不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响

不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响 不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响 2005年8月 第25卷第8期 基础医学与临床 Basic&ClinicalMedicine August2005 Vo1.25No.8 文章编号:DO1—6325(2005)08—0721-05 不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响 张文红,孙筱放,陈欣洁,廖宝平 (广州医学院附属第二人民医院妇产科研究室,广东广州510150) 研究论文 摘要:目的检测不同温度对卵母细胞纺锤体的影响.方法昆明系小鼠MII期卵母细胞和Balb/c系小鼠MI期和 MII期卵母细胞分别置于不同温度环境各10min,利用LC.PolScope纺锤体观测系统,观察卵母细胞纺锤体变化. 结果环境温度45?对卵母细胞纺锤体有不可逆影响;经4l?再恢复到37后的Balb/c系小鼠MI期卵母细胞纺 锤体Ret~'dance值显着高于其他对应组别(P<0.05);25时的卵母细胞纺锤体Retardance值显着低于37?于对照 组(P<0.05).结论小鼠卵母细胞纺锤体对温度变化敏感,体外操作时维持37?环境是保持卵母细胞纺锤体正常 生理功能的关键. 关键词:小鼠卵母细胞;纺锤体;纺锤体观测系统;温度 中图分类号:R321.1文献标识码:A Effectofdifferenttemperatureonspindleinmouseoocytes ZHANGWen-hong,SUNXiao-fang,CHENXin.jie,LIAOBao?ping (Obstetrics&GynecologyResearchInstitute,GuangzhouSecondMunici【palPeople'sHospital,cuanszhOUMedicalCollege,Guangzhou510150,China) Abstract:ObjectiveInordertoexalntheeffectofdifferenttemperatureonspindle.MethodsMouseoocyteswithor withoutpolarbodywereexposedtoshihsfrom37oC(contro1),thento38?,39?,40?,41? or45oC;35oC, 30oCor25oCfor10minseparately.thespindleswereimagedththeLC?PolscopeTM.ResultsSpindleswereintact at37oCduring20minofexamination.ThespindlesinKMmouseoocytesweredamagedat45oC.TheRetardanceof Balb/CmouseMIoocyteswhichfrom41? returenedto37oCwassignificantdifferentfromthoseofothergroups(P< 0.05).Coolingto25oC,spindlesweresignificantdifferentfromthespindlesimagedbeforeoraftercooling(P<0.05). ConclusionTheseresultsindicatethatspindlesinmouseoocytesareextremelysensitivetotemperaturechanges.More? over.maintenanceofinvitromanipulationtemperatureat37o【二 iscrucialfornormalspindlefunotion. Keywords:temperature;mouseooeyte;spindle;Polscope 真核细胞进行细胞分裂的重要特征是染色体的 平均分配,主要由微管蛋白组成的纺锤体在这一过 程中起决定性作用,它的正确运动是染色体平均分 配的保证.在卵母细胞成熟分裂过程中,纺锤体 对同源染色体的正确联会和分离至关重要. 体外环境中的分裂期细胞,其纺锤体同样会受 到外界环境,如温度或pH值变化的影响.传统研 究纺锤体的方法主要为固定和荧光染色技术, 这局限了观察结果的应用.本实验利用LC.PolSco. peTM纺锤体观测系统,对活体状态的小鼠卵母细胞 收稿日期:2004—09—02修回日期:2005—05—31 基金项目:国家自然科学基金(30170358) '通讯作者(correspondingauthor):020—81292202;xiaofangsun@hotmail.com 722基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine2005.25(8) 纺锤体进行观察,研究环境温度变化对纺锤体产生 的影响,为进一步探讨纺锤体的生理特性提供参考. l材料与方法 1.1实验动物 实验动物为体重20,22g的雌性昆明系小鼠和 8周龄左右的雌性Balb/c系小鼠,分别由广东省医 学实验动物中心和中山大学实验动物中心提供. 1.2卵母细胞的获取 常规超排卵方法处理,在注射hCG14,16h内 处死小鼠,所获卵丘细胞一卵母细胞团用浓度为80U/ mL的透明质酸酶(hyaluronidase,SIGMA公司)去卵丘 细胞,卵母细胞在培养液中依次洗涤后随机分组. 1.3实验分组 第一部分实验动物为昆明系小鼠,实验温度为 45?,40?,35?,30.