肠道菌群

肠道菌群 二、水生动物的肠道菌群 水生动物肠道菌群的均衡与水生动物肠道正常功能的发挥和健康密切相关，水生动物对消化道内食物的消化是通过自身消化腺和肠道细菌各自分泌的酶所共同进行的。研究和了解水生动物肠道菌群，对维持水生动物健康与正常生理功能、开发水生动物饲料和饲料添加剂，提高水产品产量和质量具有重要意义。同时，水生动物的一些疾病往往与肠道细菌密切相关，研究肠道细菌对这些疾病发生和病原菌入侵过程，有助于了解疾病的发生机理和探索防治途径。 1. 水生动物肠道菌群的作用 肠道正常菌群对养殖水生动物的生长发育过程有着极其重要的作用，水生动物肠道群菌起着促进消化吸收、维持健康、增强免疫能力等作用(图9-1)。但是，肠道菌群的组成是复杂而变化的，不同的肠道菌群在肠道内的数量、分布位置及其所发挥的作用是不同的。在水生动物肠道菌群群落正常和均衡时，肠道菌与水生动物之间处于良性互利的状态，水生动物肠道维持着正常的生理功能。但是，如果肠道内外环境发生变化，肠道菌群结构的稳定就可能被破坏，影响水生动物肠道正常功能、降低水生动物体质和生长效率。一些“强势”的新进入的细菌甚至有可能得以异常增殖，导致疾病的发生，被称为病原菌或条件致病菌。 提高生产性能改善微生态平衡 提供更多营养素 內源营养素抑制病原菌生长 产生抗菌素中和肠毒素与病原菌竞争 减少毒胺产生改善吸收肠道正常菌 合成微生物产生有机酸抗原 降低pH提高免疫力 图9-1 水产动物正常肠道菌群对肠道和健康的影响(引自刘淮德，应用微生物分子生态学方法研究对虾肠 道细菌组成及其变化规律[D].中国科学院研究生院，2010，P23) 2. 水生动物肠道菌的来源 水生动物肠道的微生物生态与外部水环境应是密切相关的。水生动物往往在水中产卵，水中的细菌能定居在卵表面，而且刚孵化幼体的消化道发育并不完全，其肠道、皮肤和鳃上 没有微生物群落。水生动物肠道细菌起源于水生动物所处的水环境或摄食的饵料，水生动物在吞水和摄食时细菌会被带入肠道内，这些细菌进入肠道后，其生理生化特性有可能发生相应变化以适应肠道环境而后定居成为肠道细菌。根据细菌在宿主肠道上的定植力和停留时间，消化道菌群可分为固定菌群和过路菌群，前者为占有消化道中特定区域的微生物，后者为不能在健康动物消化道内长期滋生的微生物，除非后者替换了固定菌群占有的特定区域。大多数水产动物肠道内细菌仅为“过路菌”，会随粪便再次排入水体。但是水生动物肠道结构有利于细菌的定殖，而且肠腔内环境相对稳定且营养丰富，所以会有一定数量和种类的细菌是作为肠道“土著菌”而存在于其中。 3. 水生动物肠道常见的微生物菌群 不同水生动物、不同水域同一动物体中的微生物菌群组成有一定的差异，可能与其食物 1985) 认为鱼类肠道菌群数量与组成因鱼的种来源和组成及环境条件不同有关。尾崎久雄( 类、栖息水域、是否摄饵和投饵时间、饵料状况和生理状况而改变。淡水鱼肠内细菌的数量 5 8基本为10,10CFU(SUGITA H, OSHIMA K, TAMURA M.，1993)，而海水鱼肠内细菌的 68数量为10,10CFU(尾崎久雄，1985)。肠道的优势细菌为革兰氏阴性菌，同时也存在革兰氏阳性菌(SAKATA T, SUGITA H, MITSUOKA T,1981)。 许多种类的海水鱼的肠道优势内源性菌群是革兰氏阴性兼性厌氧菌，如不动杆菌属(Acinetobacter)、交替单胞菌(Alteromonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜纤维菌(Cytophaga)、莫拉菌属(Moraxella)、微球菌属、假单胞菌属和弧菌属 (Cahill, 1990;Onarheim et al., 1994; Blanch et al., 1997)。酵母菌也常常可从海水鱼的肠道分离出，如从半滑舌鳎(Areliscus semilaevis)、带鱼(Trichiurus lepturus)、马面鲀(Navodon)、马鲛鱼(Scomberomorus niphonius)消化道中分离到汉逊德巴利酵母(Dabaryomyces hansenii)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、假丝酵母(Candida )(池振明等，2009)。 