大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化的体外功能研究

大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化的体外功能研究 大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化 的体外功能研究 主生鎏苤查!堡且笫5卷第9期ChinJInjectDis,September2007,Vo1.25,N0.9 大鼠肝细胞与睾丸支持细胞 微囊化的体外功能研究 混合共 郑明华陈永平林海龙潘亮亮许烂漫黄瑜马海龙潘珍珍 ? 513? ? 基础论着? 【摘要】目的观察大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化对肝细胞生物学活性的支持作 用.方法利用微囊发生器制备含肝细胞,睾丸支持细胞及两者混合细胞的微囊,根据微囊内包裹细 胞种类的不同,分为微囊化肝细胞组,微囊化睾丸支持细胞组,肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后共同 培养组和肝细胞,睾丸支持细胞混合共微囊组.观察囊内细胞形态,体外培养测定培养液中Alb与尿 素分泌,判断各组囊内肝细胞活性和功能.样本比较采用重复测量数据的多元方差分析.结果体 外培养96h时,光学显微镜下见微囊呈球形,面光滑,细胞均匀,散在分布于微囊内,囊内肝细胞, 睾丸支持细胞呈圆形,未贴壁.微囊化睾丸支持细胞组培养上清液中无法测及Alb与尿素.与微囊 化肝细胞组相比,肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组与肝细胞,睾丸支持细胞混合共微囊 组肝细胞的存活时间延长,培养上清液中Alb(F一217.56,P<0.01)和尿素(F一 232.72,P< 0.01)明显增加混合细胞共微囊组于培养第7天Alb与尿素含量最高,分别为 (2.80_--4-0.11)g/L, (1.92?0.10)~mol/L,而其他两组均于培养第3天Alb与尿素含量达到最高,分别为 (2.48?0.08) g/L,(1.47--4-0.08)tLmol/L和(2.27?0.10)g/I,(1.37?0.05)~mol/L.相对于混合细胞 共微囊 组,肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组在培养中后期Alb,尿素含量下降 趋势明显.结 论肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化能明显延长囊内肝细胞的寿命,维持肝细 胞形态和功能. 【关键词】肝细胞;塞尔托利细胞;微囊;睾丸;大鼠 Thefunctionofmixed-microencapsulatedrathepatocytesandtesticularSertolicellsinvitroZHENG Ming—hua,CHENYong—ping,LINHai—long,PANLiang—liang,XULan— man,HUANGYu, MAHai—long,PANZhen— zhen.DepartmentofInfectionandLiverDisease,FirstAiliatedHos— pitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China CorrPso九九gauthor:CHENYong—ping,Email:ypchenl06@yahoo.coin.cn [Abstract]0hiectiveToinvestigatethesupportiveeffectsofmixedmicrocapsulesofrathepa— tocytesandtesticularSertoliceilsonliverfunction.MethodsMicrocapsulecontaininghepatocytes and(or)testicularSertoliceilswaspreparedbymicrocapsulegenerator.Accordingtothetypeof microencapsulatedceils,themicrocapsulesweredividedintofourgroups:microencapsulatedhepato— cytesalone(groupI),microencapsulatedSertoliceilsalone(group ?),mixtureofmicroencapsula— tedhepatocytesandmicroencapsulatedSertoliceils(groupm),andmixed— microencapsulatedhepato— cytesandSertoliceils(group ?).Morphologyofthemicroencapsulatedcellswasobservedbyphase contrastmicroscopy.Supernatantwascollectedregularlytodetectthesecretionofalbuminandurea toevaluatetheactivitiesofhepatocytesindifferentgroups.TherepeatedmeasurementofMANOVA wasperformedforthedataanalysis.ResultsAfter96hoursencapsulation,hepatocytesandSertoli 基金项目:浙江省2004年度引进国外技术,管理人才专项资助项目(Z2004GY031); 温州市科技资助项目 (Y2004A011) 作者单位:325000温州医学院附属第一医院感染内科(郑明华,陈永平,林海龙,许烂 漫,黄瑜,马海龙,潘珍 珍);温州医学院基础医学院(潘亮亮) 通信作者:陈永平,Email:ypchenl06@yahoo.corn.cn 中华传染病杂志2007年9月第2j卷第9期 ChinJInfectDis,September2007,Vo1.25,No.9 cellsweredispersedevenlyinthemicroencapsulates,whichwerespherewithsmoothsurfaceand non— adherent.Albuminandureainthesupernatantofgroup11wereundetectable.Comparedwith groupI,cellsingroup?andIVsurvivedmuchlongerandthelevelsofalbuminandureainthe supernatantofgroup?and?increasedsignificantly(F=217.56,P<0.01;F一 232.72,P< 0.01,respectively).Thelevelsofalbuminandureaingroup? peakedonday7whichwere(2.80? 0.11)g/Land(1_92?0.1O)Fmol/I,respectively,whileingroupIand11I.thelevelspeakedon day3[albumin:(2.27?0.1O)g/I,urea:(1_37?0.05)Fmol/IforgroupI;albumin:(2.48? 0.08)g/L,urea:(1.47?0.08)Fmol/Iforgroup?,respectively].ComparedwithgroupIV,the levelsofalbuminandureaingroup?decreasedsignificantlyinthelatephaseofmicroencapsulation. ConclusionsThehepatocytesandtesticularSertolicellsmixed—microencapsulationcansignificantly improvethesurvivaltimeandmaintainthemorphologyandfunctionofhepatocytes. [Keywords]Hepatocytes;Sertoliceils;?【icroencapsulation;Testis;Rats 微囊化肝细胞移植治疗急性肝功能衰竭有较 好的研究和开发前景,但目前最大的障碍是原代 肝细胞体外培养生存和传代困难.国外学者通过 基质辅佐或与生存力旺盛的组织,细胞混合等途 径,以增强肝细胞生存力,并取得一定成果.已知 睾丸支持细胞具有强大的分泌功能,能分泌包括 转化生长因子,胰岛素样生长因子,生精生长因子 和神经生长因子等各类促生长因子,且在局部免 疫豁免(immuneprivilege)中扮演重要角色…1. 