此后 3 周每周用 20 g B TV1 腹腔注射重复免疫 ,最后一 μ 次重复免疫 1 周后 ,脾内注射 10 g 病毒 ,3d 后取脾融合 。 11213 细胞融合与选择性培养 :按常规方法进行 ,脾细胞与 Sp 2/ 0 细胞以 8?1 的比例混合 ,用50 %P E G1 000 融合 。融合后的细胞用含 2 % HA T 的 20 %小牛血清 R PM I 1640 培养液混悬 后 ,分种于加有昆明小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层的 96 孔培养板中 ,置 5 %CO37 ?孵箱中培 2 6 养 ,当低倍镜检杂交瘤克隆生长达 1/ 3,1/ 2 视野时 ,取上清液进行筛选。 11214 杂交瘤筛选及抗体检测 :对于每一细胞孔的培养上清 ,在酶标板上采用“扣除法”双孔 ( ) () 筛选 。一孔以重组杆状病毒表达的 B TV13 V P7 以下简称 V P7为包被抗原 实验孔,一孔 ( ) μ以野生型杆状病毒感染的昆虫细胞裂解液为包被抗原 对照孔,每孔均加入 50 l 细胞培养 上清 ,用间接 EL ISA 方法筛选分泌抗 V P7 抗体的细胞孔 。最后选择对照孔为阴性 ,而试验孔 为强阳性的单克隆细胞孔的细胞进行克隆或扩大 、传代 。以免疫小鼠的血清为阳性对照 ,以 ) ( (Sp 2/ 0 细胞培养上清为阴性对照 ,阳性细胞孔的判定标准为 : 实验孔 OD 值 —空白值/ 阴性 ) 对照 OD 值 —空白值?211 。 ) (11215 竞争抑制性 EL ISA :用 V P7 或野生型杆状病毒感染的昆虫细胞裂解液为抗原 ,包被 μμ( 酶标微孔板 ,每孔 100 l ,4 ?过夜 ;酶标板洗净后 ,每孔加入 50 l 单抗稀释液 间接 EL ISA 检 ) μ() 测时吸光度刚好达到 110 时的工作浓度与 50 l 待测血清 原倍和 10 倍 、100 倍稀释,37 ?,2 h ; PB S2T 洗 3 min ×5 ,每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 Ig G ,37 ?,1 h ;酶标板用 PB S ( μμT 洗 5 ×3 min 后 ,加入底物溶液 ,每孔 100 l ,37 ?,30 min ;加入 50 l 终止液 ,以 450 nm 波 长测定吸光度值 。 2 结果 211 建立了分泌抗 VP7 单克隆抗体的杂交瘤细胞系 用超离纯化的 B TV1 病毒颗粒免疫 5 BalB/ c 小鼠获得了较好的免疫应答 ,免疫小鼠血清用重组 V P7 抗原检测其滴度可达 1 ?10。 细胞融合后 , 分种 4 块细胞 96 孔培养板进行培养 , 共有 160 个 孔 长 出 克 隆 , 克 隆 出 现 率 为 4117 % 。其中阳性克隆为 10 个 ,阳性克隆率为 613 % 。用“扣除法”筛选抗 V P7 的强阳性克 隆 ,经 1,4 次亚克隆 ,获得了 6 株稳定分泌抗 B TV V P7 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,分别 命名为 :1C3 、3B7 、3C5 、3C9 、3 F12 、3 H9 ,细胞克隆化结果见表 1 。 半年内对获得的细胞株进行多次冻融 ,发现各细胞株分泌抗体的能力和稳定性均无改变 。 212 抗体的一般特性 应用已获得的 6 个细胞株制备了大量的腹水进行研究 。抗体的亚类 、 分子量 、纯化腹水中的 Ig G 含量 、杂交瘤细胞培养上清及腹水的稀释度 、参考工作稀释度和亲 和常数等情况见表 2 ,图 1 为辛酸2硫酸铵纯化的 4 株 McAb 的 SDS2PA GE 检测结果 。 460 畜 牧 兽 医 学 报32 卷 表 1 3 株杂交瘤细胞的克隆化结果 Ta ble 1 The results of hybridoma cell l ines clon ing 克隆轮次 No . of clo ning 1C3 3B7 3C5 3C9 3 F12 3 H9 cycles a b()()()()()1 100 % 11/ 11 96 % 21/ 22 45 % 19/ 29 100 % 25/ 25 () 25 % 4/ 16 100 %18/ 18 — () ()()()()100 % 22/ 2296 % 22/ 23 2 100 % 19/ 19 100 % 30/ 30 90 % 21/ 23 — — —()()96 % 22/ 23 100 % 57/ 57 3 — — —— ()()4 —100 % 34/ 34 100 % 21/ 21 a :克隆阳性率 Positive rate of clo ning b :阳性孔数/ 检测孔数 No . of positive holes/ No . of determinated holes 表 2 单克隆抗体的特点 Ta ble 2 The characterization of monoclonal antibodies 培养上清稀释度 腹水稀释度含量 Ig G 杂交瘤细胞株抗体亚类Titers of t he 工作稀释度 5 ( )g/ L ( )×10 Hybrido ma Subt ypes supernant of Dilutio n titer Ig G co ncen2 Dilutio n titers of st rain t he hybrido ma for wor king t he McAbs t ratio n ascitic fluid cult ures 51C3 6 . 5 ?2 560?40Ig G 11 1?2 . 5 ×10 1 3Ig G 11 3C5 6 . 6 ?160?0 . 