螺旋藻中藻胆蛋白和多糖的分离纯化及产品特性

10 精 细 化 工 啪 CHEMICALS 1999年 总第 16卷 Effect of Inorganic Electrolyte on Interaction between Dye and Nonionic Surfactant HUANG Hui，GAO Yu~ying 肿 Yah ( College，Pdmng ，＆ 100871．CA／~ ) Abstract：The effect ofinorganic electrolytes with sa ng—in and 8al “g—out noniomc surfactam TX一100(N~SO4 and KSCN)on the interaction between negative ion dye(ECAB)and TX一100 waB investigated． e binding coristant K of dyewi thTX一 100micellesan d CMC ofthree systems籼 obtained．ForECAB +TX一 100．ECAB +TX一 100+N~SO4 and ECAB+TX —IOO+KSCN systems，K and CMC were 2550，7532．2400din~-mol— and 2． 5× 10～ ．1．87× 10一 ， 1．83×10一mol·drn～ respectivdy．The results qualimfivdy interpreted Key words：dye；elec~olyte；nonionic 8u出 ctarIt Pap盯 No：1003—5214(1999)02一OOO7 10 f口／ 螺旋藻中藻胆蛋白和多糖的分离纯化 及 ／ 产品特性’ &7 叫 ’ 北 l ooo~ 删 ) 鼢 R b —一 ——磊 曩学化学系．北京 f f， 摘要：提出一种从螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白和糖蛋白的新型分离。等电聚焦分析结果 明所得到的藻蓝蛋白为电泳纯 ．等电点为 4．3，测定 了藻蓝蛋 白的氨基 酸组成及其红外 吸收光 谱。SDS—PAGE分析结果表明所得到的糖蛋白组成均一，其分子量为 130kd。测定了螺旋藻糖蛋 白的氨基酸组成，红外光谱分析表明螺旋藻糖蛋白舍有 型糖苷连接键。 关键词：璺 媾；兰 堕 ；螺旋莽撞嚣旦；特性 中围分类号：R977．6；0658．9 文献标识码 ：A 螺旋藻是一种丝状多细胞螺旋形藻类生物，它 含有丰富的蛋白质 、脂肪 、维生素、矿物质、叶绿素、 口瑚 萝 素及多糖类物厉 。藻蓝蛋白和螺旋藻多 糖是螺旋藻中的重要活性物质，临床研究结果表明 螺旋藻中的藻蓝蛋白具有提高人体免疫力，促进动 物血细胞再生．抑制癌细胞的作用 ；螺旋藻多糖则 具有抗氧化、抗疲劳，防护植物细胞的辐射遗传损伤 的作用 。作为一种新的药物资源，螺旋藻中生物 活性组分的分离纯化及其特性研究受到各国政府和 科学界的重视，其中藻蓝蛋白和多糖是 目前开发螺 基金项 日：国家 九五”攻关资助项 目(96c一03—04—05) 南， 文章编号 ：1003—5214(17~9)o2一EOIO一13 旋藻药物的重点研究课。 现有的关于从螺旋藻中分离纯化藻蓝蛋白或多 糖的工艺通常是针对单一产品的．无法同时获取多 糖和蛋白，造成了原材料的浪费。此外，在制备螺旋 藻多糖时所采用的水溶液加热抽提、Sevag溶剂萃取 去除蛋白等方法 ．操作繁琐．易导致生物多糖结 构的缺损。为此，作者发展了一种新的分离工艺。从 螺旋藻中同时分离纯化得到藻胆蛋白及螺旋藻糖蛋 白，并对藻蓝蛋白和螺旋藻糖蛋白的理化特性进行 了研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 殷钢，等：螺旋藻中藻胆蛋白和多糖的分离纯化及产品特性 1 活性物质的提取 1．1 材料 选取产于我国海南三亚的人工养殖钝顶螺旋藻 进行藻蓝蛋白和螺旋藻多糖的分离纯化，Sephaeryl S 一 1001200、sephad＆G一20O等凝胶介质为 Phatrmeia Biotech产品，分子量和等电点蛋白质购自Sigma 公司，其余试剂均为国产分析纯。 1．2 分离工艺 为了保持蛋白的活性，实验中先在常温下提取 蛋白质，然后再提高温度提取多糖，并采用泡沫分离 技术来取代 Sevag溶剂萃取以去除多糖溶液中的蛋 白质。螺旋藻中藻胆蛋白和多糖分离工艺如图 1所 示。 图 l 螺旋藻活性组分分离纯化工艺 螺旋藻粗粉先经细胞破碎．用水溶液多级抽提 蛋白质，上清液经冻干后即为藻胆蛋白粗品。在蛋 白的精制过程中，通过调节硫酸铵的饱和度来沉淀 藻胆蛋白，可去除大量核酸组分及其他杂质 ；然后经 pllacryl S一20O凝胶过滤，使蛋白混合物得到进一 步分离。收集富含藻胆蛋白的组分．采用羟基磷灰 石柱层析，通过磷酸盐溶液梯度洗脱可获得藻蓝蛋 白与别藻蓝蛋白。 