黑木耳黑色素鉴定及提取工艺优化

87※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16 黑木耳黑色素鉴定及提取工艺优化 李 琦，侯丽华，刘 鑫，李伟林，马爱民 * (华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070) 摘 要：对黑木耳黑色素进行鉴定，并对提取工艺进行优化。黑木耳黑色素性质研究中发现色素溶于碱性溶液， 不溶于水、酸及有机溶剂。运用紫外 -可见光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描初步研究黑木耳黑色素的基本结构性 质，鉴定表明黑木耳黑色素与酪氨酸合成黑色素相一致，为 3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)类黑色素。提取工艺优化 实验发现，采用超声波辅助提取并通过单因素及正交试验优化提取条件，得到最佳提取条件为提取时间 80min、超 声功率 80W、氢氧化钠溶液浓度 1.25mol/L、料液比(g/mL)1:30，在优化提取条件下粗品得率达到 9.107%，与常规 方法相比较，超声波辅助提取具有萃取工艺简单、提取时间短、提取效果较好等优点。 关键词：黑木耳；黑色素；鉴定；提取工艺 Identification and Extraction Technology of Melanin from Auricularia auricula LI Qi，HOU Li-hua，LIU Xin，LI Wei-lin，MA Ai-min* (College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China) Abstract ：Auricularia auricula melanin was measured for its solubility and UV and infrared spectral characteristics. Meanwhile, optimization of its extraction technology was conducted. The melanin was soluble in alkaline solution, but insoluble in water, acid solution and organic solvents. The UV and infrared spectral characterization indicated that the melanin had a structure identical to that of synthetic tyrosine melanin, and belonged to the group of 3,4-dihydroxy phenylalanine (DOPA) melanins. The one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the ultrasonic-assisted extraction technology of Auricularia auricula melanin, and extraction duration of 80 min, ultrasonic power of 80 W, NaOH concentration of 1.25 mol/L, material-to-liquid ratio of 1:30 were found optimum, and the crude extract yield reached up to 9.107% under these optimum conditions. Ultrasonic-assisted extraction has some advantages over conventional methods, such as simplicity, rapidity, better effectiveness, and so on. Key words：Auricularia auricula；melanin；identification；extraction technology 中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)16-0087-06 收稿日期：2009-12-25 作者简介：李琦(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学与生物技术。E-mail：tomisqq@gmail.com *通信作者：马爱民(1965—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：aiminma@mail.hzau.edu.cn 黑色素(melanin)是由吲哚或酚类化合物氧化聚合而 成的非均质高分子化合物，一般呈黑色、褐色或者棕 色，广泛存在于动植物和微生物中[ 1 -2 ]。