吡非尼酮对肝纤维化中基质金属蛋白酶MMP-2表达的影响

吡非尼酮对肝纤维化中基质金属蛋白酶MMP-2达的影响 UDC:xxxx 学号: 2017 届 硕 士 学 位 论 文 (专业学位) 吡非尼酮对肝纤维化中 基质金属蛋白酶MMP-2表达的影响 Effects of pirfenidone on the expression of MMP-2 in human hepatic stellate cells 研 究 生:付汉林 导 师:周力、王燕 教授/主任医师 年 级:2014级 专 业:内科学(消化内科) 二〇一七年五月 贵 州 医 科 大 学 2017 届 硕 士 学 位 论 文 (专业学位) 吡非尼酮对肝纤维化中 基质金属蛋白酶MMP-2表达的影响 Effects of pirfenidone on the expression of MMP-2 in human hepatic stellate cells 论文作者:付汉林 指导教师:王 燕 教授/主任医师 申请学位:临床医学硕士专业学位 培养单位:院(系)名称(楷体小四) 学科专业:学科专业名称见附件(楷体小四) 研究方向:按招生简章填写(楷体小四) 研究起止日期:年 月至 年 月(楷体小四) 论文评阅人:姓名 职称(或填“盲评”)(楷体小四) 答辩委员会主席:姓名 职称(楷体小四) 论文答辩日期:年 月 日(楷体小四) 二〇一七年五月 贵州医科大学学位论文原创性声明 2、不保密?。 作者签名(手写):___________ 导师签名(手写):___________ ____________年____月____日 ____________年____月____日 吡非尼酮对肝纤维化中 基质金属蛋白酶MMP-2表达的影响 专业:内科学(消化内科) 硕士研究生:付汉林 导师:周力、王燕教授 【摘要】 1.目的本研究主要是讨论在活化的人肝星形细胞系(LX-2)中，吡非尼酮对LX-2细胞周期、增殖、MMP-2及胶原蛋白I表达的影响。2.方法2.1 细胞培养 人LX-2细胞株培养在37?含5,CO2的培养箱中，培养基为含10,胎牛血清,100IU/ml青霉素及100IU/ml链霉素的DMEM/F12培养基。当细胞生长并达到85,左右融合程度时候，用0.25,胰酶消化吹打制成单细胞悬液并传代，传至3-4代后，用于一下进一步实 -2后，观察倒置显微镜下细胞形态的变化; 2.3吡非尼酮验。2.2吡非尼酮作用于LX 作用于LX-2 后，CCK-8法检测细胞增殖的变化;2.4免疫印迹法(Western Blot)检测吡非尼酮对LX-2蛋白表达的影响;2.5定量PCR检测吡非尼酮作用后MMP-2及胶原I表达的变化;2.6统计分析采用SPSS 17.0软件进行，扫描条带用KONTRON IBAS 2.0全自动图像分析系统进行半定量分析。3.结果3.1细胞形态显微镜下可见，未经吡非尼酮处理的LX-2细胞大小均匀，多呈多角、伪足的星形。吡非尼酮(100,200uM)处理后，细胞形态变小，伪足缩短，细胞数目减少。3.2 CCK-8法与对照组相比，吡非尼酮为10M时，细胞增殖改变不明显(p=0.05); 吡非尼酮浓度100M时，则抑制作用显著(p<0.01)。随着吡非尼酮浓度增加，抑制作用呈进行性下降。故吡非尼酮对LX-2细胞的抑制作用具有浓度依赖性。3.3 免疫印迹结果吡非尼酮(0,100M、200M)作用于细胞24h后，与对照组相比，MMP-2的表达减少，在100uM时明显减少，吡非尼酮浓度为100M时具有明显差异性(p<0.01)。3.4 定量PCR结果 吡非尼酮(0,100M、200M)作用于细胞24h后，Collagen I (实验组/对照组)的相对表达量减少，且具有浓度依赖性，吡非尼酮浓度为100M时具有明显差异性(p<0.01)。MMP-2 (实验组/对照组)的相对表达量减少，且具有浓度依赖性，吡非尼酮浓度为100μM时具有明显差异性(p<0.01)。4.结论4.1 吡非尼酮作用LX-2 24h后，细胞形态发生改变;4.2 吡非尼酮作用LX-2 24h后，可以抑制LX-2细胞增殖,并且抑制作用具有浓度依赖性;4.3 吡非尼酮抑制LX-2中 MMP-2的表达和Collagen I mRNA的合成，并具有浓度依赖性。 【关键词】肝星形细胞(LX-2)，肝纤维化，吡啡尼酮，细胞增殖，MMP-2，胶原I。 Effects of pirfenidone on the expression of MMP-2 in human hepatic stellate cells Major: Gastroenterology Postgraduate: HanLin Fu Supervisor: Prof.Yan Wang [Abstract] 1. PurposeTo study the in vitro effects of pirfenidone on cell cycle, proliferation, the expression ofMMP-2 and collagen type I in cultured human hepatic stellate cell line, LX-2cells. 