2011;31(3) 南方医科大学学报(J South Med Univ) ·469·
·基础研究·
冻干重组人三突变型HIF.1 a腺病毒生物学效应考察
陶 宇,王月刚,魏 旋,刘 城,陈冬冬,吴平生
南方医科大学南方医院心血管内科,广东 广州 510515
摘要:目的研究冻干对重组人三突变型HIF.1 0【腺病毒(Ad-HIF.1 c【.564/402/803)生物学效应的影响。方法 将前期构建的
Ad.HIF.1ct.564/402/803在HEK293A~W胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,X.Gal染色法测定重组
腺病毒转染效率,在适宜的条件下制成冻干剂。采用MTS试剂盒观察冻干前后Ad—HIF.1a一564/402/803对hMVECs增殖
的影响。分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定重组人三突变
型HIF一1a腺病毒基因;并在4个时间点以Ad—HIF.1a.564/402/803转染hMVECs,提取蛋白进行westernblot检测HIF—la
蛋白的
达。结果 X—gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定。冻干前后重组人三突变型HIF.1旺且泉病毒
对hMVECs增殖影响无显著差异(P>0.05)。经PCR及基因测序鉴定,在四个时间点,腺病毒所携带的目的基因信息无丢
失或突变,HIF.1谣 白表达无差异(Jp>O.05)0结论 冻干能够长期保持重组人三突变型HIF.1 0l腺病毒的高生物活性。
关键词:HIF.1a;重组腺病毒;冷冻干燥;生物学活性
中图分类号:R392 文献标志码:A 文章编号:1 673.4254(20 1 1)03—0469.04
Characterization of the biological activities of lyophilized recombinant adenovirus
expressing the triple mutant of hypoxia inducible factor-la
TAO Yu.WANG Yue-gang,WEIXuan,LIUCheng,CHENDong-don~ WUPing-sheng
Department ofCardiology,Nandang hospital,Southern medical University Guangzhou,510515,China
Abstract:Obiecfive To investigate the influence of lyophilizafion on the biological activity of recombinant
adenovirus.mediated triple mutant of hypoxia inducible factor一1 rAd.HIF一1 一564/402/803).Methods Ad-HIF一1仅一564/
402/803 was amplified from HEK293A cells and purified by ultracentrifugation in CsC1 gradient solutions.The
infection efficiency was observed by X-gal staining.The lyophilized adenovirus was prepared under appropriate
conditions.Before and after lyophilization,the effect of Ad—HIF一1 -564/402/803 on hMVEC proliferation was
evaluated by MTS assay.Th e recombinant adenovirus was confirmed by PCR and DNA sequence analysis before and
1 day,6 months and 12 Ionths after lyophilization,and hMVECs infected with Ad—HIF一1a一564/402/803 at these time
points were examined for HIF.1a protein expression using Western blotting.Results No significant changes were
observed in the effect of lvophilized Ad—HIF一1 -564/402/803 on hMVECs proliferation at the optimal multiplicify of
infection of 100 pfu/cell rP>0.05).At the 4 time points,the recombinant adenovirus HIF一1c【showed no structural
alterations or significant changes in the expression level of HIF一1 protein in the transfected hMVECs fP>0.O5).
Conclusion Lvophilized Ad,HIF一1仅,564/402/803 can maintain its biolo cal activities for a long time.
Kev words:hvpoxia inducible factor一1:recombinant adenovirus;1yophilization;biological activities
近年来在缺血l生心脏病研究中,采用基因治疗促
进血管新生,建立有效的侧支循环,改善缺血心肌的血
供,为弥漫f生冠脉病变以及难以接受血管重建患者提供
了新的治疗途径,且已从基础研究发展到了临床试验。
低氧诱导因子.1(HIF一1)是细胞对缺氧作出适应性反应
的上游关键I生转录因子,可以直接或间接调节多种下游
靶基因如VEGF、FGF、PDGF、ANG.1等的表达,促进内
收稿日期:2010.10.29
基金项目:国家自然科学基金(30370587);国家青年科学基金(308O0462)
SuppoSed by National Natural Science Foundation ofChina(30370587).
作者简介:陶 宇,博士研究生,E.mail:taoyu93@163.com
通讯作者:吴平生 ,教授,主任医师,博士生导师 ,电话:020—61641502,
E—mail:wupingsheng123@yahoo.com
皮细胞增殖和管腔形成⋯。HIF.1a是HIF一1的调节亚
基,决定HIF.1的活性瞳]。在常氧条件下,HIF.1a氧依
赖降解结构域(ODDD)的Pro564、Pro402两个位点在脯
氨酸羟化酶的作用下经泛素途径降解b ,而转录激活域
C.TAD第803位天冬酰胺残基的羟化使HIF.1a的转
录活性受到抑制 ]。因此,HIF—la只有在低氧条件下才
能发挥功能,其蛋白形式在常氧下5 min即发生降解
。 我们前期将Pro564、Pro402和Asn803三个位点
联合突变 ,成 功构建 了重组腺病毒三 突变型
Ad—HIF.1a564/402/803,获得了在常氧条件下可稳定
表达且生物活性高的HIF—la ]。但是,腺病毒不耐热,
一 般保存在含有冷冻保护剂的缓冲液中,并于一80℃储
存。由于运输必须在干冰上进行、储存冷链限制、使用
· 470· 南方医科大学学报(J SouthMedUniv) 第31卷
前需要冻融等因素,限制了其临床应用,而冻干后的药
物可在长期4~8℃条件下保存,为进一步明确其应用前
景,我们通过实验考察冻干对Ad—HIF—l a.564/402/803
生物学效应的影响。
1
和方法
1.1 材料
重组 腺病毒 三 突变型低 氧诱导 因子 .1
(Ad—HIF.1 a.564/402/803)、空腺病毒载体(Ad-Nul1)及B
2半乳糖苷酶([32galactosidase)基因(简称Ad-LacZ),均
由本课
组构建;HEK293A~m胞(Invitrogen公司);人
微血管内皮细胞(hMVECs)由本实验室保存;X—Gal
(Takara);Cell Titer96 Assay MTS/PES试剂盒(Pro.
