出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法 中华人民共和国进出口商品检验行业 SN 0172-92 代替 ZB X09 003-86 Method for detection of staphylococcusaureus in food for export 1 主内容与适用范围 本标准了出口食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 供常规平板计数用的基本设备与材料。 2.2 L 形玻璃棒。 3 培养基和试剂 3.1 普通肉汤培养基。 3.2 胰蛋白胨大豆肉汤。 3.3 Baird-Parker 培养基。 3.4 甲苯胺蓝-DNA 琼脂。 3.5 生理盐水。 3.6 凝固酶试验兔血浆。 4 样品制备 4.1 固体或半固体食品: 以无菌操作称取 25g 样品,放入装有 225mL 灭菌生理盐水的灭菌 均质杯内,于 8000r/min 均质 1～2min,制成 1:10 样品匀液。 4.2 液体食品: 用灭菌吸管吸取 25mL 样品,放入装有 225mL 灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成 1:10 样品匀液。 4.3 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 5 检验步骤 5.1 最近似值(MPN)测定法 适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球 菌。 5.1.1 选三个连续稀释度,从每个稀释度分别取 1 mL 稀释样品液,接种 3管含 10％氯化钠 胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置 36±1℃培养 48 h。 5.1.2 用 3 mm 接种环,从有细菌生长的各管中移取 1 环,划线接种于表面干燥的 Baird-Parker 琼脂平板,置 36±1℃培养 45～48h。 5.1.3 从有细菌生长的每一平板上至少挑取 1个可疑金黄色葡萄球菌菌落[见附录 B(参考 件)],移种到肉汤培养基中,置 36±1℃培养 20～24 h。 5.1.4 取肉汤培养物 0.3mL 同 0.5mL 凝固酶试验兔血浆于 8mm×100mm 试管内充分混合, 置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜 时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜 检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验[见附录 C (补充件)]等} 加以证实。 5.1.5 结果 根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表 [见附录 D (补充件)],报告金黄色葡萄球菌的 MPN/g (mL)。 5.2 平板表面计数法 适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于 10/g(mL)的食品。 5.2.1 选三个连续稀释度,从每个稀释度分别取 1 mL 稀释样液,接种至 3 个表面干燥的 Baird-Parker 琼脂平板上(如：0.4mL-0.3mL-0.3mL)。 5.2.2 以 L 形玻璃棒将接种物涂布于琼脂表面,避免涂到平板边缘,将平板正置直至接种物 被培养基吸收,将平板翻转,36±1℃培养 45～48 h。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 5.2.3 挑选有 20～200 个菌落的平板进行计数。如果有数种菌落皆类似金黄色葡萄球菌, 则分别计算和记录每一类型的菌落数。当最低稀释度的平板的菌落数小于 20 时,仍可选用。如 平板上的菌落数大于 200,其中有些菌落具有典型金黄色葡萄球菌的外观,同时在其高倍稀释度 未出现典型菌落者,亦可用这些平板进行金黄色葡萄球菌计数,但不能把非典型菌落计算在内。 5.2.4 从可计数的各类型菌落中至少各选取1个菌落,参照5.1.3～5.1.4条进行凝固酶试 验。 5.2.5 报告结果将呈凝固酶阳性的菌落所代表的 3 个平板上的菌落数相加,并乘以样品 稀释倍数,即以此数报告为所检查食品中的金黄色葡萄球菌数/g(mL)。 5.3 非选择性增菌法 适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 5.3.1 取 1 : 10 稀释的样品液 10 mL,接种于 10 mL 双料胰蛋白胨大豆肉汤中,36±1℃培 养 2h。 5.3.2 再加入 20mL 含 20％氯化钠的单料胰蛋白胨大豆肉汤,36±1℃培养 24±2h。 5.3.3 取上述培养物 0.2 mL,分别涂布于 2个表面干燥的 Baird-Parker 琼脂平板上,36± 1℃培养 46±2h。 5.3.4 从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,参照5.1.3～5.1.4条进行凝 固酶试验。 5.3.5 报告结果 如发现有凝固酶试验阳性的菌落,即报告 1g(mL)食品中有金黄色葡萄球菌存在,否则为阴 性。 附 录 A 培 养 基 和 试 剂 (补充件) A1 普通肉汤培养基 成分： 牛肉膏 5.0g 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 氯化钠 5.0g 蛋白胨 20.0g 蒸馏水 1000.0mL 制法：将以上成分混合加热溶化,调至 pH7.4～7.6,分装试管,121℃高压灭菌 30min。 