人参水提物对β淀粉样蛋白诱导shsy5y细胞凋亡的保护作用

人参水提物对β淀粉样蛋白诱导shsy5y细胞凋亡的保护作用 人参水提物对β淀粉样蛋白诱导SHSY5Y细胞 凋亡的保护作用 作者:胡胜全 余惠旻 刘塔斯 杨大坚 陈新滋 何翠君 【摘要】 目的研究人参水提物(water extracts of Ginseng, WEG)对β淀粉样蛋白(Aβ2535)诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用。方法用Aβ2535诱导体外培养的SHSY5Y细胞凋亡，并用WEG进行保护。MTT法检测细胞存活率，Hoechst33258染色观察细胞形态的变化，流式细胞仪分析亚二倍体峰和DNA含量，检测细胞凋亡。结果Aβ25-35 50 μmol/L诱导SHSY5Y细胞72 h后，镜下观察到细胞变圆，损伤并聚集，Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光，流式细胞仪检测到明显的亚二倍体峰，凋亡率达(37.30?0.69)%。而Aβ25-35和不同浓度的WEG(1，5，10，15 mg/ml)同时处理后，细胞形态明显改善，MTT值显著高于Aβ25-35处理组(P<0.01)，流式细胞仪检测凋亡率分别降低到(14.70?3.18)%，(7.23?1.51)%，(6.14?0.40)%，(5.88?1.33)%，呈现剂量依赖关系。结论人参水提物对Aβ2535诱导的SHSY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。 【关键词】 SHSY5Y细胞; Aβ2535; 人参水提物; 细胞凋亡 Abstract:ObjectiveTo study the neuroprotective effects of water extract of Ginseng on SHSY5Y cell apoptosis induced by Amyloid β peptide .MethodsSH-SY5Y cells were treated with Aβ25 35 to induce apoptosis in vitro, water extract of Ginseng was added into the culture to test its neuroprotective effects. The cell viability was measured by MTT test,the morphology of SHSY5Y cells was observed by Hoechst33258 staining and DNA content by FCM. ResultsTreated by Aβ25-35 50μmol/L 72h later, SHSY5Y cells turned rounder , aggregated and were positively stained with fluorochrome Hoechst 33258.Cells displayed a typical subdiploid peak in flow cytometry ,and the percentage of apoptosis was (37.30?0.69)%(P<0.01). When incubated with Aβ2535μmol/L and different concentrations(1，5，10，15 mg?ml-1) of WEG for 72 h, the characteristics of apoptosis as measured by FCM dosedependently declined to (14.70?3.18)%,(7.23?1.51)%,(6.14? 0.40)% and (5.88?1.33)% respectively (P<0.05).ConclusionWater extract of Ginseng has marked neuroprotective effects on SH-SY5Y cell apoptosis induced by Aβ2535. Key words:SH-SY5Y cells; Amyloid β peptide; WEG; Apoptosis 阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease，AD)，俗称老年痴呆症，为常见的中枢神经系统退行性疾病，是一种在正常意识状态下丧失智能能力的疾病。随着全球人口老龄化的程度加快，AD等神经退行性疾病在老年人中的发病率居高不下，给社会和家庭带来了沉重的负担。由于AD发病机制复杂，目前临床用于治疗AD的药物均只对发病过程中的某一或某几个环节起效，但副作用大。中药由于在防治AD等老年性疾病方面有丰富的实践经验及毒性相对小等潜在优势，越来越受到医学界的重视和推崇。本课选择包含Rg1，Rb1等众多具有益智作用成分的人参，以中医药理论为指导，按照中药的传统煎煮法，制成水提物冻干粉，以Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡作为神经元损伤的体外模型，观察人参水提物对神经元的保护作用。 1 材料与方法 1.1 试剂Aβ25-35 (Sigma公司);1640培养基(Gibico公司);FBS(Hyclone公司);Trypsin(Gibico公司);MTT(Sigma公司);DMSO(Sigma公司);Hoechst33258(Fluka);PI(Sigma公司);RNase(sigma公司);人参(深圳华辉药业有限公司，产地吉林，经湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为人参)。 