mega);病毒基因组DNA提取试剂盒d匕京天为时代公
司);HIF—la cDNA诱变区片段引物(广州英骏生物技术
公司);RIPA蛋白裂解液(北京鼎国公司);鼠抗人D—ac.
tin单克隆抗体和羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗
(Santa Cmz公司,北京中杉公司分装),鼠抗人HIF.1 0【
单克隆抗体(Sigma);BCA.100蛋白质定量测定试剂盒
(上海申能博彩公司);ECL发光试剂盒(Pierce)。
1.2方法
1.2.1各组基因腺病毒载体的扩增、纯化、病毒最佳转染
效率测定 在HEK293A细胞中大量扩增腺病毒;氯化
铯密度梯度离心法纯化;Ad—LacZ以不同转染复数
MOI转染hMVECs经x—gal染色测定最佳转染效率。
1.2.2制备冻干重组人三突变型HIF一1o31,~.病毒 将纯化
的重组人三突变型HIF.1源 病毒原液与适宜的冻干保
护剂混合,应用德国christ真空冷冻干燥机,一40 c预冻
3 h;.33℃抽真空干燥12 h;25 oC抽真空干燥6 h制成冻
干剂型。
1.2.3 MTS法检测hMVECs增殖率 以每孔 100 gl,5×
10 接种细胞至96孔培养板,37oC 5%CO:孵箱中培
养。约6 h后观察细胞已贴壁 ,稀释的冻干前
Ad.HIF—l a.564/402/803、冻干 后Ad—HIF—l a.564/402/
803以最佳MOI接种至细胞培养孔中,每组设5个复孔,
对照组不加病毒。转染后第24、48、72、96、120 h应用
MTS/PES试剂盒检测细胞增殖率,紫外分光光度仪以
490 nm波长测定吸光度。
1.2.4重组人三突变型HIF.1嫌 病毒DNA提取和鉴定
分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点采用病
毒基因组提取试剂盒提取病毒DNA,进行PCR及PCR
产物测序鉴定三突变型HIF一1 0【基因。
1.2.5 Western blotting检测HIF—la蛋白的表达 在冻干
前、冻干后ld、6月、l2月四个时间点以Ad-HIF—l cL一564/
402/803转染hMVECs细胞,分别裂解细胞,并提取总
蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取40 g总蛋白进行SDS/
PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、一抗4 qC孵育过夜、二抗室
温孵育lh后ECL发光显影,对照组为Ad—Null。
1.2.6统计学处理 所有数据均采用 土 表示 ,用
SPSS 1 3.0统计软件进行相关分析,P<0.05为差异有统
计学意义。
2结果
2.1最佳转染效率
Ad—LacZ以不同MOI转染hMVECs,X—gal染色显
示MOI为100 pfu/cell时,转染效率趋于稳定。
2.2 冻干对重组人 三 突变型 HIF.1 c【腺病毒促进
hMVECs增殖作用的影响
用 MTS法对比分析了hMVECs生长速率,结果显
示,三组吸光度在前3 d逐渐增高,72 h达最高峰后逐渐
下降,考虑为细胞接触抑制引起。采用重复测量方差分
析 ,冻 干 前 Ad-HIF.1a-564/402/803组 、冻干 后
Ad.HIF.1 a一564/402/803组吸光度显著高于空白对照组
(P<0.01),但冻干前Ad.HIF—la一564/402/803、冻干后
Ad.HIF.1 Cc一564/402/803两组 之间无显 著 差异 (19>
0.05),如表1。提示冻干不会影响重组人三突变型
HIF.1 0l腺病毒促进hMVECs增殖作用。
表1重组腺病毒转染HMVECs后的吸光度值
Table.1 Values of the optical density of HMVECs infected with the recombinant adenovirus(Mean+SD)
与对照组比镜 P<0.01
2-3冻干对重组人三突变型HIF一1徘 病毒所携带目的
基因的影响
4个时间点提取的病毒DNA,以3对引物行PCR鉴
定,均得到380 bp、460 bp、214 bp的目的片段,如图1
(时间点为12 m)。测序后与GenBank的HIF—la cDNA
序列比对显示:402位密码子由CCA诱变为GCA,如图
· 472· 南方医科大学学报(J South Med Univ 1 第3l卷
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(编辑:吴锦雅)