62a1?2 ×10 6Ig G 1?5 1201?320 3C9 12 . 8 1?10 6Ig G 11 3B7 7 . 2 ?2 560?32011?4 ×10 3Ig G 3 H9 2a5 . 0 1?3201?0 . 6 1?2 ×10 5Ig G 1113 F12 6 . 0 ?1 280?201?2 . 5 ×10 213 抗 BTV VP7 单抗与免疫原的背景蛋白无交叉反应 为了排除所获单抗与免疫原中可 能混有的杂质或筛选抗原中混有杂质反应的可能 ,我们对所获 6 株单抗与各种抗原的反应情 况进行了试验 。以 V P7 、B TV 、B H K221 、AcN PV 和 Sf29 为包被抗原 ,以抗体工作稀释度 、10 倍 稀释度和 100 倍稀释度分别进行检测 ,以工作稀释度和 10 倍稀释度检测 ,结果 B H K221 、Sf29 、 AcN PV 均为阴性 ,证明所获单抗确为抗 V P7 ,而不与免疫原和检测抗原的蛋白背景有交叉反 应 。 μ214 抗 VP7 单克隆抗体可被不同型蓝舌病毒抗体抑制 将 50 l B TV1 、B TV13 、B TV20 标 ( ) 准血清以原倍液和 10 倍 、100 倍稀释液形式分别与等量 3 F12 工作稀释液 1 ?120 000,可见 () 单抗可被不同程度地抑制 ,说明这些单抗与不同型 B TV V P7 上的表位均能反应 图 2。 21 份 待 测 羊 血 清 分 别 用 间 接 EL ISA 和 竞 争215 抗 VP7 单 抗 用 于 蓝 舌 病 毒 抗 体 检 测 () EL ISA 检测 ,结果阳性 12 份 ,阴性 9 份 ,二者符合率为 100 % 表 3。 表 3 间接 EL ISA 与竞争 EL ISA 检测结果的比较 3 讨论 Ta ble 3 Comparison of the detection of BTV 以野生型 B TV1 颗粒为免疫原 ,以昆虫细 antibodies in sheep sera bet ween iEL IA and c EL ISA 胞表达的 B TV13 V P7 为检测抗原 , 获得了 c EL ISA 6 株分泌抗 B TV V P7 McAb 的杂交瘤细胞 。 + - 从有关细胞克隆的数据可以看出 ,融合后克隆 i EL ISA + 12 0 阳性率很低 。其原因我们认为有以下几点可 - 0 9 () 能 : 1用全部的 B TV 结构蛋白免疫动物 ,针 i EL ISA :间接 EL ISAc EL ISA :竞争 EL ISA 对 V P2 等更优势抗原的 B 细胞亚群可能占据 ( ) 了 B TV 免疫小鼠后产生的 B 淋巴细胞主体 ,而针对 V P7 的 B 淋巴细胞较少 ; 2V P7 本身的 () 免疫原性比较弱 ; 3针对不同型 B TV V P7 共有表位的 B 细胞亚群很少 。 由于用于筛选的 V P7 抗原不是纯净蛋白 ,而是昆虫细胞的裂解液 ,其成分十分复杂 ,为了 防止得到与昆虫细胞成分交叉的假阳性抗体 ,我们设计了一种“扣除法 EL ISA”。这种方法的 原理是 :表达 V P7 的昆虫细胞与仅有野生型 AcN PV 感染的昆虫细胞相比 ,两种细胞成分的差异在于前者比后者多出 V P7 成分而少了多角体蛋白成分 ,因此当分别用杂交瘤细胞上清与这 两种抗原反应时 ,抗 V P7 的特异性抗体只能与前者反应 ,而不能与后者发生任何反应 ,与两者 都反应 、或仅与后者反应或均不反应的克隆均不是抗 V P7 的抗体 。通过这种方法确保了所获 得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对 B TV V P7 的 。所获 6 株单抗的特异性被以后的试验 所证实 。 V P7 虽为疏水蛋白 ,但其中部存在若干个线性表位 ,这些表位主要分布于 N 端和蛋白中 部 ,其 N 端有可能伸展到病毒表面 ,这些表位对于 B TV 的免疫可能有重要作用 ,但均不是中 7 ,10 和性抗原 表 位。由 于 条 件 所 限 , 没 有 对 这 些 单 抗 所 针 对 的 表 位 进 行 分 析 。用 3B7 和 ( ) 3 F12 进行中和 试 验 , 结 果 表 明 它 们 均 无 中 和 活 性 数 据 未 列 出 , 这 与 V P7 的 特 性 是 一 致11的 。 用所获单抗对竞争 EL ISA 进行了初步试验 。这种方法的结果判定关键在于抑制率 cut2off 值的选择 ,我们采用了国外文献普遍采用的 50 %作为划分阴性与阳性的界限 。测定了 21 分羊血清标本 ,c EL ISA 与 i EL ISA 的符合率为 100 % ,但要获得更为确切的数据尚需做大批量 462 畜 牧 兽 医 学 报32 卷 的血清检测试验进行验证 。 纵上所述 ,在获得 B TV V P7 基因工程抗原的基础上 ,我们又制备了抗 B TV V P7 的单 抗 ,这些工作为我国 B TV 新型检测方法的研究打下了物质基础 。 参考文献 : 1 张念祖 ,李志华 ,张开礼 ,等 . 中国蓝舌病发现历史 、病毒分离及血清学研究 A . 云南省热带亚热带动物 病毒病重点实验室编 . 第一届东南亚太平洋地区蓝舌病学术讨论会论文汇编 C , 昆明 :1995 ,4,151 () 2 蓝舌病毒组 . 酶联免疫吸附试验检测蓝舌病的研究 J 1 动物检疫 ,1983 , 3:4,9 . () 3 张滋钧 . 用斑点酶联免疫吸附试验测定蓝舌病抗体的研究 J 1 动物检疫 ,1989 , 4:1,514 王健伟 ,姜慧英 ,李晓成 ,等 . 