淡水鱼的肠道优势内源性菌群主要种类是气单胞菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，杆菌属(Bacteroides)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和梭杆菌属(Fusobacterium)中的专性厌氧菌(Sakata, 1990; Huber et al, 2004; Kim et al, 2007)，也包括许多乳酸菌(Ringø and Gatesoupe, 1998; Balcázar et al, 2007);还有报道酵母菌的存在 (Andlid et al, 1998; Gatesoupe, 2007)。王红宁(1994)的研究表明，鲤鱼的肠道正常菌群是气单胞菌、大肠杆菌、需氧芽胞杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)和梭状芽胞杆菌。在鲤鱼肠道中，需氧、兼性厌氧优势菌是气单胞菌 和酵母菌，厌氧优势菌是拟杆菌。侯进慧等(2010)从健康鲫鱼肠道分离出62 株细菌菌株，其中18 株为革兰氏阳性菌株，44 株为革兰氏阴性菌株。汉逊德巴利酵母、红酵母和假丝酵母是虹鳟肠道中的优势种类。不同种类的鱼，由于生活的环境和摄食特征各不相同，其肠道菌群构成也各异。 虾类消化道菌群组成与变化既与虾类自身的种类、发育时期以及健康状况等因素有关，也受到包括水环境的盐度、温度、氧气浓度、饵料和药物等因素的影响。假丝酵母(Candida spp.)、丝孢酵母(Tnchosporon sp.)、德巴利酵母(Debaryomyces sp. )和红酵母(Rhodotorula 是凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肠道的优势酵母菌属(Pagnocca F G等，1989)。spp.)() 只有适宜的细菌在适宜的条件下进入消化道内才能够增殖。在健康的对虾受精卵和无节幼体内没有检测到细菌，溞状幼体开始摄食后，体内才出现细菌，对虾体内的细菌主要由口而入，进而在体内定植繁衍(李筠等，2004)。虾类消化道菌群组成及数量变化随个体的不同发育阶段而异。中国明对虾(Penaeus chinensis)溞状幼体1,2期最易分离到的为假单胞菌和气单胞菌，没有分离到弧菌;溞状幼体3期假单胞菌、气单胞菌仍占优势，弧菌开始出现;从溞状幼体3期后至仔虾5,6期弧菌明显占优势;溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)出现于溞状幼体3期至糠虾3期，且为优势菌，而哈维氏弧菌(V.harveyi)在糠虾3期,仔虾5期出现，取代溶藻胶弧菌成为优势菌(李筠等，2004)。日本囊对虾(P. japonicus)幼虾中弧菌占优势，而成年虾则以假单胞菌占优势(Yasuda等，1980)。无论是野生或是养殖的墨吉对虾(P. merguiensis)，其健康虾的肠道优势菌都是弧菌属(Oxley 等，2002)。宛立等(2005)从健康养殖的凡纳滨对虾肠道中分离出111株细菌，其中革兰氏阴性菌占95.5%，分别属于13个属(科)，优势菌为发光杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、肠杆菌科、黄单胞菌属(Xanthomonas)。王祥红等(2000)从野生健康中国明对虾成虾肠道中分离出47株菌，分别隶属于8个属，其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属，不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属。尽管虾类消化道中的优势菌种不尽相同，弧菌属、发光杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属等为虾类消化道中的常见优势菌。 养殖九孔鲍(Holiotis diversicolor supertexta)的消化道异养细菌有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、弧菌属、气单胞菌属、黄杆菌属、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、假单胞菌属(祝玲等，2005);在环境稳定的情况下，九孔鲍消化道中细菌菌群的平衡，一年四季的细菌总数在同一数量级，异养细菌总量的四季变化为1.6 7755×10,5.4×10 cfu/g (湿重)，弧菌数量为2.8×10,3.8×10 cfu/g(蔡创华等，2005)。 