1.2 仪器CO2培养箱，美国Shellab;倒置荧光相差显微镜，德国Leica公司(型号:DC300);超净工作台，ESCO公司;离心机，德国Hettich 公司(型号:Rotofix32);低温离心机，美国Coulter公司(型号:AllegraTM 21R);流式细胞仪，美国Coulter公司(型号:Epics XL);酶标仪，德国BMG公司(型号:Polar star Galaxy)。 1.3 药物制备 1.3.1 人参水提物取100 g人参粉碎，加8倍蒸馏水浸泡30 min，水浴2 h，纱布过滤，滤渣先后加6倍，4倍量水，各提30 min。3次滤液合并，冷冻干燥，得到40 g冻干粉，得率40%。冻干粉溶于灭菌去离子水，12 000 g，离心5 min，上清液过0.22 μm的滤膜，培养基稀释成实验所需浓度(以生药浓度计)。 1.3.2 Aβ25-351 mg Aβ25-35溶于943 μl灭菌去离子水，配制1 mmol/L的母液，-20?保存，用前37?老化7 d，培养基稀释成实验所需浓度。 1.4 细胞培养及预处理SH-SY5Y细胞取自本实验室细胞库。用含有体积分数为10%的FBS，1%的NEAA(非必需氨基酸)的1640完全培养基，于37?，5%的CO2孵箱中培养。4 d进行1次传代，传代按1?3进行。取生长期细胞进行实验。 1.5 实验分组将细胞分3组。正常对照组:常规加入完全培养基; Aβ25-35模型组:加入Aβ25-35;WEG保护组:同时加入Aβ25-35和不同浓度的WEG。 1.6 观察指标和方法 1.6.1 倒置显微镜观察细胞形态SH-SY5Y 以7×104 cells/ml密度接种于6孔板，模型组用终浓度为0，5，10，25，50 μmol/L 的Aβ25-35分别作用24，48，72 h，WEG保护组用0，1，5，10，15 mg/ml WEG 与Aβ25-35共同孵育(Aβ25-35作用浓度和时间点根据上述结果而设)，每组均3个复孔，于倒置显微镜下观察并拍照。 1.6.2 MTT测定细胞存活率取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×104 cells/ml，以100 μl/well接入96孔板，37?，5%的CO2孵箱中培养36 h。36 h后吸弃旧培养基，正常对照组加入100 μl的新鲜培养基，Aβ25-35损伤组加入100 μl含有Aβ25-35的培养基，WEG保护组加入100 μl含有Aβ25-35和不同浓度的WEG的培养基，各浓度6个复孔。药物作用68 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(PBS配)10 μl，4 h后，弃培养液，加DMSO150 μl/孔，轻轻振荡10 min，使甲臢颗粒溶解，用酶标仪在570 nm处读取吸光度(OD)值，取6孔均值按下列公式计算，细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。 1.6.3 Hoechst 33258染色形态学观察将SH-SY5Y细胞(7× 104/ml)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4,多聚甲醛(pH为7.4)于37 ?固定细胞30 min，PBS液洗两次，加5 mg/L Hochest 33258 染色液染色30 min，PBS液洗后，用封片液(20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50,甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。 1.6.4 PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期调整细胞密度为7×104 cells/ml，以1.5 ml/well种入6孔板。分组和处理同上。每组6个复孔。药物作用72 h后，细胞刮刮取细胞，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中缓慢依次加入70,的冰乙醇固定。-20?固定24 h。固定后，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，调整细胞浓度为1×106/ml。加RNase至终浓度100 μg/ml，37 ?水浴30 min。加PI 至终浓度50 μg/ml，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4 ?避光染色30 min后，上流式细胞仪检测(激发波长:488 nm;发射波长:610 nm)各期细胞DNA的含量。每组3个复孔。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代凋亡细胞的多少。 1.6.5 统计学处理全部数据采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用?s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验。 2 结果 2.1 Aβ诱导SH-SY5Y凋亡浓度和时间的确定镜下观察发现对照组细胞形态正常，有明显的轴突(图1a所示)，而模型组细胞随时间推移和Aβ25-35浓度升高，细胞损伤逐渐增强，胞浆黯淡，出现空泡和小斑点，轴突消失，细胞皱缩并聚集成簇，各浓度在72 h损伤严重，出现细胞肿胀，胞膜破裂，胞物释放，包间沉积物聚集(图1b所示)。流式检测发现，50μmol/L Aβ25-35作用SH-SY5Y 细胞72 h后，凋亡率达(37.30?0.69)%，较对照组有明显的统计学差异，Hoechst 33258染色也发现有蓝色的颗粒状和固缩状荧光等典型的凋亡特征(图1e所示)。Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度和时间为50 μmol/L和72 h。 