熊胆牛黄胶囊抗病毒作用的药效学研究

文章编号: 1009- 5276( 2003) 06- 0906- 00 中图分类号:R931. 6 文献标识码:A 收稿日期: 2002- 12- 11 熊胆牛黄胶囊抗病毒作用的药效学研究 郭建生1 胡海蓉1 王小娟2 程丑夫2 贺海波1 吴 萍1 ( 1. 湖南中医学院, 410007, 湖南长沙; 2.湖南中医学院附属第一医院, 410007,湖南长沙 / /第一作者男, 1953年生 ,教授) 摘 要:目的:将熊胆牛黄胶囊开发成治疗急性上呼吸道感染(普通感冒)的新药, 探讨该药的作用机制。方 法: 按常规方法观察该药的体内外对病毒的抑制作用。结果: 熊胆牛黄胶囊体外对 6 种病毒有抑制作用, 其中对 柯萨奇 B 族病 4 型( CoxB4)和副流感病毒Ñ型( HVJ)有显著抑制作用,体内对小鼠流感性肺炎有显著抑制作用, 对流感致小鼠死亡有显著的保护作用。结论: 熊胆牛黄胶囊有较好的抗病毒作用, 是一种有效的抗感冒药。 关 键 词:熊胆牛黄胶囊; 急性上呼吸道感染; 普通感冒; 抗病毒 熊胆牛黄胶囊由熊胆粉、人工牛 黄、青黛等组成, 具有清热解毒、宣肺解 之功效。主要用于急性上呼吸道感 染(普通感冒)等呼吸道病毒感染性疾 病, 适应证候为风热证、外寒内热证。 为证实其疗效, 并说明其主要药理作 用,对其抗病毒作用进行了实验研究, 报道如下: 1 实验材料 药物与试剂:熊胆牛黄胶囊,含量 2. 1g(生药 ) /粒,临床 用量为 18. 9g (生药) /粒, 由湖南中医学院第一附属医院提 供,批号 20010901。病毒唑 (三氮唑核苷) : 为原料药, 湖北 省医药工业研究所产品, 批号: 970508。双黄连胶囊, 含量 0. 4g(成药) /粒 ,临床用量为 4. 8g(成药) /粒, 河北奥星集团 药业有限公司生产,批号: 20010701。 病 毒 流感病毒甲 3 型、柯萨奇 B 族病 4型( CoxB4 )、 副流感病毒 Ñ 型( HVJ)、呼吸道合胞病毒( RSV )、腺病毒 3 型( Ard3)、鼻病毒 14 型和流感病毒亚甲型鼠肺适应株 FM 1。 分别购自中国预防医学科学院病毒学研究所及儿科研究所。 细 胞 人喉癌传代细胞 HEP- 2 株, 购自卫生部药品 生物制品检定所。 细胞培养液 含 10%小牛血清、0. 29mg 谷氨酰胺/ ml、 100u/ ml青、链毒素的 Eag le. MEM(日本日水制药株式会社 出品) ;细胞维持液, 除所含小牛血清为 2% 外, 其他含量均 同培养液。 主要仪器 CO2 培养箱, 日本 Yamato松株式会社产品。 倒置显微镜,日本 0lympus产品。 动 物 昆明种小鼠,体重 14 ? 1g, 雌雄兼用。由北京 生物制品研究所实验动物室提供, 合格证号: 京动许字 ( 1999)第 012 号。 2 方法与结果 熊胆牛黄胶囊的体外抗病毒作用 对 Hep- 2 培养细 胞的毒性试验 将药液用 Eag le. s培养作 1B20~ 1B1280 倍比稀释,加到 已长成单层的 HEP- 2 细胞培养板中, 100ul/孔, 每个稀释 度药液做 3 个复孔, 同时设正常细胞对照。将培养板置 37 e 5% CO 2培养箱中培养四天,每日倒置显微镜下观察细 胞生长情况,确定细胞不出现明显退变的最低释稀倍数, 实 验时顺延做到最小有效浓度(即最大稀释倍数)。按 Reed- Muench法计算 50% 毒性浓度 ( TC50 ) 和最大无毒浓度 ( TC0) ,结果见表 1。 表 1 熊胆牛黄胶囊对培养细胞的 TC0TC50( mg/ml) 药液 原药液 TC0 T C50 熊胆牛黄 100 0. 31 0. 45 双黄连 100 0. 31 0. 45 病毒唑 2. 0 0. 50 0. 71 对病毒致细胞病变作用的影响 已长成单层细胞培养 板,倒掉培养液, 接种 100TCID50的不同病毒液 50ul,置 37 e 5% CO2 培养箱中吸附 1 小时后,倒掉病毒液, 用不含小牛血 清的 Eagle. s 维持液洗细胞面 2 次后, 加入相应稀释度的药 液 100ul/孔。同时设病毒对照、阳性对照及正常细胞对照。 病毒唑的终浓度采用 TC50的 1/ 4。置 37 e 5% CO2 培养箱 中培养,每日倒置微镜下观察细胞病变,当病毒对照组细胞 病变为+ + + + 时实验结果。细胞病变按六级判 断,并按 Reed- Muench法计算 50%有效浓度( EC50 )和治疗 指数( T I ) , 结果见表 2。 