2 Materials and methods 2.1 Cell culture LX-2 cells were cultured in the DMEM/F12 media containing 10% fetal bovine serum，100IU/ml penicillin and 100IU/ml streptomycin combination in incubator at 37? with 5% CO2. After the cells grew and reached 80% confluence, then digested with 0.25% trypsin and passaged to 2-3 generations for experiences. 2.2 After treatment of LX-2 cells with pirfenidone, observe the morphological changes of LX-2cells by microscope. 2.3 After treatment of LX-2 cells by pirfenidone, cell proliferation was evaluated by CCK-8 assay kit . 2.4 The expression of LX-2 protein was detected by Western Blot. 2.5 Quantitative polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression of MMP-2 and collagen type I. 3 Results 3.1 The morphologic changes of LX-2cells The cells had the uniformity size and presented slender or stellate shapes without pirfenidone. When the concentrations of pirfenidone were increased to 100M, the spacing between cells became wider and cell number decreased gradually. 3.2 CCK-8 assay CCK-8 assay indicated that the concentration of pirfenidone (10M) had no obvious inhibiting effect (p=0.05) on cell proliferation. But the concentration of pirfenidone (100M) presented obvious inhibiting effect (p<0.01). It demonstrated that the inhibition of pirfenidone on LX-2cells was concentration dependent. 3.4 Western Blot As compared the immunoblotting bands with their quantitative scanning results, we found that when 100M pirfenidone acted for 24h, the expressions of HSP47 proteins obviously diminished in LX-2 cells . The concentration of pirfenidone (100M, 200M) presented obvious inhibiting effect (p<0.01). 3.5 Quantitative PCR Compared with the control group ,pirfenidone had a dose-dependent effect on the MMP-2 and Collagen type I mRNA expression in the MMP-2 after incubation for 24 h. The concentration of pirfenidone (100M, 200M) presented obvious inhibiting effect (p<0.01). 4 Conclusions 4.1 Pirfenidone can change the shapes of LX-2cells. 4.2 Pirfenidone can inhibit LX-2 cells proliferation, which is concentration dependent. 4.3 Pirfenidone inhibited not only the expression of Collagen type I expression but also the expression of MMP-2. [Key Words] hepatic stellate cells (LX-2); hepatic fibroblast; cell proliferation; MMP-2; Collagen type I; 目 录 原创性声明和版权使用授权 „„„„„„„„„„„„„„ ? 