海参肠道内栖居着多种酵母菌，大连海域刺参(Stichopus japonicus)体中(肠道和呼吸树) 分离到红酵母属、德巴利氏酵母属、假丝酵母属、梅奇酵母属(Metschnikowia)、丝孢酵母属Trichosporon、有孢汉逊酵母属Hanseniaspora和毕赤酵母属的酵母菌(李明等，()() 2012)，酵母菌有助于宿主更好地吸收营养。 4. 影响水生动物肠道细菌群落结构组成的因素 水生动物肠道菌群是动态变化的，只有适宜的微生物在适宜的条件下进入消化道内才能够增殖。水生动物肠道细菌的定殖、组成、数量与更替，与动物种类、发育时期以及健康状况等因素有关，也受到包括盐度、温度、溶解氧、饵料、药物、应激和养殖环境中的微生物等因素的影响。 (1)水中微生物 水体中的细菌对水生动物早期肠道细菌的形成起着决定作用。海水鱼和淡水鱼肠道内的优势细菌分别与海水和淡水中的优势细菌相似。水生动物肠道中的微生物会随着水体中微生物的变换而很快发生变化，在双壳类动物中发现，肠道微生物组成和周围环境(水体和底泥)的微生物非常相似;日本囊对虾(Penaeus japonicus)肠道的菌群组成和周围海水菌群组成相似。 (2)水温和盐度 水生动物通过吞水和摄食而使水进入肠道，因此环境水温、盐度等物理化学因素就会影响肠道内的环境，就会直接影响着肠道细菌的数量与组成。鲑科鱼由淡水进入海水再返回淡水的过程中，在淡水中的鱼类肠道菌群以气单胞菌和肠杆菌为主，而在海水中则以好盐性的弧菌为主(Yoshimizu等，1976)。 (3)饵料 肠道菌群的营养主要依靠利用水生动物宿主肠道内的食物，所以饵料对肠道细菌有很大的影响，水生动物肠道中的微生物也会随着食物中微生物的变换而发生变化，在鱼的幼体和成体上己经证明了饲料对肠道菌群的影响(表9-3)，日本鳗鲡(Anguilla japonica)不同发育阶段分别投喂红虫(水蚯蚓)、白仔饲料、黑仔饲料、幼鳗饲料和成鳗饲料，不论饱食或空腹，均以投喂红虫时期的肠道菌群数量最高;而且饱食和空腹状态下肠 37道菌群数量也不同，日本鳗鲡在空腹状态下，其细菌数量约为10,10个/g ，饱食状态下 48约为10,10个/g，在饱食状态的细菌数量一般比空腹状态时高10,100倍(樊海平等，2005)。鲈鲤(Percocypris pingi)幼鱼肠道菌群的来源主要是饲料，肠道内容物与饲料菌群相似性最高可达51.6%(鲁增辉，2011)。 表9-3 不同饵料种类对日本鳗鲡肠道菌群的影响 状态 饵(饲)料种类 饱食 红虫(水蚯蚓) 厌氧菌,大肠菌群,肠球菌 白仔饲料 厌氧菌,大肠杆菌、肠球菌、芽胞杆菌(后三者数量相当) 黑仔饲料 厌氧菌,芽胞杆菌,大肠杆菌 幼鳗饲料 成鳗饲料 空腹 厌氧菌,大肠菌群,芽胞杆菌 注:“,”表示数量多少(樊海平等，2005) (4)药物 水产药物尤其以抗生素在水生动物的病害防治中起着重要作用，人们通常采用抗生素、化学合成药物等防治水产动物疾病，但长期大量使用抗生素不仅破坏水产动物肠道正常菌群组成，造成肠道内微生态失调 (菌群失调)，导致对病原微生物的易感性以及细菌耐药性，而且会在体内残留，并造成整个水域生态环境的污染。大量应用抗生素会直接影响水生动物的肠道细菌的组成。Hansen等(1992)将鲱鱼的幼鱼用青霉素和链霉素处理后，肠道细菌发生变化，黄质菌属(Flavobacterium)成为优势细菌，且肠道细菌产生耐药性。Austin等(1988)发现虹鳟喂食口服土霉素、红霉素和青霉素G后，肠道细菌数量发生了变化。诺氟沙星对革兰氏阴性菌有杀灭作用。鳖口服诺氟沙星 2.0 mg/kg 和20. 0 mg/kg时，消化道中细菌数量明显减少;随着用药剂量的增大，优势菌群的比例发生变化，其中肠杆菌的比例升高，气单胞菌和弧菌则相应下降(陈孝煊等，2002)。一些中草药如穿心莲、板兰根、大黄等也会影响草鱼肠道细菌的数量和组成(罗琳等，2001;李莉等，2002)。斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)摄入地锦草后会对肠内优势菌群之一的气单胞菌属细菌产生负面的影响，降低其在肠内的组成，但另一优势菌群肠杆菌属细菌没有影响(李志远，2008)。 (5)应激 水产养殖动物在遭受对其生长不利的环境胁迫或应激如食物匾乏、环境恶化、机械搬运等时，其体内正常益生菌群同样会受到干扰和影响。有研究发现，病毒感染会影响对虾肠道菌群的构成及菌数(李继秋等，2006)，在同一养殖池中，感染白斑综合征病 65毒(WSSV) 的凡纳滨对虾的肠道细菌总数为1.06×10 cfu /尾，未感染的对虾为1.78×10 cfu/尾，感染者显著高于未感染者，两者的肠道菌群在细菌组成和数量上存在显著的差异(图9-2)，表明对虾肠道菌群区系与机体的健康状态密切相关。如食物中某些必需营养元素缺乏或供给不足时，肠道微生物群内产生对该营养元素的竞争而导致菌群组成的失调(RING E,GATESOUPE F，1998)。 70肠60道感染WSSV对虾不50同未感染WSSV对虾菌40群所30占20比例%10 0 弧菌气单胞菌海水球菌盐水球菌乳酸杆菌其他 图9-2 凡纳滨对虾肠道菌群在细菌组成(引自李继秋等，2006) (6)微生态制剂 微生态制剂如芽胞杆菌添加到饲料中会改变原有肠道细菌群落结构，肠道内某些原有细菌数量的增加，可能也会抑制另一些种类细菌的增殖。于明超(2010)研究报道，投喂基础饲料的幼虾肠道的细菌种类多，分离鉴定出11个属的细菌，而饲料中 杆菌的幼虾肠道中细菌种类分离鉴定5,6个属，饲料中添加中草药添加中草药制剂和芽胞 制剂和添加芽胞杆菌对凡纳滨对虾幼虾肠道菌群组成有一定的影响。李卓佳等(2005)比较了养殖60d的施用芽孢杆菌制剂与没有施用有益菌的虾池中凡纳滨对虾肠道微生物，表明施用芽胞杆菌制剂的虾池虾肠道可培养细菌数量比没有施用有益菌的池少5个数量级，可培养 712细菌数量分别为3.4×10 cfu /g和5.8×10cfu /g，可培养细菌的优势菌群组成和肠道微生物多样性指数也不同。潘雷等(2012)研究发现，饲料中添加益生菌对大菱鲆(Scophthatmus maximus)幼鱼肠道中总菌数无显著影响，但显著降低了大菱鲆幼鱼肠道弧菌数;复合益生菌对大菱鲆幼鱼血细胞数、溶菌酶、血清蛋白浓度、血清酚氧化酶、血清超氧化歧化酶和血清总抗氧化力都有不同程度的提高，这也说明了饲料中添加益生菌可以提高大菱鲆非特异性免疫能力。 5.鱼虾类肠道菌群检测方法 (1)青石斑鱼肠道菌群分离(覃映雪，2007) 取新鲜青石斑鱼(Epinephelus awoara)测量体长和体重后，用75 %酒精棉球擦拭鱼体表面进行消毒，再用灭菌生理盐水冲洗数遍，无菌操作解剖鱼体分离肠道，用灭菌棉线将肠道的前后两端结扎并剪下，测量肠道长度(cm) 及重量(g) 。 ? 好气菌及兼性厌氧菌的分离 取鱼前肠、中肠及后肠各约0. 5 cm，混合为样品，称重后按1:10 ( w/v) 的比例加入灭菌生理盐水混合，用灭菌匀浆器研磨，研磨的样品为 -1-1-410，再用灭菌生理盐水对10 样品进行倍比稀释至10，各稀释度样品均置于摇床振荡器 -2-3 -4上振荡均匀。取10 、10和103个稀释度各100μL 涂布营养琼脂平板，另做两个平行对 -1-2-3照。取10、10 和10 3个稀释度各100μL分别涂布麦康凯琼脂平板、NAC平板、TCBS平 板和锰营养盐琼脂，同样分别做两个平行对照。其中涂布锰营养盐琼脂平板的样品先在60?下处理2 h后再涂布。涂布后的平板在洁净工作台上正放静置约10 min 后再将平板倒置于 恒温培养箱中培养。 28 ? ? 厌氧菌的分离 样品采集和处理的方法与上述相同，不同之处是所采样品用灭菌 -1-2的还原性稀释液进行洗涤、研磨和稀释，稀释好的样品置于厌氧培养箱中，取10、10 和-310 3个稀释度样品各100μL 分别涂布脑心浸液琼脂、TPY、SL琼脂平板，另分别做两个平行对照。涂布好的平板正放静置约10 min，然后将平板倒置于28 ?厌氧培养箱中培养。 厌氧菌培养72 h后，取出培养平板，观察各平板上好气菌及兼性厌氧菌培养48 h， 的菌落特征，并选择菌落生长疏密适当的稀释度的平板计数。对3次重复实验所得数据进行统计分析。 2)对虾肠道菌群分离(李继秋，2003) ( 采集对虾样品，表面用75%酒精消毒，然后用无菌海水冲洗。在无菌操作下提取出整条肠道，置于事先称量过的已灭菌的玻璃匀浆器中，称重。加入少量无菌生理盐水(0.85%NaCl)进行匀浆，匀浆后定容至1mL。以匀浆后的样品为原液进行10倍梯度稀释，分别涂布普通