基因芯片简介

null基因芯片技术及其在医学领域的应用 基因芯片技术及其在医学领域的应用 null123基因芯片简介基因芯片原理基因芯片在医学领域的应用一、基因芯片简介 一、基因芯片简介 随着后基因组时代的来临，面对大量基因的结构信息，需要对其功能进行大规模的研究。生物芯片随之应运而生，它能以大规模、高通量、自动化的方式对基因进行研究。同义名： Gene chip DNA microchip DNA array DNA microarray Oligonucleotide arraynull BCC研究公司发表的生物芯片市场调查称，微阵列（芯片）和Lab-on-a-Chip是生物芯片产品家族的主要成员，2007年，全球生物芯片市场大约为19.379亿美元，2008年将达到21.156美元，2013年这一市场是38亿美元，年增长率高达12.7%。null什么是基因芯片 1、基因芯片是1-100million的分子生物学探针排布在一块指甲盖大小（1-2cm2）的玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶或金属载体材料上。2、通过杂交，探针与 目标靶分子结合。3、通过荧光标记的分子能够呈现不同的荧光发射谱征，用激光共聚焦显微扫描或CCD相机收集信号。生物芯片分类 生物芯片分类 基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类：基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类：生物电子芯片 凝胶元件微阵列芯片 药物控释芯片毛细管电泳芯片 PCR扩增芯片 集成DNA芯片 毛细管电层析芯片光学纤维阵列芯片 白光干涉谱传感芯片二、基因芯片原理 二、基因芯片原理 核酸杂交技术（sequencing by hybridization, SBH）是基因芯片应用的基础。任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列： 　　(1)　　　　　CTCATATG 　　(2)　　　　 GCTCATAT 　　(3)　　　 AGCTCATA 　　(4)　　 TAGCTCAT 　　(5)　　TTAGCTCA这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交。null对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推 出靶DNA中的所有8 nt亚序列。 由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA基因芯片的相关技术示意图基因芯片的相关技术示意图●PCR扩增 ●靶基因标记●表达差异分析 ●多态性分析 ●再测序●生物信息学 ●数学优化 ●数据库芯片载体和载体的修饰芯片载体和载体的修饰载体的特征： 1、具有良好的光学性质，能适应透射光和反射光的测量。 2、载体表面具有可以反应的活性集团。 3、单位载体上分子数有最大容量。 4、载体应是惰性并具有足够的稳定性。 5、具有良好的生物兼容性。载体的分类： 1、无机材料 2、天然有机聚合物 3、人工合成的高分子聚合物 4、高分子聚合膜 芯片载体 芯片载体 几种常用载体：1、膜： 与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需另外包被（如尼龙膜）。 2、玻璃片：应用广泛，材料来源方便，经表面处理的玻片是一种持久的载体， 可耐受高温和高离子强度。 3、硅片： 具有良好的导热性，但是不透明，不利于光学检测，具有比较强的 表面非特异性吸附。一般毛细管电泳时不选用硅片。 4、塑料： 容易塑光、光学透明、化学惰性与稳定（如聚二甲基硅烷PDMS）。载体修饰 载体修饰 片基表面必须存在功能性化学基团，以便偶联生物分子。活化的表面带有 赖氨酸基团的芯片是目前最常见的活化方式之一。其原理是将玻璃表面的羟基 转化成带活性赖氨酸表面的基团，然后DNA分子上的氨基基团与芯片上的肽键 相互作用而形成共价连接：芯片设计 芯片设计 基因芯片设计主要包括两个方面: 1、探针的设计:指如何选择芯片上的探针 2、探针在芯片上的布局:指如何将探针排布在芯片上确定芯片所要检测的目标对象: 1、查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 2、序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列 3、数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息 在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性探针的选择探针的选择分子信标肽核酸探针肽核酸( peptide nucleic acid , PNA)——是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的DNA类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。 PNA分子内不会形成二级、三级结构 DNA与PNA杂交不需要盐离子带一段互补发夹结构的短序列，与靶分子结合时，构型改变，使得猝灭分子离开荧光分子，发出荧光。引入报告分子可以使检测信号成倍放大芯片制作芯片制作基因芯片的制作方式原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成 分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成 原位光蚀刻合成 原位光蚀刻合成 在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。 鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究： ⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率； ⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。 光导原位合成 光导原位合成 优点：很少步骤合成大量探针序列。探针 密度大。 缺点：探针长度受限，只能合成30nt左右探针。且合成技术难度大。原位喷印合成 原位喷印合成 原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。直接点样直接点样 合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。合成好的寡核苷酸探针主要利用共价键连接在片基上。 主要有以下几种: 硅烷化寡核苷酸探针直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列; 硫代寡核苷酸探针通过二硫键与巯基修饰的玻片连接; 氨基修饰的玻片与5c末端带氨基的寡核苷酸探针通过共价键连接; 丙烯酰胺硅烷化的基片与5c-丙烯酰胺修饰的寡核苷酸探针连接。直接点样法直接点样法 优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。 缺点：定量准确性、重现性不好。 