中文摘要 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ ? 英文摘要 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ ? 目录 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ ? 略缩词表 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ ? 引言 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 01 与方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 01 结果 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 02 讨论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 02 结论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 03 参考文献 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 04 综述 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 07 作者简历 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 09 致谢 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 11 学位论文数据集 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 13 附:临床能力考核相关材料 英文缩略词表 英文缩略词 英文全称 中文全称 Acry acrylamide 丙烯酰胺 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PVDF polyvinglidence difluoride 聚偏二氟乙烯 RNase ribonuclease 核糖核酸酶 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 TBS Tris-buffered saline 三羟甲基氨基甲烷缓冲液 TBST Tween Tris-buffered saline 吐温-三羟甲基氨基甲烷缓冲液 Tris Tris(hydroxymethyl) aminomethe 三羟甲基氨基甲烷 PDGF platelet-derived growth factor 血小板源性生长因子 TGF-β1 transforming growth factor-β1 转化生长因子β1 0 引 言 肝纤维化是指细胞外基质过度沉积的过程, 是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应[1]。是肝硬化发生、发展的病理基础。它包括了肝细胞的凋亡、间充质细胞的增殖、细胞外基质中?型胶原蛋白; ?型胶原蛋白的沉积等过程[2]。其中肝星状细胞(HSC)的激活扮演了重要的角色，是肝纤维化发生过程中的一个重要事件，同时各类细胞因子与其对应受体，以及各类炎症细胞均在纤维化发展过程中有着重要的作用。因此，肝星状细胞已成为肝纤维化治疗的主要目标[3]。基质金属蛋白酶(matrix metall proteinase, MMP)是一类钙离子依赖性的蛋白酶. HSC是MMP-2, MMP-9, MMP-13主要来源[4]。MMPs能够降解ECM中大多数的蛋白成分，进而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中有着关键的作用，是这个过程中重要的蛋白水解酶。MMP-2基因由13个外显子和12个内含子所组成，位于人类染色体16q21，表达的酶原分子量约 72KD 大小。研究表明,特异性降解I、III型胶原的间质胶原酶是造成肝纤维化、肝硬化形成主要原因之一。在肝纤维化过程中MMP-1基因表达不显著，并且TIMP-1表达一定程度的增强,从而造成MMP-1的降解活性降低，同时MMP-2的活性升高，使以IV型胶原酶为主的Disse腔隙基底膜破坏，造成增生的ECM特别是I和III型胶原降解减少，沉积增多,促进了肝纤维化乃至肝硬化的形成[5]吡非尼酮 (pirfenidone, PFD)是近年来国外研究较多的一种新的具有广谱抗纤维化作用的吡啶酮类化合物，对肺、肾、心脏、肝脏等器官纤维化均有很好的治疗作用[ 6-9] 。其可以降低胶原的分泌，从而抑制纤维化的进展，这一点在肺、肾、肝、心血管及眼纤维化[10-16]等的体内实验中都已得到了证实。目前已用于特发性肺纤维化的治疗[17]。