它是一种结构 稳定的复杂生物大分子，难溶于水、酸及有机溶剂。 虽然黑色素在生物体的生长发育过程中并不是必需的， 但具有广泛的生物学功能，如降低生物体受紫外线辐 射、溶菌酶酶解、高温、氧化及重金属毒害作用所带 来的伤害，提高生物体在某些恶劣环境下的生存力，并 且它是目前所知的唯一能保护生物体免受辐射伤害的天 然内源生物聚合体[ 1 -4 ]。另外，某些微生物在各自的宿 主上产黑色素的能力还与毒力和致病力相关[5-6]。 目前，黑色食品如黑芝麻、黑米、黑豆、黑玉 米等含有天然黑色素等而具有滋补、养生、抗氧化和 抗衰老等方面的功效，已引起人们的浓厚兴趣[7]，但国 内外对食用菌所产生的黑色素的研究鲜见报道[3]。黑木 耳(Auricularia auricula)又名云耳，是我国珍贵的药食 两用菌。黑木耳营养丰富，含有人体不可缺少的蛋白 质、脂肪、碳水化合物，钙、铁，胡萝卜素、V B 1、 V B 2 等，其具有益气强身、补气血、润肺、止血、止 痛、通便等功效。可防治动脉硬化、高血压和眼底出 血，增强抵抗力，延年益寿[ 8 -9 ]。开展黑木耳色素的提 取纯化及其性质研究，无论是黑木耳的高附加值综合利 用和深加工开发，还是对黑色素的深入研究都具有十分 重要的实用价值和理论意义。张莲姬等[10]曾报道用盐酸 提取黑木耳黑色素，本实验对黑木耳黑色素的鉴定及提 取工艺优化作进一步研究。 2010, Vol. 31, No. 16 食品科学 ※工艺技术88 1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 黑木耳单片 5号子实体 华中农业大学实验菌种中 心；黑色素标样(酪氨酸氧化合成) 美国 Sigma公司； 其他试剂均为国产分析纯。 S-250D超声波细胞破碎仪 美国 Branson公司； J-E高速冷冻离心机 美国Beckman公司；Alphal-2真 空冷冻干燥机 德国 Eppendorf公司；UV-1700紫外 -可 见分光光度计 日本 Shimadzu公司；Nexus 470傅里叶 变换红外光谱仪 美国Nicolet公司。 1.2 方法 1.2.1 黑木耳原料预处理 黑木耳原料为干制品，首先将黑木耳捣碎，用粉 碎机进行充分碾磨，然后将磨好的黑木耳粉末过 55目标 准筛，收集黑木耳干粉并置于密封容器内，于干燥处 保存备用。 1.2.2 黑木耳黑色素的粗品提取 按参考文献[8 ]的提取方法对黑木耳黑色素进行提 取，提取得到的粗品黑色素经真空冷冻干燥后置于－20℃ 冰箱保存备用。 1.2.3 黑木耳黑色素的纯化 按参考文献[4]的提纯方法对黑色素粗品进行纯化， 纯化后的黑色素经真空冷冻干燥后置于－ 20℃冰箱保存 备用。 1.2.4 黑木耳黑色素的鉴定 1.2.4.1 溶解性实验 分别称取 0.0100g纯化黑木耳黑色素置于试管中， 在室温条件下(20℃)分别加入蒸馏水、1mol/L氢氧化钠 溶液、1mol/L盐酸、无水乙醇、75% 乙醇、正丙醇、 正丁醇、柠檬酸、氯仿各 10mL搅拌混匀，静置 30min， 观察其在溶液中的溶解性和溶液的颜色。 1.2.4.2 紫外 -可见光谱扫描 称取少量纯化黑木耳黑色素溶于 pH8的柠檬酸磷酸 氢二钠缓冲液中，40℃温浴 1h使色素溶解，4000r/min 离心 1min，取上清液在波长 200～600nm进行紫外 -可见 光谱扫描。 1.2.4.3 傅里叶红外变换光谱扫描 采用溴化钾压片法，按 1:200的比例加入纯化黑木 耳黑色素和溴化钾，研成细粉进行压片。在 5 0 0～ 4000cm-1范围内测定其红外吸收光谱。 1.2.5 黑色素的提取工艺优化 1.2.5.1 黑色素的不同的提取工艺 在参考文献[8 ]的方法上对提取工艺进行优化。对 黑木耳不同的前处理：1) 60℃水浴 40min；2) 高温高压 处理(118℃，40min)；3)原料用液氮研磨处理；4)超声 波辅助浸提(超声功率 60W，40min)；5) 静置 40min(对 照 ) 。 3g黑木耳(按料液比 1:30g/mL加入 1mol/L氢氧化钠 溶液)→不同的提取工艺处理→离心(10000r/min，15min) 取上清液→将上清液调 pH1.5，并 80℃水浴 12h，酸沉 →离心(10000r/min，15min)→将沉淀用去离子水洗4次→ 冷冻干燥→黑色素粗品→纯化→黑色素纯品。 1.2.5.2 单因素试验 根据不同提取工艺所得到的黑色素粗品的得率结果 进行单因素试验。参照文献[11-12]方法计算黑色素粗品 的得率和色价，并绘制得率D和色价 E随提取条件变化 的曲线图。 　　 黑色素粗品质量 黑木耳黑色素得率(D)/% = ————————×100 (1) 　　 黑木耳干粉质量 黑色素色价(E)测定：精确称取提取的黑木耳黑色 素 0.0100g，再加入 5mL pH8的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲 液，40℃水浴 1h使色素溶解，离心1min，取上清液 1mL 加入4mL缓冲液，在最大吸收波长 207nm处测定其吸光度。 　　 