经蛋白抽提后，在残渣中加人蒸馏水，8O℃水浴 下加热3—4h。弃去不溶物，采用清华大学化工系 发展的环流泡沫分离技术可从上清液中分离去除大 部分蛋白质。与 Sevag溶剂萃取过程相比较，这是 一 种处理量大、效率高、简单易行且条件温和的分离 方法 j。经过以上步骤，多糖已提取到水溶液中，且 多糖溶液中的蛋白质得到有效分离。多糖溶液经真 空浓缩、冰冻干燥后即可得到螺旋藻粗多糖。采用 SephacrylS一100和 Se G一200凝胶层析来进 一 步纯化螺旋藻粗多糖，收集主要多糖组分，冰冻干 燥后得到一种尚未见报道的螺旋藻糖蛋白。 2 特性研究 2．1 藻蓝蟹白 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白具有各自特殊的光谱性 质，一般用此特征来进行鉴别 分别测量分离纯化 得到的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的紫外可见吸收光 谱，藻蓝蛋白在 278、360和 620rim处有特征吸收蜂， 别藻蓝蛋白在 278、350、650 nfn处有最大吸收峰，均 与文献报道一致 。 白产品 采用瑞典 Pharmaeia Bioteeh AB制造 的 PhasI System"电泳设备对藻蓝蛋白进行等电聚焦实验，所 选择的 梯度为3-9。结果(图2)表明本实验获得的 藻蓝蛋白为单一纯，藻蓝蛋白的等电点为4．3。 藻蓝蛋白_+ f p q ) 图 2 等电聚焦图谱 盛撬 bI=3 50 1JI=4．55 pJ=5 20 =5．85 pi=6．55 pI=7 35 1JI#8．15 pJ=8．45 pJ=8 65 分析由上述纯化过程所获得的藻蓝蛋白的氨基 酸组成和含量，样品按常规处理，用 日立 853—50型 氨基酸自动分析仪测定。结果如表 1所示。 表 1 藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量，％ 氨基酸 Taa 甲^ s叮 Gla Cdy 』^a 印 古量 12．8 5．9 6．1 13．5 5．9 9．9 壁 竺 ! ： 音量 5．4 ” 6．5 9．0 4．1 4 0 5．4 氨基酸 ro Pro 音量 维普资讯 http://www.cqvip.com 12 精 细 化 工 FINECt~ CALS 1999年 总第 16卷 红外吸收光谱采用 KBr压片，用 SHIMADZU FTIR一8201PC红外光谱仪测定。藻蓝蛋白的红外 光谱如图 3所示 。 图3 藻蓝蛋白的红外光谱 藻蓝蛋白分别在 3200、1650、1550、1100、1050和 650em 处有特征吸收峰。红外光谱为藻蓝蛋白的 鉴定提供更丰富的依据。 2．2 螺旋藻糖蛋白 螺旋藻糖蛋白SDS—PAGE电泳图谱如图4所 示。显示为一条带，表明所得的螺旋藻糖蛋白为单 一 纯度，根据蛋白质分子量标准曲线可知该糖蛋白 的分子量为 130kd。 标准分子量蛋白质 ~ n(67 000) o．山邮血(43 000) a1 - ‘" 咽m( 30D) 所示。红外光谱显示出典型的多糖特征吸收谱图． 螺旋藻糖蛋白分别在 3411、2941、1650、1540、1255、 1028、871和846cm 有特征吸收峰。其中3411cm 为伊一H伸缩振动区．2941cmI1为 c—H伸缩振动 区．1650cm 为酰胺羰基。红外光谱在 M6cm 有吸 收峰，在 890em 附近投有吸收峰，这表明多糖是以 n．型糖苷键相连 。 渡数，c血。‘ 图5 螺旋藻糖蛋白红外光谱图 3 绪论 采用凝胶过滤和羟基磷灰石柱层析．从国内人 工养殖的钝顶螺旋藻中分离得到藻蓝蛋白和别藻蓝 蛋白．其吸收光谱与文献报道一致。本方法获得的 藻蓝蛋白为电泳纯．其等电点为 4．3。得到一种螺 旋藻糖蛋白不同于现有文献报道的多糖。采用抽 提、环流泡沫分离去除蛋白质和凝胶层析技术获得 的糖蛋 白分子量为 130kd，糖部分的质量分数为 69％，红外吸收谱 图表明这种多糖含有 n．型糖苷 键。 图4 螺旋藻糖蛋白SDS—PAGE图谱 参 考 文 献 分析螺旋藻糖蛋白中糖链占糖蛋白的质量分 数，凋量结果表明含糖 69％．糖蛋白肽链部分的氨 基酸检测分析结果如表 2所示。 表2 氨基酸组成及占残基中的质量分数，％ 氨 酸 aIl Gly Ⅱe h^ 吉量 13．96 I2．79 10．46 9．8B B．I4 5．肛 5．81 5．81 5．札 劓 馘 雎 鼬 Trp 吉量 5．23 5．23 4 3．帮 2 9I ⋯ ⋯ 对螺旋藻糖蛋白的红外光谱进行检测，如图5 [1] 嘶o C．[J]_№ 曲“- ：lRvviv~．1983，47：551． [2] sd 】L,Sb]d~G．[】]．Proc^ m AadOral Pathd．1986．40 ∞ ． 。 [3] 左绍远．[J]．中国生化药物杂志．1995．16(6)：255． [4] 韩宝江．庞启探．阮缝红．