胰高血糖素样肽-1类似物新药的研发进展

· 866· rft图生物制品学杂志 201 1年7月第 24卷第 7期 Chin J Biologi~·aIs July 201 1，Vt，1．24 No．7 【综述 】 胰高血糖素样肽．1类似物新药的研发进展 闰荣 杨子义 【摘要 】 胰高血糖素样肽一1(Glueagon—hike peptide一1，GLP一1)类似物具有独特的血糖浓度依赖性的控制血糖效果，为2， 糖尿病患者提供了新的用药选择。新药研发多以人体内源性 GI P一1及其天然类似物Exendin一4为基础。本文埘 GI P一1干¨ Ex— endin一4的结构、重要位点、改构策略 、修饰方式、新剂型以及 GLP一1类似物新药研发的进展作一综述．． 【关键词】 胰高血糖素样肽一1；Exendin一4；糖尿病，2型；新药 【中国图书分类号】R587．1【文献标识码】A 【文章编号】l004—5503(201 1)07—0866—04 Progress in Research and Development of Glucagon-like Peptide 1 Analogues as New Drugs YAN Rong，YANG Zi—yi(Beijing Haiyan Pharmaceutical Co．Ltd，Yangtze River Pharmaceutical Group，Beijing 102206，China) 【Abstract】 Because of their speeial blood glucose concentration—dependent effect in controlling blood glMOOSe，glut',agon—IikI- peptide一1(GLP一1)analogues provide a UCW ehoice for the patients with type 2 diabetes mellitus( I'2DM )．Mos!developnlenls ot new drugs are based()n the endogenous human GLP一1 and their natural analogue Exendin一4．This paper reviews the strut。tuI(、s，imporlanl sites．remodeling strategies，modification mode and new forms of GI P一1 and Exeudin一4 as well as GLP一1 analogues as new drags 【Key words】 Glucagon—like peptide一1(GLP一1)；Exendin一4；Diabetes mellitus，type 2；New drugs 近20年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患 病率急剧升高。目前，全球糖尿病患者已近 2．5亿， 我国已逾 7 000万，增长率是欧美国家的2倍。针对 胰高血糖素样肽．1(Glucagon—like peptide一1，GLP 1) 受体通路的GLP一1受体激动剂 、二肽基肽酶Ⅳ(Di— ptidyl pepidiaseIV，DPP1V)抑制剂是近年来 2型糖 尿病治疗药物研究的新热点。 GLP一1及其类似物的促胰岛素分泌作用呈明显 的血糖依赖眭，在血糖浓度正常或低于正常时，GLP-1 多肽几乎不起作用，因此低血糖发生的几率低。同 时，GLP一1及其类似物可改善胰岛 B细胞功能并促 进 B细胞增殖，并可减轻体重 ，降低血压 ，因而在 2 型糖尿病治疗领域具有独特优势。本文对 GLP．1及 其天然类似物的结构、重要位点、改构策略、修饰方 式、新剂型以及GLP．1类似物新药的研发进展作一 综述 、 1． GLP．1多肽的结构 1 983年，Mclntyre等在分析胰高血糖素原(Pr0g— lucagon，PG)的基因序列时发现了 GLP一1。GLP一1是 一 种由回肠内分泌细胞分泌的肠肽类激素，由胰高 作l者 位：扬子r【药业 集团北京海燕药业有 限公司 (北京 l02206) 通汛作者：杨子义，E—mail：yangziyi62O8O8@gmaij．COIII 血糖素原经酶解去掉 N．末端的 6肽，c一末端酰胺化 而成活性形式的GLP．1(7～36)NH 。二维核磁共振 研究发现，GLP一1南3段随机螺旋片段[GLP．1(1～ 7)、G1 P．