A× r E1% = ———— (2) 　　 m 式中：A为吸光度；m 为样品质量 /g；r为测定吸 光度时所吸取样品的稀释倍数。 1.2.5.3 正交试验 为系统考查提取工艺参数对萃取结果的影响，根据 单因素试验结果选取不同因素进行正交试验确定最佳提取 工艺，并以测定的黑色素得率×色价为最终指标[11]。 1.2.6 数据统计分析 所有实验数据重复测定 3次，所得结果为平均值± 差(x ± s，n=3)，利用 SPSS软件对数据进行统计 分析。 2 结果与分析 2.1 黑木耳黑色素的溶解性 如表 1所示，黑木耳黑色素在不同溶剂中的溶解性 不同。表明黑木耳黑色素与酪氨酸合成黑色素不溶于 水、酸溶液、盐溶液和正丙醇、正丁醇、氯仿等有 机溶剂中，这与文献[3-6]的黑色素溶解性质相符。黑木 耳黑色素与酪氨酸合成黑色素溶解性质相同，在溶解液 中颜色略有不同，黑木耳黑色素溶液为棕黑，而酪氨 酸合成黑色素为黑色。 1cm 89※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16 2.2 黑木耳黑色素的紫外图谱特征 溶解实验 溶剂 合成黑色素 黑木耳黑色素 水 蒸馏水 － － 无水乙醇 + 淡黑色 + 棕色 75%乙醇 + 淡黑色 + 棕色 有机溶剂 正丙醇 － － 正丁醇 － － 氯仿 － － 酸 1mol/L盐酸溶液 － － 3mol/L盐酸溶液 － － 碱 1mol/L氢氧化钠溶液 ++ 棕黑色 ++ 棕黑色 盐 pH8柠檬酸氢二钠缓冲液 ++ 黑色 ++ 棕黑色 1mol/L氯化钠溶液 － － 表 1 酪氨酸合成黑色素和黑木耳纯化黑色素溶解性 Table 1 Solubility of synthetic tyrosine melanin and purified Auricularia auricula melanin 注：+ 表示微溶，+ + 表示溶解，－表示不溶。 图 1 酪氨酸合成黑色素和 (A)黑木耳纯化黑色素 (B)的紫外扫描图 谱 Fig.1 UV absorption spectra: A. synthetic tyrosine melanin; and B. purified Auricularia auricula melanin 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 A 吸 光 度 波长 /nm 200 300 400 500 600 B 从图 1紫外扫描图谱可知，酪氨酸合成黑色素与黑 木耳黑色素的最大吸收波长分别在 210nm和 207nm，与 报道的不同来源的黑色素的最大吸收波长在 210nm左右 一致[13]。在扫描范围(200～600nm)内呈现了一致的吸收 变化规律，在紫外区具有强吸收，从最大吸收峰位置 开始，随波长的逐渐增大，吸光度呈现下降的变化趋 势，是典型的黑色素紫外吸收图像[ 3 ]。 图 2 酪氨酸合成黑色素 (A)和黑木耳纯化黑色素 (B)的吸光度的 对数对波长作图 Fig.2 Linear plots of log absorbance versus wavelength: A. synthetic tyrosine melanin; and B. purified Auricularia auricula melanin 1.0 0 － 1.0 － 2.0 A 吸 光 度 的 对 数 波长 /nm 200 300 400 500 600 B 由图 2可知，酪氨酸合成黑色素与黑木耳黑色素的 吸光度的对数对波长作图斜率分别为－ 0 . 0 0 2 1 2 和－ 0.00268。报道的不同来源黑色素也都具有这种负 斜率的特征对数吸光图[3,5-7]。 2.3 黑木耳黑色素的红外图谱特征 图 3 酪氨酸合成黑色素 (A)、黑木耳纯化黑色素 (B)和粗品黑色素 (C)傅里叶红外变换扫描图谱 Fig.3 FT-IR spectra: A. synthetic tyrosine melanin; B. purified Auricularia auricula melanin; and C. crude melanin extract from Auricularia auricula CC A80 70 60 50 40 30 3387 透 射 率 /% 波数 /cm－ 1 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 29 25 .5 28 50 .9 17 17 .4 13 86 .8 16 21 .1 70 0 B C 从图 3 可见，黑色素是结构复杂的生物大分子， 其红外光谱是一系列宽而强的吸收峰，每一宽峰都是 由多种官能团震动形成的。3 种黑色素的基本波形相 似，可以推断出它们具有类似的官能团：1 )在波数 3387cm-1处都有较宽而强的吸收峰，说明存在－ OH和 － NH结构，吸收峰宽而强可能由于－OH和－ NH之 间的氢键连接[3]；1717.4cm-1处的吸收峰是自由羧基基团 －COOH引起的振动；1621.1cm-1处吸收峰是C=O的非 对称振动及N－H变角振动形成，说明可能存在－COOH； 1386.8cm-1处吸收峰是C－CH3的弯曲和骨架振动吸收参 与形成；600～700cm-1范围的吸收带很弱，表明苯环被 取代，形成共轭体系。