【】]．植物学报，1992．34(10)：蝴 ． [5] 庞启耀．韩宝江，阮继红．[】]．生物化学与生曲暂理学报．1989 20(5)：445． [6] G gW．嘶 Y z．[J]．0lh坤晴 皿 0f0Hni曲 ，N96，4(3) 279． [7] LiuzH，vt ．[J]． ∞ m6∞．1997．6(6)：353． [8】 ＆：gI Hw，K，血 J H．H哪丑础 0f P．yol l Method[M] c b -(hive~ P ．1978．72． [9] 林红卫，等．[J]．精细化工．1998，15(1)：18． ∞ ∞ O ， 葶 维普资讯 http://www.cqvip.com 第2期 赵景联，等：固体超强酸 zr02一SO, 一催化合成核黄素四己酸酯 13 [10] 舡 dd H [n Adv Cm4xlaydr Chem．1964，19：31 啦稿日期：1998—07—12 作者简介 ：殷钢(1975 )．男，1996年毕业于清华大学化 学工程系，现为清华大学化工系博士研究生。 Isolation and Characterization of Biliproteins and Polysaccharides from 砌 YIN Gang，LI Chen，HE QiI1g—hua，LIU Zheng．YUAN Nai-ju，DING Fu—xin (n ，拥 ofChem／cdD 肭 ，乃 Un／vers／ty，岛 100084，China) Alaaa'aet：A new separation scheme was developed for recover'and isolation of billprotems and polysaccharides from mdina culturedin southern China．Isolation of bilipro~insw衄aecoraplished with gdfiltration on Sephac~'l 200and chmmatography∞ hydroxylapafite．The isoelectric point，amino acid composition and pec of c—ohycocyanin were detem,2ned respectively．A 130kd glycoprotein from sp purified by foam separation in a loop bubble c0lumn and chromatography∞ Sephad~ G 200．The h~ eneity ofthis glycoproteinWaS proven by SDS—PAGE．m mqalysis of this glyeoprotein showed the typical~soipfion of polysaccharide and indicated the existence of口一glycoside linkage KeywDr‘k： ru／／na； phycocyanlrt；glyeopmtein；charaeterlzation PaperNo：1003—5214(1999)02—0010—13 Foundati~ ilena：Grantedby themajor reseach projeet of StateNmth Five-year Plan(96C一03—04—05) I ／ 固体超强酸 ZrO2一SO42一催化合成 核黄素 四乙酸酯’ ．越 堑盘吐 (西安交通大学化学工程学院精细化工系，陕西 西安 71OO49) 6 、2， 摘要：对固体超强酸 z 一SO4 一催化台成核黄素四己酸酯进行了研究。核黄素与己酸酐摩尔 比1：40，催化荆用量为反应物总质量的 8．0％，反应温度 舯℃，反应时间 2．5h，核黄素四zl酸酯 产率可达 76．9％。z 一SO, 一催化活性高于 n02一SO4 和 F 一 卜 ，zr02在 1mol／L S04中浸渍 24h，∞D 焙烧 3h催化活性最高。 { 关键词：整重塞四互醴髓i星堡桓翌墼；毽± 何 2 。 中圈分类号：T 66．2 文献标识码：A 文章编号：1003—52l4(1999)02—0013—16 核黄素四乙酸酯是一种油溶性维生素 岛 衍生 物，其药效迅速、持久，在相同服用量下，体内有效浓 度可从维生素 B2的4—6h延长至60～90d，被称之 为长效维生索 Ⅲ。它的合成方法是采用硫酸作 催化剂．在毗啶介质中由乙酰氯和核黄素反应制 · 基金项 目：西安交通大学理科基础研究基金资助项 目(9707) 备 。其缺点是产品质量差，设备腐蚀严重，后处理 复杂，污染环境等。本文报道的是利用 z 一so, 一 固体超强酸催化核黄素和乙酸酐合成核黄素四乙酸 酯的研究。作者在考察M 0 型固体超强酸的催化 活性及制备条件基础上，重点研究了z 一SO, 一催 维普资讯 http://www.cqvip.com