本研究将肝细胞和同源的睾丸支持细胞混合培养 后进行共微囊化,观察其对肝细胞功能的影响. 材料与方法 一 ,材料 1.实验动物:肝细胞来源于成年SD大鼠,体 质量约200g,雌雄不限.睾丸支持细胞来源于雄 性SD乳鼠,出生lO,15d.均购自温州医学院实 验动物中心. 2.试剂:胶原酶工,海藻酸钠购自Sigma公 司,胰酶购自Amresco公司,含1青一链霉素的 DMEM液购自Hyclone公司,FBS购自杭州四季 青生物制品研究所. 二,方法 1.大鼠原代肝细胞的分离:采用改良Seglen 法[2]分离肝细胞.1O水合氯醛3.5mL/kg腹腔 麻醉,门静脉内注射280U肝素,插管,离断上,下 腔静脉,经门静脉先后灌注400mLDHankS液和 200mL0.1胶原酶工,速率为30ml/min.灌注 完毕后将肝脏移至盛有预冷D—HankS液的平皿 中,去除肝包膜,扯碎组织,100目不锈钢网过滤2 次,收集滤液,以15×g低速离63min,弃上清液, 加DMEM完全培养基(含10FBS,19/6青一链霉 素,pH7.2,7.4),悬浮,细胞计数.置37?,体 积分数为0.05的C()2培养箱(上海力申公司HF一 151UV型)内备用. 2.大鼠原代睾丸支持细胞的预培养:取SD 乳鼠5,1O只,过量乙醚吸入法致死,取睾丸组织, HankS液冲洗2次,剥离外层筋膜,剪碎组织, 0.1胶原酶I37?消化10,15min,100目不 锈钢网过滤,Hanks液冲洗3次,3O×g离心5min, 弃上清液.0.15胰酶37?消化5min,DMEM 完全培养基终止,3O×g离心5min,弃上清液,加 DMEM完全培养基,悬浮,细胞计数.将细胞数调 整到(2,4)×106/ml,6ml接种于25cm的培 养瓶中,37?,体积分数为0.05的C()2培养箱中 培养.24h后,0.02mol/L的Tris—HCI(pH7.5) 低渗处理细胞3,5min,Hanks液冲洗,去除大 部分生精细胞,加DMEM完全培养基继续培养, 每2天换液1次,继续培养96h. 3.细胞微囊的制备:将预培养的睾丸支持细 胞用0.25胰酶消化,离心.将备用的肝细胞悬 液离心,分别或混合后加1.5的海藻酸钠,混匀, 将细胞转入特制的微囊发生器,气体压力为 4m3/min,流速为50mL/h,滴入25mmol/I BaCI2溶液,海藻酸钠与Ba2十交联成囊.0.9氯 化钠溶液洗涤微囊3次,加DMEM完全培养基, 37?,体积分数为0.05的COz培养箱中培养. 4.实验分组:分为微囊化肝细胞组;微囊化睾 丸支持细胞组;肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后 共同培养组将肝细胞与预培养4d的睾丸支持细 胞分别微囊后共同培养;肝细胞,睾丸支持细胞混 合共微囊组将肝细胞与预培养4d的睾丸支持细 生堡鎏瘟壹2007年9月第25卷第9期ChinJInfectDis,September2007,Vo1.25,No.9 胞以20:1细胞数之比混合后再微囊化.每组设 6个复孔,各组分别培养,隔日换液1次,共培养 21d.分别于12h,24h,3d,5d,7d,14d和 21d收集1/z培养上清液,OlympusAU600全自 动生化仪检测上清液中Alb与尿素含量,观察囊 内细胞形态,判断各组囊内肝细胞活性和功能. 5.统计学方法:结果以--+S表示,采用 SPSS12.0统计软件包,样本比较采用重复测量的 多元方差分析,组间比较采用t检验. 结果 一 ,微囊化混合细胞的形态 包裹混合细胞的微囊呈球形,表面光滑,直径 600~800m,细胞悬浮于囊内,每个微囊含150, 200个细胞.体外培养96h时,光学显微镜(德国 Zeiss公司200型倒置相差显微镜)下见微囊仍呈 球形,表面光滑;细胞均匀,散在分布于微囊内,数 量无明显变化;囊内肝细胞,睾丸支持细胞呈圆 形,体外培养的非微囊包裹的睾丸支持细胞较快 贴壁,呈梭形生长,见图1.囊内肝细胞的电子显 微镜(日本Hitachi公司H/7500透射电镜)观察见 图2,睾丸支持细胞的电子显微镜鉴定见图3. 图1相差显微镜下睾丸支持细胞体外培养2d后形成的 细胞单层(×100) 二,微囊化肝细胞的功能测定 纯化后的肝细胞浓度为90,睾丸支持细胞 为85%.微囊化睾丸支持细胞组培养上清液中无 法检测出Alb与尿素.