A2 胰蛋白胨大豆肉汤 成分： 胰蛋白胨 17.0g 植物蛋白胨 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.5g 葡萄糖 2.5g 蒸馏水 1000.0mL 制法：将各成分溶于蒸馏水中,必要时加热使完全溶解,分装于试管或玻瓶中,121℃ 高压灭 菌 15min,最终 pH7.3±0.2。 注：制备双料胰蛋白胨大豆肉汤时,除蒸馏水外,其他成分加倍,配制 10％或 20％氯化钠胰 蛋白胨大豆肉汤时,可将氯化钠量增加至所需浓度。 A3 Baird-Parker 培养基 成分： 胰蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 酵母膏 1.0g 丙酮酸钠 10.0g 甘氨酸 12.0g 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 氯化锂(LiCl·6H2O) 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 950.0mL 制法：将各成分加于蒸馏水中,加热煮沸使完全溶解,冷至 25℃,调至 pH7.0±0.2,分装每瓶 95mL,121℃高压灭菌 15 min,临用时加热溶化琼脂,冷至 50℃左右,于每 95mL 加入预热至 50℃ 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL,摇匀后倾注平皿培养基,应是致密不透明的,使用前在冰箱贮存不 得超过 48 h。 卵黄亚碲酸盐增菌剂配制： 将新鲜鸡蛋浸泡在适当的 HgCl2 溶液(1:1000)中约 1 min,以无菌操作打开鸡蛋,使蛋黄与 蛋白分开,将蛋黄加于生理盐水中(3＋7,V/V)充分摇匀,于 50mL 蛋黄乳液中加入 10mL 过滤除菌 的 1％亚碲酸钾水溶液,混匀,4±1℃贮存。 A4 甲苯胺蓝-DNA 琼脂 成分： 脱氧核糖核酸(DNA) 0.3g 琼脂 10.0g 氯化钙(CaCl2 无水) 1.1g 氯化钠 10.0g 甲苯胺蓝(O) 0.083g 三羟甲基氨基甲烷 6.1g [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] 蒸馏水 1000.0mL 制法：将三羟甲基氨基甲烷溶解于蒸馏水中,调至 pH9.0,除甲苯胺蓝(O)外将其余各项成分 加热使溶解。再将甲苯胺蓝(O)溶于培养基中。分装于塞有橡皮塞的烧瓶中。如立即使用可不需 灭菌。已灭菌的培养基在室温可存放 4个月无变化,并经数次熔化后仍可使用。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 A5 生理盐水 成分： 氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000.0mL 制法：将氯化钠溶于蒸馏水中,分装于适当容器中,121℃高压灭菌 15 min。 A6 凝固酶试验兔血浆 临用时取 3.8％(取柠檬酸钠 3.8 g 加蒸馏水 100 mL,待溶解后过滤,121℃高压灭菌 15min) 柠檬酸钠 1份,加入新鲜兔血 4份,混匀后放冰箱中使用球沉降(或以 3000r/min 离心 30min)后 取上清液进行试验。 附 录 B 典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落 (参考件) 金黄色葡萄球菌的单个菌落在 Baird-Parker 琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润, 直径 2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外 常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没 有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑 色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。 附 录 C 耐热核酸酶试验 (补充件) C1 取 3mL 甲苯胺蓝-DNA 琼脂平铺于载玻片上制成标本片。 C2 待琼脂凝固后,在琼脂上打成直径 2 mm 的小洞(每个载玻片 10～12 个),抽出小洞中的 琼脂块。 C3 加入约 0.01mL 加过热(在水浴中煮沸 15 min)的供凝固酶试验的肉汤培养物至所制备 载玻片上的小洞中。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 C4 将载玻片置湿室中,于 35℃培养 4h。 C5 阳性反应为在小洞周围形成至少扩展约 1mm 的浅粉红色的晕圈。 阳 性 管 数 阳 性 管 数 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0 0 0 ＜3 2 0 0 9.1 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6.1 2 1 1 20 0 1 2 9.2 2 1 2 27 0 2 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6.2 2 2 0 21 0 2 1 9.3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9.4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3.6 3 0 0 23 1 0 1 7.2 3 3 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 73 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 1 3 3 29 3 3 3 >1100