肝纤维化是一个细胞外基质生成与降解的动态平衡过程。细胞外基质的降解在肝纤维化过程中是一个可以调控的过程。因此治疗肝纤维化，减缓、阻止乃至逆转其病理进程，已成为治疗肝硬化的重要手段。激活的 基质金属蛋白酶MMP- 2 能够降解肝窦状隙内皮下基质从而促使肝星状细胞( hepatic stellate cells, HSCs) 活化，进而促进肝纤维化的形成与发展。目前已有研究表明，在肝硬化患者中，MMP-2的表达可以显著上升[18]。MMP-2一旦激活，即可降解细胞周围的基底膜的正常基质成分如 IV 型胶原、打破细胞与细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 之间相互关系的平衡，对于 HSCs 来说，相当于于破坏了维持 HSCs 处于静止状态所必须的基底膜样的基质环境，从而HSCs 得以激活并且增殖，同时大量产生包括纤维胶原 I、III 型在内的 ECM，促进肝纤维化的形成与发展。证明了MMP- 2 的活化及表达升高对肝纤维化的形成与发展具有促进作用。因此，抑制MMP的表达能有效降低胶原蛋白I的合成及分泌， 对于治疗肝纤维化具有重要的意义。吡非尼酮作为新型的抗纤维化药物，已经应用于 特发性肺纤维的临床治疗中。但在肝纤维化中，吡非尼酮的疗效及作用机制尚不明 确。 基于以上目的，本研究通过将不同浓度的吡非尼酮作用于人的肝星形细胞系LX-2细胞 中，观察细胞形态的改变，并对细LX-2细胞的增殖、MMP-2蛋白及胶原I的表达进行 研究，从而进一步明确吡非尼酮在治疗肝纤维化中的作用及机制。 1 材料与方法 1.1实验对象 人肝星形细胞系LX-2细胞株采购于中科院细胞库(上海); 1.2主要实验试剂 DMEM/F12培养基 Hyclone公司 小牛血清(FBS) 四季青公司 胰蛋白酶 AMRESCO公司 青链双抗 上海生工 二甲基亚砜 (DMSO) Sigma RNase-A 广州鼎国生物公司 碘化吡啶(PI) 广州鼎国生物公司 PVDF膜 Millipore公司 吡非尼酮 Sigma BCA-100蛋白定量测定试剂盒 申能博彩生物科技有限公司 细胞蛋白提取液 perice 丙烯酰胺(Acr) Pharmacia 过硫酸铵(APS) 广州化学试剂厂 十二烷基磺酸钠(SDS) Pharmacia 四甲基乙二胺(TEMED) Pharmacia 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Pharmacia 吐温-20(Tween-20) 广州化学试剂厂 显影剂 广州化学试剂厂 酸性定影剂 广州化学试剂厂 二硫苏糖醇(DTT) Amersham公司 碘乙酰胺 Amersham公司 N ,N’- 亚甲双丙烯酰胺 (Bis) Sigma 公司 甘氨酸(Glycine) Amersham公司 溴酚蓝 (Bromophenol blue) Amersham公司 分子量蛋白溶液 Amersham公司 考马斯亮蓝R-350片 Amersham公司 甲醇 Sigma公司 乙酸 Sigma公司 氯化钠 MBCHEM公司 氯化钙 MBCHEM公司 无水乙醇 广州新成精细化工厂 考马斯亮蓝G-250 MBCHEM公司 Tris-Base MBCHEM公司 甘氨酸 MBCHEM公司 KCl 天津大茂化学试剂厂 KH2PO4 广州新成精细化工厂 Na2HPO4.12H2O 广州新成精细化工厂 NaHCO3 天津大茂化学试剂厂 NaOH 广州新成精细化工厂 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus) TAKARA Trizol TAKARA 1.3 主要实验仪器 超净工作台 苏州安泰有限公司 CO2培养箱 Sheldon公司 电热式隔水恒温箱 苏州安泰有限公司 电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司 鼓风干燥箱 上海佳胜实验设备有限公司 磁力搅拌器 IKA公司 Milli-Q超纯水系统 法国Millipore公司 分析天平 瑞士Mettler公司 调速多用振荡器 北京六一仪器厂 倒置生物显微镜 Topcon公司 UV-1601型分光光度计 日本岛津公司 光学显微镜 Olympus公司 六孔细胞培养板 Corning公司 96孔细胞培养板 Corning公司 细胞计数板 华美公司 25cm2培养瓶 Corning公司 75cm2培养瓶 Corning公司 15ml离心管 Corning公司 冻存管 Corning公司 0.22μm微孔滤膜 Millipore公司 微量移液器 Eppendorf公司 超声波细胞粉碎机JY92-2D 宁波新芝生物公司 MetertechΣ960酶标仪 Sigma公司 MM-2微量振荡器 金坛市医疗仪器厂 MULTYCYCLE软件 美国PHEONIX公司 台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司 台式常温离心机 德国Eppendorf公司 摇床 Bellco Glass公司 调速多用振荡器 北京六一仪器厂 PC-420磁力加热搅拌器 Corning公司 