表 2 熊胆牛黄胶囊对病毒致细胞病变的影响 药物 浓度mg/ ml 细胞病变程度( CPE) 流感病毒 副流感 CoxB4 RSV Ad- 3鼻病毒 牛 222 222* 222* 223 222 222 黄 232 233* 223* 333 222 333 熊 333 333 444 444 323 333 胆 333 444 444 444 333 444 双 322 232 333 332 222 233 黄 233 334 444 433 232 333 连 333 444 444 444 333 443 333 444 444 444 333 444 病毒唑 0. 17 - - - - - - 病毒对照组 333 444 444 444 333 444 注: / - 0表示无细胞病变。 表中结果显示: 熊胆牛黄在体外实验时, 流感病毒、 HVJ、RSV、CoxB4、Ard3 及鼻病毒的细胞病变较病毒对照组 均有所减轻, 其中 HVJ、CoxB4 有显著性差异 ( P < 0. 05) , #906# 中 医 药 学 刊 2003年 6月第 21卷第 6期 EC50分别为 0. 19、0. 13mg / ml, T I 为 2. 4和 3. 3。 熊胆牛黄胶囊的体内抗病毒作用 对小鼠流感病毒性 肺炎的抑制作用 取小鼠 70 只, 按体重随机分成 7 组,分别 为正常动物对照组、病毒感染对照组, 熊胆牛黄胶囊 3 个剂 量组、病毒唑组、双黄连胶囊组。除正常对照组外,将小鼠用 乙醚轻度麻醉,以 15 个 LD50流感病毒液滴鼻感染, 每只 0. 05ml。从感染前一天开始灌胃给药, 每天 2 次, 每次 0. 5ml, 连续 5天, 对照组在同等条件下蒸馏水灌胃。第 6 天称取小 鼠体重后解剖,肉眼观察肺部病变, 记录肺部肝样实变的程 度,摘取全肺称重, 逐个计算肺指数值, 并求出肺指数抑制 率,结果见表 3。 表 3 熊胆牛黄胶囊对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用 组别 剂量 ( g/ kg/ d) 鼠数 (只) 肺指数值( X? SD) 抑制率( % ) 正常对照组 - 10 0. 92 ? 0. 05 病毒对照组 - 10 1. 88 ? 0. 38# # 病毒唑组 0. 07 10 1. 42 ? 0. 20* * 24. 46 双黄连胶囊组 1. 24 10 1. 70 ? 0. 24 9. 57 熊胆牛黄(大) 9. 74 10 1. 50 ? 0. 42* 20. 21 熊胆牛黄(中) 4. 87 10 1. 58 ? 0. 23* 15. 59 熊胆牛黄(小) 2. 44 10 1. 68 ? 0. 25 10. 63 注:与正常对照组比较: # # P < 0. 01。与病毒对照组比较: * * P < 0. 01, * P < 0. 05 表 3 结果:受试药物的大、中剂量对流感病毒引起的小 鼠肺炎均有明显的抑制作用, 抑制率分别为 20. 21% 和 15. 59%。 对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用 取小鼠 120 只, 按体重随机分成 6 组。分别为熊胆牛黄胶囊三个剂量组、病 毒唑组、双黄连组及病毒感染对照组。各组小鼠用乙醚轻度 麻醉后,以 2 个 LD50流感病毒液滴鼻感染, 每只 0. 05ml。从 感染前一天开始灌胃给药, 每天 2 次, 每次 0. 5ml, 连续 7 天。累计感染后小鼠的死亡数, 计算死亡率、保护率及生命 延长率。结果采用卡方检验及 T 检验进行统计学处理, 见 表 4、5。 表 4 熊胆牛黄胶囊对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 组别 剂量 g/ kg/ d 动物数 (只) 死亡数(只) 死亡率( % ) 保护率( % ) 感染组 - 20 18 90 病毒唑 0. 07 20 8 40 55. 56* * 双黄连胶囊 1. 24 20 16 80 11. 11 熊胆牛黄(大) 9. 74 20 11 55 38. 89* 熊胆牛黄(中) 4. 87 20 13 65 27. 78 熊胆牛黄(小) 2. 44 20 14 70 22. 22 注:与感染对照组比较: * * P < 0. 01 * P < 0. 05 表 5 熊胆牛黄胶囊对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 组别 剂量 g/ kg/ d 动物数 (只) 平 均存活天数 延长率( % ) 感染组 - 20 10. 