【二和25?;第二部分使用 Balb/c系小鼠,检测温度是41?,40?,39?, 38?,30o【二和25?;对照组温度37?.利用LC. PolScopTM纺锤体观测仪(CRI公司)进行观察,培养 液为加有10%胎牛血清的ModifiedHTF(IrvineScien. tific公司). 昆明系小鼠M?期卵母细胞首先在37?条件 下观察;然后分别转移到各实验组培养液中孵育 10min,37?恢复10min,依次观察,卵母细胞 纺锤体的变化. Balb/c系小鼠卵母细胞分Ml期和M?期,逐 个观察和测量卵母细胞在37?时,实验组温度孵育 10min后,37?条件恢复10min情况下纺锤体Reta卜 dance值的变化. 1.4数据处理 纺缍体出现率= 度升高~1]45?时,可见纺锤体的卵母细胞数量显着 低于对照组(P<0.05)(表1),并且在37?环境中 恢复培养2hA,卵母细胞仍色泽黯淡,胞质内充满 颗粒. 表l培养液温度升高对昆明系小鼠M?期 卵母细胞纺锤体的影响 Table1TheeffectofheatingtospindleinM? oocytesofKMmouse P<0.05comparedwithcontrol 随着培养液温度的降低,实验组卵母细胞纺锤 体变化明显(表2).30?和25?的纺锤体数显着 低于对照组(P<0.05或P<0.01).所有卵母细 胞,在37?环境中恢复培养2h后,形态正常,多数 纺锤体可再现. 表2培养液温度降低对卵母细胞纺锤体的影响 Table2TheeffectofcoolingtospindleinM? oocytesofKMmouse 旦萼{呈;?..%P'.?.'P'.?.c.mpalw"c.nm 每组卵母细胞纺锤体的Retardance值变化以 ?s表示. 所有结果分别用SPSSIO统计软件进行X检验 和ANOVA分析处理. 2结果 2.1温度变化对昆明系小鼠M?期卵母细胞纺锤 体的影响 40oc时纺锤体出现率较对照组稍有增加;当温 2.2温度变化对Balb/c系小鼠不同时期卵母细胞 纺锤体的影响 表3比较了Balb/c小鼠MI期和M?期卵母细胞 纺锤体在不同检测温度下的变化情况.从表中可知, M瑚和M?期卵母细胞纺锤体在25?时的Retardance 值都显着低于37?时(P<0.05).经过41?处理 10min后再复温到37o【二,MI期卵母细胞纺锤体的Re. tardance值显着升高(P<0.05).附图显示了这两种 温度不同时期卵母细胞纺锤体的变化. 挂学与临床Basic&Chnica[Medici~Ie723 表3不同实验温度下Balhlc系小鼠MI期和M?期 卵母细胞纺锤体变化 Table3ComparisonIIr~indlere|ardanceinMland M?Ball~cmiceoocytesdiff~renltemper? ature{r? l 回国 3讨论 纺踵休是真核细胞分裂中,后期出现的一种重 要细胞内结构,主要冉微管蛋白组成微管蛋白是 种含前.和3亚l位的异二聚体,它常处于组装 和去组装的动态变化过弹中,GTP的结合和水解为 微管蛋白的组装及去组装提供能量,调节着徽管蛋 白的动态变化 实验过程中使用的LC一纺锤体观察系 统,利用波为546nm的绿光通过一个液态晶体偏 光补偿器.改变偏光状态根据偏振光穿过光各向 异性(optical/Yanimvic)介质l时状态会发生改变 的双折射"特眭,获得被观察物体的双倍结构,从而 町直接在疆微镜观察处于有丝分裂或减数分裂中 期的活体细胞纺锤体,弥补了手E使用固定和染色 方法研究纺锤体的足.同时可避免ICSI时对卵细 胞纺锤体的可能损伤.以及进行核移植时精确定位 纺锤体.. 从第一部分实验结果-II以看出.卯母细胞所处 环境温度轻微升高(如40?)时.其纺锤l奉更清晰, 第__.部分的实验结果进?步证实了这点推测在未 破坏印母细胞活性前提下.温度升高有利于GTP合 圈圈一囫 固I不同温度时BalI#C小鼠卵母细胞纺锤体变化 FiglSpindleimaginglBalb/CrnollSeoocytesusingtheLC-PolScopeatdifferenttemperatur e Spindl<irrlaging'I(一ml?….yhusingtileI.C-PolS<'''.h~mpcralure(hatlH】I~fnre 【^:37:);aldiffcrerl!tempera Iiir~min【B);r1nll"37'forIOlnJnl【:】c×4fro) 724基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine 成与分解提供能量,从而使微管蛋白组装加强,折光 性增大.但若温度过高(45?),导致卵母细胞整体 结构的损坏,而且这种损坏是不可逆的. 从两部分的实验结果可以看出,培养液温度降 低对纺锤体结构有不利影响,这种影响随温度的进 一 步降低而加大,这与利用免疫组化和DNA染色方 法b所获结果一致,也与LC.PolScop进行的温度 影响人卵母细胞纺锤体实验结果相一致.以上实 验结果提示:处于分裂期的卵母细胞纺锤体对温度 变化敏感,而纺锤体的存在有利于人卵母细胞体外 受精和胚胎发育?..,因此在体外受精和胚胎移植过 程中,必须维持卵母细胞所处环境温度的稳定. 由于系统中所测得的Retardance值代表物质的 结构密度,它与第一部分实验中定量反映纺锤体变 参考文献: [1]PicketingSJ,JohnsonMH,BraudePR.Cytoskeletalorganiza— tioninfresh,agedandspontaneouslyactivatedhumanoocytes [J].HumReprod,1988,3(8):978—989. 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