UV-1601型分光光度计 日本岛津公司 Mini-PROTEIN垂直平板电泳 Bio-Rad 直流稳压电泳仪 Bio-Rad 垂直平板微电泳槽 Bio-Rad PVDF膜 Amersham 公司 图像扫描仪(Imagescanner?) Amersham 公司 图像分析软件(Melanie 4) Amersham 公司 KONTRON IBAS 2.0全自动图像分析系统 Amersham 公司 MX3000P实时荧光定量PCR仪 Stratagene 1.4主要试剂的配制 1)细胞培养液配制 从Hyclone的DMEM/F12细胞培养液500ml中吸出50ml，加入50 ml加入新生小牛血清 至血清终浓度为10,，青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。 2)PBS (PH 7.0-7.2) 4?保存 KCl 0.2g KH2PO4 0.2g NaCl 8.0g Na2HPO4?12H2O 3.49g 三蒸水 1000ml 高压蒸汽灭菌 3)0.25%胰酶溶液(PH 7.0) -20?保存 Trypsin 0.25g PBS 100ml 磁力搅拌器搅拌，促使胰蛋白酶粉溶解，除菌，分装，保存备用。 4)细胞冻存液 4?保存 DMSO 1ml 新生小牛血清 9ml 5)2×蛋白上样缓冲液 4?避光保存 Tris-HCl(PH 6.8) 2ml 甘油 2ml 20%SDS 2ml 0.1%溴酚蓝 0.5ml β-巯基乙醇 1ml 去离子水 2.5ml 6)10×电泳缓冲液(PH 8.3 ) 室温保存 Tris 30.3g 甘氨酸 144g SDS 10g 去离子水 定容至 1000ml 使用时去离子水1:10 稀释 7)10×电转液缓冲液(PH 8.5 ) 4?保存 Tris 30.0g 甘氨酸 144.0g 去离子水 定容至1000ml 使用时去离子水1:10 稀释，加入甲醇，使溶液中甲醇浓度为20% 8)10×TBS(Tris-buffered solution) 溶液(PH7.6) 室温保存 Tris 24.2g NaCl 80.0g 去离子水 定容至 1000ml 使用时去离子水1:10 稀释 9)TBST 溶液 室温保存 1×TBS 1000ml TWeen-20 1ml 10)封闭液(Blocking Buffer) 室温保存 1×TBST 10ml 脱脂奶粉 0.5g 11)0.5%考马斯亮蓝R-250 染色液 室温保存 考马斯亮蓝R-250 染色粉 0.25g 甲醇 230ml 冰醋酸 40ml 去离子水 定容至1000ml 12)10×TBE电泳缓冲液(PH8.0) 室温保存 Tris碱 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml 去离子水 定容至1000ml 13)淬灭液(Stripping Buffer)(PH6.8) 室温保存 Tris 7.6g SDS 20.2g 2-巯基乙醇 7.0ml 去离子水 定容至1000ml 14)SDS溶液(10%) 用0.45μm的滤纸过滤，室温保存 SDS(Fw 288.38) 5.0g 去离子水定容至50ml 15)过硫酸铵(10% Ammonium persulphate，APS)溶液(10%) 过硫酸铵(Fw228.20) 0.1g 去离子水定容至1ml 用前新鲜配制 16)聚丙烯酰胺凝胶(10%) 去离子水 4ml 30%丙烯酰胺单体贮存液 3.3ml pH8.8 1.5M Tris-Cl buffer 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%APS* 0.1ml TEMED* 4µl 最终体积 10ml * TEMED 和APS最后加，且加入后迅速混匀，立即灌胶 2.实验方法 2.1细胞培养 将肝星形细胞(LX-2)培养在含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素及100 IU/ml链霉素的DMEM培养基(Hyclone,F-12)中,培养于37?、5%CO2的培养箱中，当在显微镜下细胞铺满视野约80%，存在相互接触并融合时需及时传代，用0.25%的胰酶消化传代，传至2-3代后,用于后续实验。 2.4细胞形态学观察 将吡非尼酮溶于灭菌的去离子水中，使其浓度为1mg/ml，置于60?水浴箱中，使其充分溶解。将对数生长期细胞制成单细胞悬液，以每孔1×106细胞接种于6孔板中，每孔培养液约2ml。待细胞密度达到80%-85%时，小心吸出培养液，用PBS洗涤三遍，将培养基更换为无血清、无双抗 的DMEM/F12培养基,并分别用含有浓度为0(空白对照)，100,200uM的吡非尼酮处理24小时，并观察细胞形态的变化。 2.5细胞增殖 细胞以1×103个/孔接种于96孔培养板中培养，待细胞长至约85%左右融合后，遵照以上方处理细胞。每组设置3个复孔。24h后，每孔加入CCK-8溶液10μl，并且以相应量细胞培养基和CCK-8溶液作为空白孔，继续在培养箱中孵育2h，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值。