0 病毒唑 0. 07 20 12. 8 28. 5* * 双黄连胶囊 1. 24 20 10. 6 6. 0 熊胆牛黄(大) 9. 74 20 11. 1 15. 0* 熊胆牛黄(中) 4. 87 20 11. 1 10. 5 熊胆牛黄(小) 2. 44 20 11. 3 12. 5 注:与感染对照组比较: * * P < 0. 01 * P < 0. 05 表 4、5 结果显示:小鼠感染病毒后 14 天内,熊胆牛黄胶 囊大剂量组小鼠的死亡数较感染对照组明显减少, 保护率为 38. 89%。小鼠平均存活天数较感染对照组明显延长,延长 率为 15%。表明熊胆牛黄胶囊在此剂量时对流感病毒感染 致小鼠死亡有一定保护作用。 3 讨 论 上呼吸道感染,简称上感, 是临床最常见的呼吸道传染 性疾病之一。本病 70% ~ 80%以上为病毒感染引起, 主要 有鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒、呼吸道合胞 病毒、腺病毒等。由于病毒类型较多, 人体对各种病毒感染 后产生的免疫力较弱, 并无交叉免疫,其发病率非常高。西 药目前尚无特殊抗病毒药物,临床上对于上呼吸道感染等病 毒感染性疾病主要使用对症处理药物治疗, 亦多有使用抗菌 药物者,效果不很理想, 且由此形成抗菌药物滥用, 其后果日 益为人们所重视。 大量临床实践表明, 中医药在防治感冒上确有所长, 具 有症状缓解较快、副作用较少等特点。熊胆牛黄胶囊处方系 根据古方加减而来, 其所使用药物均有较多的临床应用经 验,使用安全性较好。在实验研究中发现熊胆牛黄胶囊体外 对流感病毒、副流感病毒 Ñ 型 ( HVJ ) , 呼吸道合胞病毒 ( RSV)、柯萨奇 B族病毒 4 型( CoxB4)、腺病毒 3 型( Ard3)及 鼻病毒的细胞病变较病毒对照组均有所减轻, 其中副流感病 毒Ñ型( HVJ) , 柯萨奇 B 族病 4 型( CoxB4)有显著性差异; 体 内对小鼠流感性肺炎有明显抑制作用,对流感至小鼠死亡有 明显的保护作用,表明熊胆牛黄胶囊有较好的抗病毒作用, 故有较好的开发研制的基础。 参考文献 112孙淑云.药理实验方法学1M2. 第二版, 北京:人民卫生出版社, 1991, 12 122李仪奎.中药理实验方法学1M2.第一版,上海:上海科学技术出 版社, 1991, 224, 332 132卫生部药政局编. 新药 (西药 )临床前研究指导原则1S2. 1993, 107 Experimental research of antiviral effects of xiongdaniuhuang capsules 1Abstract2Objective: T o study the mechanisms of Xongdanniuhuang capsules( XDNHC) treat ing acute upper respirato ry tr act infec- tion( common cold) fo r developing a new drug. Met hod: The antiviral effect of t he drug was observed bo th in vitro and in vivo w ith common method. Result: XDNHC has an inhibitory effect on six kinds of virus in v ivo, especially HVJ and CoxB4 The drug w as also found to inhibit peneumonia induced by influenza virus in mice and decrease death rate of mice infected w ith influenza virus obv ious- ly. Conclusion: XDNHC has a sound antiv iral effect , and is an efficient new drug treating common cold. 1Key Words2Xongdanniuhuang capsules; acute upper respiratory tract infection; common cold; antiviral #907# 熊胆牛黄胶囊抗病毒作用的药效学研究