2.2 WEG对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响镜下观察发现Aβ25-35和不同浓度的WEG(1，5，10，15 mg/ml)同时孵育SH-SY5Y 细胞72 h后，细胞形态都得到明显改善，胞浆均匀，大部分细胞出现轴突，细胞斑点和沉积物少。5，10，15 mg/ml WEG组较1 mg/mlWEG组抗凋亡作用更为明显(图1c所示)。 2.3 结果各组细胞MTT值如表1所示，与正常对照组相比，Aβ25-35处理组A值显著降低(P<0.01), Aβ25-35和WEG同时孵育后，A值显著升高(与模型组比较P<0.05)，说明WEG对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y 细胞损伤有明显的保护作用。 表1 WEG对Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞毒性的细胞存活率的影响(略) 与正常对照组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01 2.4 Hoechst 33258的染色分析结果如图1 所示，正常对照组细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光(图1d)，而Aβ25-35模型组细胞核呈浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光(图1e)，WEG和Aβ25-35同时给入细胞后，固缩形态和颗粒状荧光显著减少(图1f)。 图1 WEG对Aβ25-35引起的细胞形态和凋亡的保护作用(略) 2.5 流式细胞仪DNA倍体分析结果如图2和 图3所示，50 μmol/L Aβ25-35作用SH-SY5Y细胞72 h后，凋亡率为(37.30?0.69)%，与对照组(1.56?0.80)%比较，差异具有显著性意义(P<0.05)，WEG与50 μmol/L Aβ25-35共同孵育后，凋亡率随WEG浓度升高而降低，1，5，10，15 mg/ml WEG作用于Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡时，其凋亡率分别降低到(14.70?3.18)%，(7.23?1.51)%，(6.14?0.40)%和(5.88?1.33)%，与Aβ25-35损伤组比较差异具有显著性差异(P<0.05)。从 表2)来看，Aβ25-35作用SH-SY5Y后，细胞周期发生了明细胞周期分析( 显改变，除亚二倍体峰明显增加外，G0/G1和G2/M期比例较对照组下调明 显。WEG和Aβ25-35共同孵育后，G0/G1期细胞存活比例随浓度依赖性增加，S期细胞比例较模型组明显减少，说明WEG对凋亡细胞的各个周期都有不同程度的阻滞作用，其主要作用体现在G0/G1期。 表2 Aβ25-35和/或WEG作用SH-SY5Y细胞后细胞周期分析(略) 与正常对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，**P<0.05 图2 Aβ25-35和不同浓度WEG作用SH-SY5Y细胞后流式分析(略) 图3 WEG对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用(略) 3 讨论 AD多发于老年人，临床表现为进行性记忆力减退，认知功能障碍等，其病因和发病机制错综复杂，众多研究者从不同角度提出各种发病假说，如基因突变假说、氧化应激及兴奋性毒性假说等，近年来，淀粉样蛋白假说及其相关的凋亡假说受到越来越多研究者的关注，该学说认为Aβ的聚集在AD发生发展过程中起核心作用，Aβ激发神经元细胞的凋亡进程，导致神经细胞功能紊乱和死亡，最终引起痴呆，细胞过度凋亡可能是神经元退行性病变的原因,1，2,。Aβ是β淀粉样蛋白前体(APP)的一个39,43个氨基酸片段，有神经毒性，包括Aβ25-35，Aβ1-42，Aβ1-40。其中A β25-35代表了最具毒性Aβ的生物活性片段,3,。本实验采用Aβ25-35作为神经细胞凋亡的诱导剂。 人参是我国的传统中药，有大补元气、宁身益智、益气生津、补虚扶正、延年益寿之功效，被誉为“益气要药”。现代研究证明，人参中的主要成分皂苷具有明显的促智作用,4,6,。 但大多数研究均是以皂苷单体(如Rg1,Rb2等)作为研究对象,7，8,，本实验遵循中医药理论的整体治疗观，秉承中药的临床指导原则，采用传统煎煮方法，用人参水提物冻干粉作为研究对象，以Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡做为AD模型，证明高浓度聚焦状的Aβ25-35可诱导SH-SY5Y凋亡。而不同浓度的人参水提物可显著降低Aβ25-35引起的高凋亡，对神经细胞有明显的保护作用。在实验过程中，以往大多数研究先将药物预孵育，而后加入造模剂Aβ25-35，体现的是预防作用,9，10,。我们将Aβ25-35和人参水提物同时给入细胞，体现更多的是人参水提物对AD的治疗作用。本课题研究为AD的临床防治提供了一定依据，今后可从凋亡相关基因蛋白等方面深入研究人参水提物对Aβ25-35诱导SH-SY5Y凋亡的保护作用机制，进一步进行新型防治AD中药的筛选。 【参考文献】 ,1, Cotman CW, Anderson AJ.A potential rolefor apoptosis in neurodegeneration and A lzheimer disease,J,.Mol Neurobiol,1995,10:19. ,2, Loo DT,Copani A,Cummings BJ,et al. 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