以上实验重复3次，取平均值。 2.6蛋白免疫印迹测定LX-2表达 2.6.1样品的制备 将LX-2接种于6孔板中，细胞密度设定为为1×106/孔，待细胞密度达到80%左右时，将培养基更换为无血清、无双抗的DMEM培养基，并分别用含有浓度为0(空白对照),100,200uM的吡非尼酮处理24小时，后，收集培养细胞加入30μl蛋白裂解液(0.02μMTris-HCL)，用细胞刮收集细胞于EP管中，于-20?反复冻融三次后，以12000rpm 4?离心30min，取上清即为细胞可溶性蛋白，-20?保存， BCA法测蛋白浓度。 2.6.2 样品的准备 按蛋白20μg/孔的上样量上样，把2×蛋白上样Buffer与样品以1:1充分混合置于EP管中，盖紧，煮沸5min，然后1000 rpm离心一分钟。 2.6.3 SDS-PAGE(Polyacrlamide Gel Electrophoresis)电泳 ? 清洗电泳玻璃板:用清洁剂对电泳玻板进行清洗，用清水冲洗干净后，再次用去离子水冲洗，清洗后的玻璃板应不挂水珠，并晾干。 ? 装板:用间隔为1.0mm的厚薄两块玻板，将底面对齐整，垂直装置并予以固定。 ? 配制10,的分离胶:总体积为7.5ml(供一块胶用)，轻轻搅拌均匀，需要注意不要产生气泡。 ? 灌分离胶:迅速将配制好的分离胶沿着玻板壁缓慢的加入两块玻板之间(不要产生气泡，灌胶要尽量均匀)，上界面至离前面玻板约1cm时停止，并可加适量正丁醇以方便丙烯酰胺聚合和分离胶上面的平整，于室温下静置15,30min，若丙烯酰胺出现聚合，可观察到凝胶与正丁醇之间出现明显分界。此时倒出正丁醇，用去离子水冲洗数次，并用滤纸吸干。 ? 配制5,浓缩胶:总体积3ml(一块胶)，轻轻搅拌均匀，注意不要产生气泡。 ? 灌浓缩胶:将混合均匀的浓缩胶沿着玻板壁缓慢的加在分离胶上面，加至玻璃板的上缘，然后插上梳子，梳子尽可能的插到底，排除气泡，室温下静置15,30min。 ? 加电泳缓冲液:量约400ml，液面没过电泳槽下面铜丝线，观察内槽是否漏水。取下梳子，将电泳槽与电泳仪相连(红极对红极，黑极对黑极，注意勿接反)，调节电压为60V，使未加样的胶电泳约3分钟，以降低胶中的APS含量。 ? 加样:用微量加样器吸取已准备好的样品，加到加样孔底部。两边的第一和第六泳道一般不加样品，加约5μl的2×上样缓冲液，以防边缘效应，第二道加预染Marker。 ? 电泳:将电泳槽和电泳仪相连，方法同?，浓缩胶以60V的恒压电泳，当预染Marker各条带开始分开时，换以120V的恒压电泳。当溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时，关闭电源，时间大约持续1.5小时。 2.6.4浸入式电转移 ? 电泳期间准备PVDF膜和Whatman滤纸。切出与凝胶大小相同的PVDF膜和比凝胶稍大的Whatman滤纸，用无水甲醇浸泡PVDF膜15s，再转入电转液中平衡20分钟。 ? 电泳结束后卸胶:取出电泳玻板，小心取出凝胶，在凝胶的右上角切去一角以标记方位。 ?电泳仪上的装架:从黑极到白极放置的顺序依次为一块纤维垫，三张Whatman滤纸、凝胶、一张PVDF膜、三张Whatman滤纸、一块纤维垫(注意在装架过程中每一层之间不要留气泡，可用玻棒在各层间滚动赶出气泡)。将正极(透明为正极)盖上，用手捏住右下角，固定不动，再把夹子夹起，置于装有转移缓冲液的转移槽中，黑极对黑极，需注意不要装反。 ? 接通电源，恒流85mA，电转1.5h。 ? 电转结束后取出PVDF膜，将SDS-PAGE胶以考马斯亮蓝染色。 2.6.5免疫印迹反应 1)取出PVDF 膜，尽快浸入 1×TBS 液中，摇床，10min。 2)5%脱脂奶粉-TBST封闭液室温摇床孵育2h。 3)1×TBST液洗膜三次，摇床，每次5min。 4)MMP-2抗体用TBST稀释为 1:1000，4?过夜。 5)1×TBST液洗膜三次，摇床，每次 5min。 6)二抗孵育:将辣根过氧化物酶标记的MMP-2抗体(1:15000)加入到TBST中，室温摇床孵育1h。 7)1×TBST液洗膜三次，摇床，每次5min。 8)准备保鲜膜、滤纸、暗盒。洗膜结束后，将PVDF 膜与5ml的LumiGLO (4.5ml 去离子水，0.25ml的20 ×LumiGLO 发光试剂，0.25ml的20×过氧化物)作用20s。 9)PVDF膜沥干后用保鲜膜包裹，置于暗盒内，于成像系统视发光强度曝光1,15min。 10)曝光后的PVDF 膜用淬灭液淬灭，室温摇床1h，再用 1×TBST液洗膜三次，封闭液封闭2h，加小鼠抗GAPDH(1:10000)室温摇床孵育2h，洗膜，加MMP-2抗体(1:15000)室温摇床孵育1h，其余同前。 以上实验重复三次。 2.6.6 统计学分析和图像处理 采用SPSS 17.0 for windows软件包中的单因素方差分析法(ANOVA)对数据进行统计分析，所得数据以平均值?标准差(?s)表示;用两组样本均数t检验的方法分别进行组间和组内比较，显著性检验水准以p < 0.05为有统计学差异。 以KONTRON IBAS 2.0全自动图像分析系统对扫描条带进行半定量分析，以条带面积与光密度值的乘积作为分析指标。 2.7.