1(7～14)、GLP一1(18～29)]和 1个连接 域[GLP一1(15～17)]组成。GLP一1的N一未端 域具 有结合 GLP．1受体和引发促胰岛素分泌相关信 转 导反应的功能。 采用氨基酸替换分析 ，以 Ala替代 His 、G1Y“’、 Phe 、Thr 、Asp 的改构体受体亲和力显著降低， 实了这些位点对于其生物活性的重要性。网二色谱 分析证实，Phe 和 Ile凹有助于维持多肽的■级结 构，增强多肽与受体的结合。 2． GLP．1多肽的活性 GLP．1在人体血循环中可被 DPPIV和中性肽内 切酶 24．1 1(Neutral endopeptide，NEP24．1 1)迅速降 解。DPPIV是一种广泛存在于体内的丝氨酸蟹r1酶， 其能快速降解 GLP．1 N一末端的His7-Ala ，使其火去 生物活性。NEP24．1 1在体内可水解芳香族氨基酸 和疏水性氨基酸的氨基端肽键，GLP．1存在其 6个 水解位点：Asp al16 Ser ~-Tyr19,Tyr’9-Leu2~GIU ＼Phe Phe~-Ile凹和 Trp31-Leu勉。这导致 GLP一1的体内半衰 期仅为 1～2 min，因此，天然 GLP一1不能作为药物 供临床使用。 中国生物制品学杂志2011年7月第24卷第7期 Chin J Biologicals July 2011，Vo1．24 No．7 ·867· 3． GLP．1的天然类似物 Exendin．4 Exendin．4是 1992年从美洲大蜥蜴 Gila(HeIod erma suspectum)的唾液中分离得到的，与 GLP 1(7～ 36)的氨基酸序列同源性约为 53％。Exendin．4多肽的 二级结构主要为 3部分：N．末端(1～8)为不规则卷 曲，中间(9～30)为 OL．螺旋，c．末端(31～39)含有 1 个特殊结构“Trp．Cage”。N．末端、中部 仅一螺旋及 c一末 端与 GLP．1受体的结合力分别占总Exendin一4结合 力的5％、79％和 16％。N．末端为活性部位，负责与受 体结合，激活促胰岛素分泌信号转导[1]。 与 GLP一1的结合位点和活性位点均在 N一末端 区域不同，Exendin．4的活性位点和结合位点分别位 于N．末端与c．末端。Montrose—Rafizaden等[ 发现， 切除 N一末端 2个氨基酸后 ，Exendin．4(3～39)与受 体亲和力不变，但却变为GLP．1R抑制剂，GLP，1(9～ 36)与受体的亲和力、活性均降低 1o0倍；切除N一末 端 8个氨基酸后 ，Exendin一4(9～39)变为与受体亲 和力很高的受体抑制剂，GLP一1(15～36)与受体亲和 力降低500倍，几乎无活性。 Exendin．4与 GLP．1(7～36)多肽相比在氨基酸 组成上有很多优势：①DPP1V对 Exendin．4在 N．末 端 His7-Gly。酶解作用弱 ；②C一末端多了 9个氨基 酸(PSSGAPPPS)，形成不规律的亲水结构，不易被肽 内切酶降解 ，并可与 GLP．1R的 N．末端结合，增强受 体亲和力；@GLP．1多肽的Gly挖不参与组成仅一螺旋， 破坏了其空间结构稳定性，而 Exendin．4可以形成稳 定 一螺旋 ，同时与其 c．末端螺旋“帽”疏水相互作 用，使其螺旋结构具有折叠协同性和热稳定性。 美国礼来公司的 exenatide(商品名 Byetta)是依 据 Exendin一4的天然序列化学合成的药物，其在体内 的稳定性远高于GLP．1，体内半衰期达 2～4 h。 2005年获得 FDA批准上市，用于 2型糖尿病的治 疗，每次注射5～10 g，每日2次。 4． 天然蛋白序列的改构 为了延长药物体内半衰期 ，研究者进行了多种 多肽改造及修饰。 4．1改变肽链中某些位点：很多研究者在天然 GLP— l及Exendin一4的基础上，通过改变多肽序列得到对 酶有抗性的蛋白，以增加稳定性，延长半衰期。 GLP．1 N．末端的His 对于受体亲和及活性具有 重要作用，切除 N．末端 HisT-Ala 的 GLP．1(9～37) 受体亲和力降至原序列的 l％。另外 ，在 GI P一1 N一末 端的 His 之外添加氨基酸 ，如 GLP一1(1～37)，无促 胰岛素分泌作用。His 的咪唑环对 GI P．1的功能起 关键作用。 针对 DPP1V能快速降解 GLP一1 N一末端的 His ． Ala ，研究者尝试用 Gly 、Aib 、Ser 、Thr 、D．Ala。替换 L—Ala ，结果半衰期虽延长，但促胰岛素分泌和降血 糖作用均比GLP一1低。 