在昆虫细胞中高效表达蓝舌病毒 V P7 蛋白作为组特异性诊断抗原 J 1 病 毒学报 ,1999 ,15 :238,2431 5 Kowali k TF ,Li J K K. Sequence analysis and st ruct ural p redictio ns of double2st randed RNA segment s S1 and V P7 f ro m U nited States p rot ype blueto ngue virus serotype 13 and 10 J 1Virol ,1989 ,172 :189,1951 徐志6 凯 . 实用单克隆抗体技术 M 1 西安 :陕西科学技术出版社 ,19921 7 Li J K K , Yang Y Y. Mapping of t wo immunodo minant antigenic epitopes co nserved amoung t he major inner cap sid p rotein ,V P7 of five blueto ngue virusesJ . Virol ,1990 ,178 :552 ,5591 8 Du Plessis D H , Wang L F ,Jordan F A ,et al . Fine mapping of a co ntinuous epitope o n V P7 of blueto ngue virus overlaping synt hetic pep tides and rando m epitope libraryJ 1Virol ,1994 ,198 :346,3491 Eato n B T , Gould A R , Hyat t A D ,et al . A blueto ngue serogroup2reactive epitope in t he amino terminal half of 9 t he major core p rotein V P7 is accessible o n t he surface of blueto ngue virus particles J 1Virol ,1991 ,180 : 687 ,6961 Wang L F , Hyat t A D , Whiteley P L ,et al . Topograp hy and immunogenicit y of blueto ngue virus V P7 epi2 10 topesJ 1Arch Virol ,1996 ,141 :111,1231 Roy P. Toward t he co nt rol of emerging blueto ngue disease M 1Oxford Virology Publicatio ns ,Lo ndo n ,19911 11 P REPA RATIO N A ND C HA RACTERIZATIO N OF MO NOCLO NAL A NTIBOD IES A GAINST BL UETO NGUE VIRUS VP7 1 1 1 2 2WAN G J ian2wei,J IAN G Hui2ying, HON G Tao,L I Xiao2cheng,L I Yun2gang ( 11 I nst i t u te of V i rology , Chi nese A ca de m y of Preven t i ve M edici ne , B ei j i n g 100052 ; ) 21 I nst i t u te of A ni m al Q u a ra n t i ne , M i nist ry of A g ricul t u re , P. R . C . , Q i n g d ao 265063 , Chi n aAbstract :In o rder to imp rove t he sensitivit y and specificit y of t he diagno sis met ho ds fo r blue2 () to ngue virus B TV,t he p reparatio n of mo noclo nal antibo dies against B TV V P7 were co nducted. Af ter hyperimmunizing BALB/ c mo use using aut hentic B TV1 viro ns and screening wit h reco mbi2 ( )nant B TV13 V P7 antigen , 6 hybrido ma cell lines w hich secret mo noclo nal antibo dies McAb were established. The titers of t he McAbs were high up to 1 ?32 000 000 . Furt her researches showed t hat t he binding of t he McAbs to B TV V P7 co uld be inhibited by B TV reference sera . Then ,a co mpetitive inhibitio n EL ISA was established using t he V P7 antigen and McAb ,p rimary result s showed t hat t he novel co mpetitive EL ISA co uld be in acco rdance well wit h indirect EL ISA . Key words :Blueto ngue virus ; V P7 p rotein ; Mo noclo nal antibo dy ; Preparatio n