样品的制备样品的制备样品的分离纯化 DNA , mRNA或者合成的寡核苷酸 扩增 PCR, RT—PCR，固相PCR 直接从基因公司购买ESTs序列 标记等过程 荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记 分子杂交1. Prepare sample.TargetReference2. Label with fluorescent dyes.3. Combine cDNAs.4. Print microarray.5. Hybridize to microarray.6. Scan.分子杂交null 样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交 与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成 可同时平行检测许多基因序列 影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、探针的GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度、DNA二级结构nullcy3cy5www.amersham.comcy3cy5664 nm510 nm常用的荧光素：cy3 and cy5cyc5更容易退化掉检测分析检测分析1、激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光2、激光扫描仪或激光共聚焦 显微镜采集各杂交点的信号3、软件进行进行图象分析和数据处理基因表达谱基因表达谱Biological SampleFunctional Information红色 上调 黄色 不变 绿色 下调芯片分析软件芯片分析软件Affymetrix公司 Gene Chip Data Mining Tool(DMT) Applied Biosystems BioMerge BioDiscovery公司GeneSight Hitachi Genetic Slystem的 CHIPSpace、DNASIS、DNASpace Stanford大学 Cluster & TreeView Informax公司GenoMax 挪威Bergen大学 J-express Axon Instruments Inc. GenePix Pro Silicon Genetics公司GeneSpring Imaging Research公司ArrayStat Applied Maths公司GeneMaths Media Cybernetics公司Array-Pro Analyzer三、基因芯片在医学领域的应用三、基因芯片在医学领域的应用1、医学基础研究中的应用 2、基因组功能研究中的应用 3、基因型、基因突变和多态性分析 4、疾病的诊断和治疗 5、药学研究 6、中医学领域中的应用1、医学基础研究中的应用1、医学基础研究中的应用 基因组 生物芯片 蛋白质组①DNA水平，包括DNA水平上的基因突变、染色体变异 ②mRNA水平反映了细胞或组织特异性表型和表达模式 ③表观遗传的改变也是各类疾病发生的重要因素 蛋白质是生物功能的主要体现者，对蛋白质水平进行定性、定量的研究，能够真实地解释各种疾病现象。2、基因组功能研究中的应用2、基因组功能研究中的应用 将cDNA文库的克隆扩增，以点阵的形式排列在载体上，用特异性寡合苷酸探针系统与其杂交，对杂交信号进行分析，即可快速对文库中代表不同基因的cDNA克隆予以鉴定和分类。 用不同荧光标记不同组织或者细胞的mRNA。监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达。 芯片技术中杂交测序技术(SBH)及邻堆杂交技术(CSH)即是一种新的高效快速测序方法。3、基因型、基因突变和多态性分析3、基因型、基因突变和多态性分析 美国国家人类基因组研究室将基因芯片应用于双色突变分析。他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1基因的外显子11。应用双色分析，可以更为清楚的监测未知样品与链之间的竞争性杂交情况，进而分析该基因中的不同突变。 1998年，法国T.Livache等就成功的利用基因芯片技术，对人血中的HCV病毒进行了基因型分析。SNP基因芯片的成功将使临床诊断上到一个新的台阶。4、疾病的诊断和治疗4、疾病的诊断和治疗遗传病相关基因的定位 HGP使许多遗传疾病基因得以定位，DNA芯片可一次筛查多种遗传病,既经济快速又敏感可靠。 肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现和定位。 感染性疾病的诊断 人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因，实现真正意义上的“组合检测（profile tests）。 耐药菌株和药敏检测 在遗传疾病诊断中的应用在遗传疾病诊断中的应用目前检测遗传性疾病主要芯片种类： 地中海贫血基因突变检测芯片 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷基因突变检测芯片 囊性纤维化病基因突变检测芯片 酪氨酸酶基因突变检测芯片 线粒体基因病基因芯片应用： 检测基因突变与多态性，用于遗传性疾病的普查和产前检测 遗传性疾病的基因分型 遗传性疾病的物理作图 在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用肿瘤基因表达谱 寻找肿瘤相关基因 肿瘤相关基因的功能研究 肿瘤诊断 筛选抗肿瘤药物和检测肿瘤治疗效果 人类恶性肿瘤中，约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关，目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区（外显子2～外显子11）错意突变和单碱基缺失突变的基因芯片。5、药学研究5、药学研究 新药开发 目前第一个生物分子药物Herceptin已用于乳癌的治疗，并获得美国FDA的批准。 调查药物处理细胞后基因的表达情况 Clarke等用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况，发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。 对药物进行毒性评价 应用芯片查找药物的毒性或副作用，进行毒理学研究。null 在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（high throughout screening），可使新药开发获得技术上的突破。 null 美国斯坦福大学的研究人员开发出一种新型的传感器芯片，可以大大加快药物开发过程。这种由高度敏感的纳米传感器构成的微芯片，可以分析蛋白质如何相互结合，在评估药物的有效性及可能带来的副作用方面迈出了关键一步。 斯坦福大学材料科学和工程学王善祥教授表示：“你可以在单个芯片上放上数千甚至数万个不同蛋白，并运行蛋白结合实验。”null 美国科学家们制造出了一块如橡皮擦大小的“芯片肺”，它可模仿那些穿过整个肺脏的上皮细胞和血管之间边界的许多特征，这一系统或可帮助研究人员非常精准地了解肺脏器官的运作方式，而这些信息是很难从细胞培养或动物研究中获取的。研究人员表示，“芯片肺”可望用于检验新药效果以及人体肺部毒素影响，并终结这些测试所需的动物实验。6、中医学领域中的应用6、中医学领域中的应用 中药中众多成分中有效成分的筛选、有效药物的筛选、中药毒理学过程均被大大简化，将推动中药的迅猛发展。nullThank you