瑞士 Roche和英国Ipsen公司共同开发的taspo glutide用 OL一氨基异丁酸替换 hGLP．1(7—36)NH2 的Alas和 Gly ，其对 DPP IV酶降解的抗性大大提高， 活性保持不变，作用持 。 Ⅱ期临床试验结果显 示，2型糖尿病患者在保持服用甲福明二甲双胍的 基础上，开始每周注射 1次或每2周注射 1次5、10、 20 mg的taspoglutide，4周后 ，HbA1C降低了(1．2± 0．1)％，体重降低了(2．8±0．3)kg，且能够很好地 调节空腹血糖和餐后血糖 [ 。 4．2增补片段：氨基酸替换的同时，在GLP一1的c． 末端加上 Exendin．4(31～39)的肽链 ，可以恢复到 GLP一1的活性水平，同时可抵抗 DPPIV的降解。 法国 Aventis公司和丹麦 Zealand公司研发的 ZP10A是在 Exendin一4的 C一末端增加 16个 Lys，其 与受体的亲和力是GLP一1的4倍[ 。lI期临床试验 结果明，每天注射 1次，控制 HbAlc的效果即可 达到预期，目前正在进行Ⅲ期临床试验。 4．3同源物的片段替换：另外一种改构思路是利用 具有类似结构功能相反的Glucagon／GLP．1两个多 肽的肽段，通过一系列片段替换而形成的新肽段，来 寻找促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌的肽段。 Glucagon(29 aa)和 GLP一1(30 aa)均为胰高血糖素原 后在不同组织的加T产物 ，同属于胰高血糖素 分泌素家族。两者特异性结合同属于 G蛋白偶联受 体家族的不同受体，但两者在维持血糖稳定方面却 发挥不同的作用。Glucagon促进血糖升高；而GLP．1 促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，降低血糖。 通过系列替换来寻找两者的受体结合专一性位点发 现，[Va127,L S28，Gly29,Arg 。]Glucagon与Glucagon受体 及 GLP．1受体均有很高的亲和力，为开发能与多个 受体结合的多肽提供了思路。 在此基础上 ，Bayer Healthcare研发了 GLP一1／ Glucagon 杂合体 ]，名称缩写为 PEG．DAPD(PEG— dua1．acting peptide for diabetes)，它既是 GLP-1受体激 动剂，促进胰岛素分泌；也是 Glucagon受体抑制剂， 抑制胰高血糖素发挥作用。将DAPD多肽PEG化， 可延长半衰期，减轻 GLP。l药物的胃肠道副作用。 5． 延长体内半衰期的修饰物 5．1 PEG修饰：对 GLP一1或 Exendin．4进行 PEG修 · 868· 中国生物制品学杂志 2011年7月第 24卷笫 7期 Chin l Binh)gicals July 201 I，Viii．24 No．7 饰的研究报道较多。韩国的Youn等[_7 分别采用 N 末端氨基、Lys26,Lys 3种修饰位点和 2 K、5 K、l0 K 3种大小的mPEG．SPA修饰类型，通过比较代谢稳 定性、细胞表面受体亲和力、离体胰岛促胰岛素分泌 活性 、ICR鼠体内的半衰期 ，结果显示 ，Lys34_PEG． 一 GLP．1的效果最好。 美国礼来公司和Amylin公司开发的 GLP1．PEG (LY．2428757)，1周使用 1次，已进入Ⅱ期临床试验。 将一个或多个聚乙二醇聚合物与Exendin．4赖氨酸 上的s．氨基相连，用于延长半衰期，降低免疫原性， 抵抗蛋白酶水解，s~Dil生物利用度，降低毒性并提高 稳定性。上海华谊生物技术有限公司也进行了带有 聚乙二醇基团的Exendin或其类似物的研究 。 5．2 以体外或体内白蛋白为载体：美国HGS公司与 GSK开发的 Albugon是人 GLP．1与血清白蛋白的融 合蛋白，能够有效调节能量代谢和血糖水平，但与 Exendin一4比较，Albugon与受体结合的能力很弱， Exendin。4的 EC50为 0．2 nmol／L，而 Albugon为 20 nmol／L[ 。临床试验表明，Albugon在人体内的 t。 达 6～8 d，达峰时间 3～4 d。目前正处于Ⅲ期临 床试验，1周用药 1次。 加拿大 ConjuChem公司采用其 PC—DACTM平台 开发了 CJC．1 131一PC和 CJC．1 134一PC。两者是分别 将GLP．1和Exendin一4的改构体与人血白蛋白体外 共价结合而得到。其中 CJC 1 131．PC是将 GLP．1改 构体 Lys侧链的 s—NH 上连接马来酰亚胺衍生物。 