实验二__细菌的革兰氏染色与芽孢染色

实验二 细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1. 菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2. 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。大肠杆菌是的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。 革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 四、操作步骤 基本流程：涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。 1. 制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 常规涂片法 ： 取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。   “三区”涂片法： 在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 2. 染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。 （2）媒染：，用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 （3）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。     革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 （4）复染：滴加番红液，染色2min，水洗。在染色的过程中，不可使染液干涸。 3.镜检：用滤纸吸干，油镜镜检（先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察），判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 注意事项 （1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色而造成假阴性。 （2）图片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 （3）脱色是革兰氏是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。 实验结束后处理 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。 六、实验 1. 列表填出油镜下观察到的两种菌的菌体颜色、细菌形态、染色结果（G +、G-） 2. 在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在每步染色后菌体所呈的颜色。 步骤 所用染料 菌体所呈颜色 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 1 2 3 4 3. 革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 4. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确、结果可靠？ 细菌的芽孢染色 一、目的要求 学习芽孢染色的原理和方法 二、实验材料 1. 菌种：枯草芽孢杆菌，肉汁斜面培养24h； 2. 染料：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液 3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。由于芽孢壁厚、透性差、不易着色。当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色透明。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用番红复染，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 四、操作步骤 1.制片 按常规方法涂片、干燥及固定 2.加热染色 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min，加热时注意补充染色液，切勿让图片干涸。 3.脱色 带玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色为止。 4. 复染 用0.5%番红水溶液复染2min。 5. 水洗 用缓流自来水冲洗至流出水为无色为止。 6. 镜检 将载玻片晾干后用油镜镜检。 注意事项： （1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂。 （2）加热染色时必须维持在染液微冒蒸气的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。 （3）脱色必须等待玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。 五、实验报告 绘出油镜下观察到的具体图像。