超抗原SEB或SEC对T细胞分泌IL-2和杀伤HcaF细胞的影响

广东医学 2005年9月 第26卷第9期 超抗原 SEB或 SEC对 T细胞分泌 IL一2和 杀伤 HcaF细胞的影 响 * 李 明 邢飞跃 △ 李 岩 四川大学华西医学中心感染免疫研究室(成都 610041)；。暨南大学教育部组织移植与免疫重点实验室(广州 510632) · 12O1 · 【摘要】 目的 探讨超抗原金黄色葡萄球茵肠毒素B(sEB)和金黄色葡萄球茵肠毒素C(SEC)在体外刺激T 细胞分泌 IL一2和杀伤肿瘤细胞的作用。 不同浓度 SEB或 SEC在体外刺激T细胞，采用流式细胞术检测 T 细胞受刺激后不同时间分泌 IL一2的水平，用 MTr法检测活化的T细胞及其上清对肝细胞癌 HcaF细胞的杀伤效 应。结果 sEB或 SEC能刺激 T细胞大量分泌 IL一2，刺激剂量以 100 pg／L时活化 T细胞的能力最强，最佳刺激 时间为3—4 d。SEB或SEC活化的 T细胞对肝细胞癌 F细胞具有很强的杀伤效应，两者对T细胞分泌 IL一2和 杀伤 HcaF细胞的作用无明显差异。结论 SEB或 SEE具有很强的刺激 T细胞分泌和增强T细胞杀伤肿瘤细胞的 能力，为其应用于肿瘤免疫治疗奠定了一定基础。 【关键词】 金黄色葡萄球茵肠毒素 白介素 一2 T细胞 细胞毒活性 HcaF 超抗原(sag)是一组细菌或病毒编码的蛋白质分 子，因其在极低浓度(1～10ng／r~)下就可激 活 2％ ～ 20％的T细胞，产生极强的免疫反应而得名⋯。T细胞 对 SAg的识别仅涉及特异性 T细胞受体 B链可变区 (TCR—v13)，所以其活化的 T细胞数 目是普通抗原的 数千倍 J。因此，本实验以外源性超抗原金黄色葡萄 球菌肠毒素 B(staphylococcal enterotoxin B，sEB)或金黄 色葡萄球菌肠毒素 C(staphylococcal Pnterotoxin C，SEC) 刺激 T细胞 ，观察其在体外对 T细胞分泌 Ⅲ一2和杀伤 小鼠肝细胞癌的影响，以期寻找能有效增强 T细胞杀 伤肿瘤细胞的方法，为肿瘤的免疫治疗奠定基础。 1 材料与方法 1．1 动物与细胞株 健康 BALB／C小 鼠，雌性 ，鼠龄 6 ～ 8 w，体重 18～22 g。购于中国人民解放军第三军医 大学实验动物 中心。Hca—F细胞株为小 鼠肝细胞癌 (H一2k一)的高淋巴转移亚系，由遵义医学院附属医 院细胞工程实验室提供，BALB／C小鼠常规传代保种。 1．2 T细胞的制备 无菌取 BALB／C小鼠脾脏，去被 膜置 100目铜 网上，用玻璃研磨器轻柔研磨 几次，经 PBS过网。收集 网下细胞悬液，缓缓加至 2倍体积的 淋巴细胞分 离液 (P=1．080)上，1 500 r／rain离心 15 min，吸取乳白色细胞层 ，D—Hanks液离心洗涤，用 RP一 ／VII一1640完全培养基(含 10％胎牛血清，100 u／n1l青霉 素，100 u／n1l链霉素)重悬细胞，调细胞数至 2 X 10 ／ml。 置 37℃，5％C02下孵育 2 h，收集非黏附细胞，用完全 培养基调细胞浓度 ≤7．5 X 107／1111，加人 37℃ 预温 45 min的尼龙毛柱中，孵育45 min，轻轻冲洗，收集非黏附 *国家自然科学基金资助项 目(编号：30471635)及广东省 自然科学 基金资助项 目(编号：04010451) △通讯作者，电话：020—33010358，E—mail：fyxlj@hotmail．c∞ 细胞 ，即为 T细胞。 1．3 SEB或 SEC对淋巴细胞生成 Ⅲ一2的影响 在 96 孔培养板中每孑L加人 1 X 106／ml淋 巴细胞，分别于第 1，2，3，4，5天加人不同浓度(0，10，100，500，1 000 tg,／L) SEB或 SEC(中国军事医学科学 院微生物流行病研究 所)，设 阴性对照 组。同时 ，每孔加入 2 pmol／L mon． ensin，置 37℃，5％C02、饱 和湿度下培养 5 d，收集细 胞，4％多聚甲醛 0．5 n1l固定 20 min，离心弃上清，每管 用 0．1％Triton X一100 2 ml破膜 10 min，离心洗涤后加 人 F1TC标记 的抗 小鼠 Ⅲ一2单克隆抗体(BD Pharrni． gen)0．25 p-g，室温下避光 30 min，用含 0．1％Triton X一 100的染色缓冲液 2 n1l离心洗涤，弃上清，加 2％多聚 甲醛 0．5 n1l重悬细胞，在流式细胞仪下检测细胞 内 Ⅲ 一 2水平。 1．4 SEB或 SEC激 活的淋 巴细胞 对 HcaF细胞 的杀伤 效应 在 96孑L培养板中加人细胞同 1．3项，同时加人 100tc,／L SEB或 SEC，设阴性对照组 ，同上条件培养 4 d，离心取诱导细胞和上清，分别加人 HcaF细胞，使效 应细胞：靶细胞(E：T)为 10：1和 20：1(细胞上清以获 取上清所用效应细胞数计)，另设单独效应细胞对照 组和单独靶细胞对照组。共同培养 12 h，MTI’法检测 490 nln处 A值，按下列公式计算杀伤率： 细胞杀伤率(％)=( 型垒 嚣 )×100％ 上清杀伤率(％)=(1一实验组 A值／对照组 A值)×100％ 1．5 统计学方法 应用 SPSS 10．0统计软件，采用方 差分析。 2 结果 2．1 不同刺激时 间 SEB或 SEC对 T细胞生成 IL一2的 影响 SEB或 SEC在体外不同时间(1，2，3，4，5 d)刺 激 T细胞，发现 SEB或 sEC明显促进 T细胞分泌 Ⅱ一 维普资讯 http://www.cqvip.com 。 l202 。 2．IL一2的分泌随SEB或 SEC刺激时间的递增而增加 ， 在刺激后第4天达到高峰，第 5天降低；各刺激组与对 照组之间比较具有显著差异；但 SEB和 SEC各刺激组 之间比较无显著差异见 1。 表 1 不同刺激时间SEB或 SEC对T细胞生成 IL一2的影响(n=6) (i±5)％ 不同刺激时间(d) 组剐 — — 与Tc组比较*P