RACE技术的原理和操作

RACE技术的原理和操作 RACE技术的原理和操作 发布日期:2009-11-27 热门指数:15803 分享 | 收藏 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995:Schaefer，l995: Chen，1998: Bespalova等，1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60? -70?)有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。 TM随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的Maratho技术和 TM SMARTRACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用Ma TMTM Trathon所得到的片断总是比采用SMARTRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonMTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMART TMRACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 TMSMART 3'-RACE的原理 利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1) Figure 1. TMSMART 5'-RACE的原理 先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。 Figure 2. 实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为: 第一，在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败; 第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。 随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法 1. 反转录(RT)反应。 2. Hybrid RNA的分解。 3. 单链cDNA的自身连接。 4. PCR扩增5'未知区域。 5. 目的DNA片段的切胶回收。 6. DNA序列测定。 原理见Figure 3。 Figure 3. , 请您对这篇文章发表看法 , (93) (65) , 开放阅读框(ORF) 来源:Biox.cn | 2008-11-25 9:31:27 | 阅读 1881次 1. 如果遗传密码是不重叠的三联体，那么会有三种可能的方式将核苷酸成蛋白质, 这三种可能的读码(Reading frame ) 方式称为读码框架。比如序列: ACGACGACGACGACGACG，可能的读码框架就有以下三种: ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC 一个由能翻译成氨基酸序列的三联体构成的阅读框称为开放读框(Open reading frame，ORF) 。一段翻译成蛋白质的序列有一个阅读框架，它有一个特殊的起始密码子(AUG)，从此延伸出一系列代表氨基酸的三联体，一直到在三种类型的终止密码子上结束(见第5 章)。如果终止密码子频繁出现，就会阻止阅读框被翻译成蛋白质。一个序列的三个阅读框全部被阻断，那么它就会失去翻译成蛋白质的功能。 当获得一个未知的DNA 序列后，就可分析其三个读码框是被阻断的还是开放的。在任何一段DNA 中，通常不会超过一个读码框是开放的(图1.26) ，因为替换的读码框被频繁出现的终止密码子阻断。一般情况，开放读框不可能太长。如果它不翻译成蛋白质，将不存在阻止终止密码子聚集的选择压力。证明序列是开放框是确定该框架能翻译为蛋白质的首要证据。一个不能表达蛋白质的开放读框被称为不确定读框(URF) 。 2. 一个DNA顺序可能有3种阅读框，但只有一种具有编码的作用，称为开放阅读框(open reading frame or ORF)。有的阅读框因终止密码出现频繁故不能生成蛋白，这种阅读框称为封闭阅读框(block reading frame)。若一个顺序所有的三个阅读框都是封闭的，则它无编码蛋白的功能。一个翻译成蛋白的顺序有一个阅读框，开始于AUG起始密码子，通过一系列有义密码子，直到终止密码子结束。通常3个阅读框中总有封闭 阅读框的存在。 当获得了一个未知功能的DNA区域的顺序，要通过分析来确定阅读框是开放的还是封闭的。在任何一个DNA顺序中往往只有一个开放阅读框。ORF似乎并不是随机存在。如果一个顺序不翻译成蛋白质，那么将无选择压力来阻止其中产生无义密码子(有时无义密码子这个词也用于终止密码子。“无义”是个错误的名词，因为这种密码即使在突变基因中中断了蛋白质合成，但仍有含义的)，这样一个长ORF的鉴别乍看起来这个 顺序好象是可以翻译的。一个ORF未鉴别出蛋白产物，有时称其为非鉴定阅读框(unidentified reading frame，URF)。 3. 开读框架(Open Reading Frame: ORF)的预测常与第一个ATG和终止密码子的确定相关，但由于EST序列相对较低的测序质量，在测序过程中出现的碱基删除或插入错误(称为indel错误)将引起读框移动，甚至出现假终止密码子，所以，仅凭第一个ATG和终止密码子是不足以确定ORF的