2)粗品黑色素在波数 2925.5cm-1与 2850.9cm-1处的吸收峰是由于C－H伸缩振动形成，即为 － CH和－ CH2的共振吸收峰。3)在黑木耳纯化黑色素 与粗品黑色素的对比中发现，粗品黑色素纯化后 2925.5cm-1 与 2850.9cm-1处的吸收峰明显减弱，可能是由于纯化过 程中反复碱溶酸沉、有机溶剂处理去除了粗品黑色素上 连接的蛋白，多糖类物质[8]。4)根据红外谱图的类似性 可初步将黑木耳黑色素归为 3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA) 类黑色素[ 1 , 3]。 2.4 黑木耳黑色素的不同提取工艺的粗品得率 对 5种不同的提取工艺进行比较，结果见图 4， 采用超声波辅助的提取方法较其他方法所得的粗品黑 色素得率更高 ( 6 . 3 3 2 % )，为相对最佳的提取方法。 因此本实验采用超声波辅助提取作为黑木耳黑色素提 取方法。 2010, Vol. 31, No. 16 食品科学 ※工艺技术90 图 4 粗品黑木耳黑色素在不同提取工艺条件下的得率 Fig.4 Comparison among the extraction yields of Auricularia auricula melanin using different extraction technologies 7 6 5 4 3 2 1 0 2.256得 率 /% 提取工艺 60℃水浴 高温高压 液氮研磨 超声处理 对照 3.277 3.072 6.332 0.341 2.5 单因素试验 2.5.1 提取溶剂的选择 按照超声波辅助提取工艺，分别用浓度为 1mol/L氢 氧化钠溶液、1mol/L盐酸、95%乙醇溶液和水按料液 比 1:30(g/mL)进行提取。 从表 2可知，用 1mol/L氢氧化钠溶液作为提取溶剂 的效果好于其他溶剂的提取效果，说明黑色素是碱溶 的，碱溶液对黑色素选择性高，溶解力强，提取率高。 95%乙醇溶液也有一定的提取效果，可能是由于粗品黑 色素上结合的蛋白、碳水化合物以及脂类物质而造成的 一定的醇溶[1]。而黑色素不溶于 1mol/L盐酸溶液。 2.5.2 提取剂浓度的确定 按照超声波辅助提取工艺，分别用 0 . 75、1 .00、 1.25、1.50、1.75、2.00mol/L氢氧化钠溶液提取。 色价增加。当浓度超过 1.50mol/L时，一些碱溶性杂质 的溶出量随之增加，这些杂质成分与黑木耳黑色素竞争 溶出，导致黑木耳色素溶解度降低，粗品的得率和色 价有所下降。综合考虑两项指标，氢氧化钠溶液浓度 为 1.50mol/L时两项指标都达到较好值。 2.5.3 超声波提取功率的选择 按照超声波辅助提取工艺，分别在超声波功率为 30、40、50、60、70、80W 超声波场中处理 40min。 如图 6所示，随着超声波提取功率的增加，细胞破 碎的强度也相应的增大，加速提取成分的扩散释放[14-15]， 导致黑色素快速溶出，使得得率和色价不断上升。 2.5.4 超声波提取时间的选择 按照超声波辅助提取工艺，分别在 60W 超声波场 中处理 2 0、4 0、60、8 0、1 0 0m i n。 从图 7可以看出，超声作用 60min左右时，得率 和色价均较高。随着时间的延长，得率开始有所下降， 色价变化比较明显。这可能是因为超声引起的机械剪切 作用导致提取到溶液中的黑色素结构变化而损失[14- 15]。 超声波在短时间内可以充分提取黑木耳黑色素，从而体 现了超声波辅助提取省时的优点。 2.5.5 料液比的选择 按照超声波辅助浸提工艺，分别按料液比(g/mL)为 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50加入浓度为 1mol/L的氢 如图 5所示，提取溶剂氢氧化钠溶液浓度在 0.75～ 1.50mol/L时，随着浓度的上升，粗品黑色素的得率和 溶剂 项目 1mol/L氢氧化钠溶液 1mol/L 盐酸溶液 95%乙醇 水 得率 /% 6.332± 0.094 0.386± 0.201 2.563± 0.042 1.217± 0.066 色价 472± 3.5 128± 1.8 263± 1.6 233± 4.4 表 2 溶剂对黑木耳黑色素提取率的影响 Table 2 Effect of extraction solvent type on the extraction yield of Auricularia auricula melanin 图 7 提取时间对黑木耳黑色素提取效果的影响 　¡¡Fig.7 Effect of extraction duration on the extraction yield of Auricularia auricula melanin 9 8 7 6 5 4 3 得率得 率 /% 提取时间 /min 20 40 60 80 100 色价 510 500 490 480 470 460 450 440 430 420 色 价 