与微囊化肝细胞组相比, 肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组与 肝细胞,睾丸支持细胞混合共微囊组肝细胞的 存活时间延长,培养上清液中Alb(F一217.56, 注:2A:一所指为线粒体(×20000);2B:一所指为内质 网(×10000) 图2电子显微镜观察微囊内肝细胞含有丰富的 线粒体与内质网结构 一注:3A:一示细胞问存在紧密连接(×30000);3B:细胞内线粒 体有管泡状嵴,并和周围细胞形成紧密连接,一示线粒体内管 泡状嵴(×20000) 图3电子显微镜下观察睾丸支持细胞 ^ J 啪 V 删 缸 皿 嘲 皿 ^ 巨 V 删 缸 憔 — {一徽囊化肝细胞组 培养时问(d) , {,微囊化肝细胞组 分 混 分 混 培养时间(d) 注:由于微囊化睾丸支持细胞组培养上清液无法检测出Alb 与尿素,故作图时省去该组 图4微囊化细胞培养液中白蛋白分泌与尿素合成 LL-二L吼m 生簋查279月第25卷第9期ChinJInfectDis,September2007,Vo1.25,No.9 P<0.01)和尿素(F一232.72,P<0.01)明显 增加.混合细胞共微囊组于培养第7天Alb与尿 素含量最高,分别为(2.80?0.11)g/L和(1.92? 0.10)~mol/I,而其他两组均于培养第3天Alb 与尿素含量达到最高,分别为(2.48?0.08)g/I, (1.47?0.08)~mol/L;(2.27?0.10)g/I, (1.37?0.05)~mol/L.随培养时间延长,微囊化 肝细胞组Alb和尿素含量下降,培养14d后其上清 液Alb与尿素含量已极低;而肝细胞,睾丸支持细胞 分别微囊后共同培养组与肝细胞,睾丸支持细胞混 合共微囊组Alb,尿素含量则保持较稳定水平,下降 缓慢.相对于肝细胞,睾丸支持细胞混合共微囊组, 肝细胞,睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组在培 养后期Alb,尿素含量下降趋势更明显,见图4. 讨论 近年来,肝细胞移植(HCT)作为一种有望部 分替代原位肝移植的崭新而有效的方法,受到广 泛关注.有些急性肝功能衰竭患者在接受HCT 治疗期间,由于自体肝脏得到充分休息,无需再接 受肝移植而完全恢复正常l3_3.HCT为急性肝功能 衰竭患者提供暂时性代谢支持或作为肝脏移植前 的过渡治疗,具有重要的理论和实践意义.微囊 化肝细胞是一种新型生物人工肝系统,通过微囊 的局部免疫隔离作用,保证最大程度发挥肝细胞 功能『4j,但目前最大的问题是原代肝细胞体外培 养生存和传代困难.因此,最大限度地提高移植 肝细胞功能,延长肝细胞寿命是亟待解决的问题. 王韫芳等(,5]应用转基因肝星状细胞株HGF/ CFSC及大鼠骨髓来源的Thy1+J32M一细胞 (BDTC)与肝细胞共微囊化培养,发现混合细胞共 微囊化能明显延长囊内肝细胞的存活寿命,维持 其形态和功能,与胰岛的共微囊化培养也得出相 似结果E63.Rahman等[]利用睾丸支持细胞的特 性,将其与HepG2细胞(人肝瘤细胞株)进行共微 囊化培养,发现与微囊化HepG2细胞组相比,混 合细胞组微囊表面仅发生微弱的淋巴细胞浸润, 且极大程度增强了HepG2细胞功能.这为我们 的研究提供了新思路. 睾丸支持细胞是睾丸重要细胞之一j,具有 维持睾丸代谢,调节细胞功能和促进精子发育的 作用.它能产生许多重要蛋白,如硫化糖蛋白,雄 激素蛋白等,以及许多生长调节因子,且睾丸支持 细胞可表达Fas的配体FasI,FasL可与受体免 疫系统中激活T细胞的Fas结合,诱导其凋亡,从 而使细胞免受免疫排斥反应的攻击. 我们在传统体外培养微囊化肝细胞的基础 上,将其与睾丸支持细胞混合共微囊化,结果发 现,微囊化睾丸支持细胞单独培养组无法检测出 Alb与尿素,而肝细胞,睾丸支持细胞混合共微囊 组Alb分泌和尿素合成量明显高于其他两组,提 示睾丸支持细胞本身并无明显分泌Alb与尿素的 功能,但其对肝细胞有重要的支持,营养作用.这 种作用可能是由于其分泌的某些特殊因子,这些 因子中的一部分可能因分子较大无法透过微囊, 因而将睾丸支持细胞与肝细胞分别微囊再共同培 养后,睾丸支持细胞的支持,营养作用减弱,但其 结果与微囊化肝细胞组相比仍有差异.目前睾丸 支持细胞支持肝细胞功能,延长肝细胞寿命的具 体机制仍需进一步研究.混合睾丸支持细胞与肝 细胞为肝细胞移植研究提供了新思路. 参考文献 1234567