Ⅱ期临床试验结果表明，两者在降低空腹血糖水平、 糖化血红蛋白水平和减轻体重方面均有较好的效 果 ⋯ 。 诺和诺德公司开发的 victoza(1iraglutide)是天 然的人 GLP．1分子第 34位的赖氨酸被精氨酸取代 ， 并在第 26位赖氨酸上，增加了一个由谷氨酸介导的 16碳脂肪酸侧链f ]。与体内白蛋白结合后，其半衰 期长达 13 h，每 日注射 1次，0．6～1．8 mg／次 ，2010 年 1月获得 FDA批准上市。 5．3其他修饰：Fc融合也是使蛋白质长效的重要途 径，University of Toronto的Qinghua Wang教授将有活 性的GLP．1序列与鼠IgG1重链的Fc段融合后，得 到的GLP．1／Fc能有效增强鼠胰岛素瘤细胞系INS一1 的cAMP信号l1 。Eli Lilly的GLP-1一Fc(LY2199265) 是有活性的GLP．1 C．末端与IgG4 Fc的N一末端融 合，目前正处于Ⅲ期临床试验阶段[1 。韩国的LG Life Science公司 ]也有类似研究。 韩国研究者 Jin等 ]对 Exendin一4的Lys侧链 进行生物素共价修饰，得到的DB．Exendin．4的受体 亲和力 、活性均与 Exendin．4相当，小鼠口服试验证 明，其体内稳定性大大提高，是 Exendin．4的9倍。 修饰物可以借助肠道内的 SMVT载体进行主动转 运，因此该研究推动了口服 GI P—l类似物的开发。 5．4其他新制剂：有公司通过改变制剂形式来改变 给药途径或延长半衰期。2010年 1月，诺和诺德公 司从 Emisphere公司购得专利技术 Eligen ，肝始 了新药长效 口服 GLP 1类似物(NN9924)的 I期临 床研究。 美圉礼来公司的Exenatide LAR是Exen(1in一4的 缓释制剂，每周只需注射 1次，大大减轻 r Exendin． 4每天需要注射 2次的痛苦 ，目前正在接受 FDA审 批 [18 6． 展望 上市 5年的 Byetta和上市小久的 liraglutide均 有良好的临床效果，其在患者体内作用于由胃、肠 、 胰岛和脑共同组成的协同血糖调节网络，既能促进 葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制葡萄糖依赖的胰高 血糖素的分泌 ，改善胰岛 8细胞功能，既能促进其 修复和再生，也能减慢 胃排空，减少食物摄取 ，从而 减轻体重。传统口服降糖药的作用机理多是增强胰 岛素敏感性或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法 解决 B细胞凋亡的难。因此 GLP一1及其类似物为 2型糖尿病患者提供了新的希望。 目前 ，Byetta多用于口服降糖药不能取得 良好 效果且未使用胰岛素的患者，可与口服降糖药联合 使用，也可单独使用。随着长效新药的上市，可以减 轻注射痛苦的降糖药必将在2型糖尿病治疗的市场 中占据更大的比例。 综上所述，多家公司研发的GLP-1和Exendin-4的 突变体、修饰物或新剂型均处于临床研究后期，不久 会有更多半衰期长、血糖控制效果好的GLP-1类似物 上市，为 2型糖尿病患者的疾病治疗提供新的选择。 参考文献 l 1 j A1一Sabah S，Donnelly D．A model for receptol—peptide binding al the glucagon—like peptide一1(GI P一1)reccpt1)r through tile analysis of truncated ligands an(1 receptors lJ】Br J PharrnacoI，2003，140 (2)：339—346． 1 2 J Montrose—Rafizadeh C，Yang H，Rodgers BI)，el ．High potcllcy antagonists of the pancreatic glucaglm—like peptide一1 recept(1r J j． J Biol Chem，1997．272(34)：21201—21206． 【3 J Sebokova E，Christ AD，Wang H，et ． raspoglutide，aTl anahlg of human glucagon—-like peptide—-1 with enhanced stability and i rl vivo potency lJ J．Endocrinology，2010，151【6)：2474—2482． (下转第 872页)