定量PCR测吡非尼酮处理后Collagen type ?mRNA表达的变化 2.7.1 RNA的提取 1.收集细胞后加入1ml Trizol溶液，用涡旋器混匀或枪头吸打混匀，室温放置5min; 2.加入200μl氯仿，用手剧烈振荡15秒，室温静置15min; 3. 4?下，10,000g离心3min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管; 4.加入0.5倍体积异丙醇，涡旋充分混匀; 5.4?下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，去上清; 6.加入1ml 75,乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清; 7.室温晾干或真空干燥，加入30-50μl DEPC水溶解沉淀。 2.7.2去基因组 使用RNase-free的DNase ?，按以下体系配置反应液，37?消化30min，65?灭活10min。 RNA DNase? 10xbuffer H2O(RNasefree) 60µL 20µL 20µL 100µL 总体积 200µL 然后按以下步骤操作: 1)加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清。 2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清。 3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20?静置15min; 4)4?下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清; 5)用75,乙醇洗涤两次，超净台风干; 6)加入15-40μl DEPC水溶解沉淀。 2.7.3纯度检测及电泳检测 1)纯度检测:取1μl RNA样品60倍稀释，在Beckman Coulter DU? 520UV/Vis Spectrophotometer上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。 2)电泳检测:取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。 2.7.4逆转录 1)在RNase free的PCR管中加入1 µg RNA，加DEPC水补充至12ul，吹打均匀后，置65?保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性; 2)在该PCR管中加入下列试剂(Promega) Oligo(dT) Randomprimer 10mMdNTP RNaseinhibitor 5xbuffer M-MLV 0.5µL 0.5µL 2.0µL 0.5µL 4.0µL 0.5µL 总体积 8.0µL 将上述20μl反应溶液30?保温10min;42?保温60min;72?保温10min。 2.8.5定量PCR 1、引物设计 Gene Sequence GAPDH F primer CATGAGAAGTATGACAACAGCCT R primer AGTCCTTCCACGATACCAAAGT SIZE:113BP MMP2 F primer CTGCGGTTTTCTCGAATCCATG R primer GTCCTTACCGTCAAAGGGGTATCC SIZE:96BP Col1 F primer TGTTGCTGCTTGCAGTAACCTTATG R primer TGGTCCTCTATCTCCGGCTGG SIZE:92BP 2、反应体系: cDNA(1:20) 上游引物 下游引物 2x SYBR Green PCR Master Mix dH2O 5.0µl 0.5µl 0.5µl 10µl 4.0µl 总体积 20µl 3、反应条件: 95? 5分钟; 95? 15秒，60? 15秒，72? 32秒;40个循环(72? 32秒收集荧光信号) 融解曲线分析:温度60?-95?。 采用SPSS 17.0软件对数据进行配对t检验，所得数据以平均值?标准差(?s)表示，p<0.05表示差别有显著性意义。 2 结 果 2.1、吡非尼酮对LX-2细胞形态的影响 将LX-2细胞接种于DMEM/F12培养基(含10,FBS，青链霉素)培养，于4h后可以观察到细胞贴壁、延伸、伸出伪足，2天生长成片，细胞大小均匀，呈细长形或多伪足的星形，约2天即可长满融合。LX-2细胞以1×105传代种于6孔板中，培养一天后细胞贴壁，将培培养基更换为无血清、无双抗 的DMEM/F12培养基,并分别用含有浓度为0(空白对照)，100,200uM的吡非尼酮处理24小时，并观察细胞形态的变化。24h后(如图1所示)，与对照组相比，吡非尼酮(100,200uM)处理后的细胞形态变小，伪足缩短，细胞数目减少，但不明显。 图 1 不同浓度吡非尼酮处理LX-2细胞24h后，细胞的形态变化 Figure.1 Morphological changes of LX-2 after treatment with pirfenidone under the optical microscope . 