图 6 超声功率对黑木耳黑色素提取效果的影响 Fig. 6 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of Auricularia auricula melanin 9 8 7 6 5 4 3 得率 得 率 /% 超声功率 /W 30 40 50 60 70 80 色价 520 510 500 490 480 470 460 450 色 价 图 5 氢氧化钠溶液浓度对黑木耳黑色素提取效果的影响 Fig.5 Effect of NaOH concentration on the extraction yield of Auricularia auricula melanin 氢氧化钠溶液浓度 /(mol/L) 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 480 470 460 450 440 430 420 色 价 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 得率得 率 /% 色价 91※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16 氧化钠溶液来进行提取。 料液比 1:10时，所得溶液为糊状，说明料液比过 低，不利于实验操作。从图 8可以看出，随着提取溶剂 使用量增大，得率和色价也随之升高，料液比在 1:30～ 1:50时，得率变化不明显，但明显高于 1:20，这是因 为提取溶剂太少时，在短时间内黑色素的溶解就达到平 衡，不有利于黑色素的进一步溶出[ 1 1 ]。色价在料液比 1:40时达到最大，后因杂质不断增加而减小。料液比过 大，也不利于下一步的黑色素酸沉，造成不必要的浪费。 综合以上因素考虑，料液比 1:30为相对最佳提取条件。 2.5.6 酸沉时间的确定 按照超声波辅助浸提工艺，分别在 80℃下酸沉 4、 6、8、1 0、1 2、1 4 h 使色素形成絮状沉淀。 从图 9可知，酸沉过程中黑色素会形成棕褐色的絮 状沉淀，其得率和色价也随着酸沉时间的延长而不断上 升。酸沉时间达到 10h时黑色素的得率也达到最大值， 继续延长酸沉的时间得率增加量趋于平衡。因此，从 酸沉效果、缩短生产周期、节约能源等方面综合考虑， 选定酸沉时间为 10h。 2.6 正交试验 综合以上单因素试验结果，选择超声波提取时间、 超声波功率、提取剂浓度、料液比 4 个因素，设计四 因素三水平的试验，以粗品黑色素得率和色价为指 标，确定黑木耳黑色素超声波辅助提取的最佳工艺 条件。 试验号 A提取 B超声 C提取剂浓 D料液比 得率 /% 色价 得率× 时间 /min 功率 /W 度 /(mol/L) (g/mL) 色价 1 1(40) 1(40) 1(1) 1(1:30) 3.197 454 14.514 2 1 2(60) 2(1.25) 2(1:40) 6.432 480 30.874 3 1 3(80) 3(1.5) 3(1:50) 8.003 520 41.616 4 2(60) 1 2 3 4.463 444 19.816 5 2 2 3 1 6.966 484 33.715 6 2 3 1 2 8.695 500 43.475 7 3(80) 1 3 2 4.287 466 19.977 8 3 2 1 3 6.288 506 31.817 9 3 3 2 1 9.107 514 46.810 k1 29.001 18.102 29.935 31.680 k2 32.335 32.135 32.500 31.442 k3 32.868 43.967 31.769 31.083 R 3.867 25.865 2.565 0.597 表 3 正交试验分析 Table 3 Layout of 9-run orthogonal array design and experimental results 由表 3 分析可知：根据极差 R 值的大小，进行因 素影响的主次排序 B(超声功率)＞ A(提取时间)＞C(提取 剂浓度)＞ D(料液比)，说明超声功率对黑色素得率的影 响最大，为主要影响因素。 4 种因素最佳组合为 A3B3C2D1，即提取时间 8 0 m i n，超声功率 8 0 W，提 取剂浓度 1.25mol/L，料液比 1:30(g/mL)。最佳工艺条 件下黑色素得率为 9.107%，色价为 514。 3 结 论 对黑木耳纯化黑色素进行溶解性实验，及紫外、 红外图谱扫描，初步鉴定了黑木耳黑色素是DOPA途径 合成的色素。在黑木耳黑色素的提取工艺上进行了优 化，得出超声波辅助提取工艺与常规方法相比较具有提 取工艺简单、提取时间短、提取效果较好等优点，可 以有效提高生产效率。并在单因素试验的基础上，通 过正交试验极差分析，得到了黑木耳黑色素超声辅助提 取的最佳工艺条件，为黑木耳黑色素进一步深入研究提 供一定参考。 参 考 文 献 ： [1] FOGARTY R V, TOBIN J M. 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