2.2、吡非尼酮对LX-2细胞增殖的影响 用CCK-8法观察细胞增殖的变化，可以观察到吡非尼酮对LX-2细胞的增殖具有明显抑制作用(p<0.01)，且这种抑制作用具有一定的浓度依赖性。(如图2所示). 0 100 200 400 800 A 0.92 0.93 0.89 0.82 0.77 B 0.95 0.94 0.91 0.82 0.71 C 0.91 0.85 0.79 0.75 0.66 平均值 0.93 0.91 0.86 0.80 0.71 图2.不同浓度吡非尼酮处理LX-2细胞24h后，CCK-8测定细胞增殖的变化 . Figure.2 Proliferation of LX-2 after treatment with pirfenidone for 24h as measured by CCK-8 assay. 2.3、吡非尼酮对于LX-2细胞MMP-2表达的影响 吡非尼酮(0,100,200uM)处理细胞24h后，收集细胞样品提取蛋白进行Western Blot实验，并以GAPDH为内参(如图4-1)，三次重复实验，半定量分析结果表明(如图4-2)，与对照组相比，MMP-2蛋白的表达在实验组显著减少(p<0.01)，并且具有一定的浓度依赖性。 图4-1 图4-2 图4. 不同浓度吡非尼酮处理LX-2细胞24h后，Western Blot检测MMP-2蛋白表达的变化 Figure .4 Western blotting forMMP-2 protein production in LX-2showing protein production after 24 h incubation with pirfenidone(0,100,100uM). 2.4、吡非尼酮对于LX-2细胞胶原I mRNA、MMP-2表达的影响 吡非尼酮(0,100,200uM)处理细胞24h后，收集细胞样品提取RNA进行定量PCR实验，并以GAPDH为内参(如图5-a)，三次重复实验，定量分析结果表明(如图5-b)，吡非尼酮抑制MMP-2及胶原I mRNA的表达(p<0.01)，这种抑制作用具有浓度依赖性。 图5(a) 图5(b) 图5(a)(b).不同浓度吡非尼酮处理LX-2细胞24h后，PCR检测MMP-2及胶原I表达的变化。 Figure.5 Effects of pirfenidone on collagen type I mRNA expression in LX-2 and MMP-2 for 24h detected by RT-PCR. 3.讨论 3.1肝纤维化的终末期能够引起门脉高压及肝衰竭的肝硬化。由于肝纤维化具有可逆性，因此出现了大量治疗肝纤维化的治疗，包括干细胞的注射治疗及对乙肝和丙 肝病毒携带者进行抗病毒治疗，然而目前为止尚未找到一种特殊有效的治疗肝纤维化的药物[21]。 3.2吡非尼酮是一种口服的小分子生物药物，具有抗纤维化及抗炎的特征，其这一特征已经应用于特发性肺纤维化的临床治疗[22, 23]。目前研究认为其抗肝纤维化作用与以下几个方面有关 [ 8] :(1)抑制脂质过氧化 ;(2)减轻炎症反应 ;(3)抑制肝星状细胞 (HSC)活化 、增殖 ;(4)调节 ECM的合成与降解。体外研究证实，吡非尼酮抑制PDGF诱导下的肝星形细胞的增殖，并且抑制TGF-β1刺激引起的胶原I的分泌[17]。最新研究表明，吡非尼酮抑制肝纤维化中Th2的增殖及其反应[24]。肝纤维化的发生是由多条细胞信号通路和多种细胞因子共同参与的全身性的病理过程，因此吡非尼酮抑制肝纤维化中胶原分泌的具体机制仍需进一步明确。 3.3在本研究中，吡非尼酮抑制LX-2细胞增殖，并且这种抑制作用具有一定的浓度依赖性。吡非尼酮处理LX-2细胞24h后，在光显微镜下观察细胞可见细胞变小，细胞数目减少。 3.4我们通过Western blot 和Q-PCR的检测发现，吡非尼酮抑制LX-2中MMP-2蛋白的表达和胶原I mRNA的产生。MMP-2属于基质金属蛋白酶，参与在肝纤维化进程中细胞外基质的沉积过程，且参与胶原的合成与分泌过程。 3.5现研究表明，在以胶原异常沉积为主的纤维化器官中，MMP-2的表达增加，其活化能够引起细胞外基质中的两种最重要蛋白——胶原I和胶原III的降解减少。降低肝纤维化MMP-2的表达，减少胶原I的表达，已成为防治器官纤维化的治疗方法之一。 3.6我们研究发现吡非尼酮抑制LX-2中MMP-2的表达和胶原I mRNA的产生，并且这种抑制效应具有浓度依赖关系，在100uM时，这种抑制效应更加明显。这表明吡非尼酮在治疗肝纤维化的过程中，可能通过同时抑制MMP-2的表达和胶原I的产生，减少胶原的分泌，从而减少细胞外基质的沉集，进而起到抗纤维化作用。 4(结论 我们研究发现，吡非尼酮抑制人LX-2细胞增殖，抑制MMP-2蛋白表达和胶原I的形成。因此，吡非尼酮将可能成为抑制肝星形细胞中MMP-2蛋白表达和胶原分泌的主要药物，并成为治疗肝纤维化的有效药物，进而为肝硬化的预防及治疗提供有效的方法及途径。 参考文献 1. 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